2.1   miR-132-3p在激活的小胶质细胞中的表达   脂多糖刺激BV2细胞系24 h后通过Western blot检测小胶质细胞激活标记物IBA1的表达，结果显示脂多糖促进小胶质细胞的活化(P < 0.05)，见图1A，B。通过RT-qPCR检测miR-132-3p的表达，结果发现激活的小胶质细胞中miR-132-3p的mRNA表达下调(P < 0.05)，见图1C。



2.2   miR-132-3p对小胶质细胞的激活以及疼痛相关蛋白P2X4R表达的影响   将miR-132-3p-mimic或miR-132-3p-inhibitor转染BV2细胞24 h后用脂多糖刺激培养24 h，通过RT-qPCR检测过表达和干扰效果，见图2A；然后，通过Western blot检测小胶质细胞激活标记物IBA1的表达以及在疼痛传递过程中起重要作用的P2X4R的表达，结果显示过表达miR-132-3p抑制小胶质细胞的激活以及P2X4R的表达(P < 0.05)，图2B-D。



2.3   预测及验证miR-132-3p通过与Ptch1的3'-UTR结合靶向调节Ptch1的表达    通过在线数据库starBase预测得到miR-132-3p与Ptch1的3'-UTR相结合，结合位点见图3A。随后通过双荧光素酶报告基因实验进一步验证其靶向调节作用，结果发现miR-132-3p-mimic降低野生型(WT)Ptch1 3'-UTR报告载体的荧光素酶活性，而对突变型(MUT)没有影响，见图3B。转染miR-132-3p-mimic或inhibitor进入BV2细胞24 h后用脂多糖刺激培养24 h，通过Western blot检测Ptch1的表达，结果显示过表达miR-132-3p后抑制了BV2细胞中Ptch1的表达(P < 0.05)，见图3C，D。



2.4   Ptch1对小胶质细胞的激活以及P2X4R表达的影响   将Ptch1表达载体pcDNA-Ptch1或siRNA(si-Ptch1)转染BV2细胞24 h后用脂多糖刺激培养24 h，通过Western blot检测过表达和干扰效率，见图4A，B。然后检测小胶质细胞激活标记物IBA1以及P2X4R的表达，结果显示敲低Ptch1抑制了小胶质细胞的激活以及P2X4R的表达(P < 0.05)，见图4C，D。研究发现Shh信号通路在慢性压迫性神经损伤疼痛模型中被激活，慢性压迫性神经损伤大鼠脊髓腰骶膨大部位Shh信号通路蛋白Shh、Gli表达增加，而Ptch1受Shh信号通路调节且能对Shh信号通路起调控作用[19]。因此，该研究通过Western blot进一步检测Shh信号通路标记蛋白的表达来观察该通路是否在小胶质细胞激活过程中发挥作用，结果显示激活的小胶质细胞中Shh通路标记蛋白表达上调，而敲低Ptch1则抑制该通路的激活(P < 0.05)，见图4E-H。



2.5   过表达Ptch1逆转miR-132-3p-mimic在小胶质细胞中的作用   单独转染miR-132-3p-mimic或者与pcDNA-Ptch1共同转染BV2细胞24 h后用脂多糖刺激培养24 h，通过Western blot检测Ptch1的表达，结果发现pcDNA-Ptch1逆转miR-132-3p-mimic对其表达的影响，见图5A，B。然后通过Western blot检测Shh信号通路标记蛋白、IBA1以及P2X4R的表达，结果表明过表达Ptch1逆转了miR-132-3p-mimic对Shh信号通路以及对小胶质细胞激活的抑制作用，上调P2X4R的表达(P < 0.05)，见图5C-F。



2.6   鞘内注射miR-132-3p-mimic对慢性压迫性神经损伤小鼠神经性疼痛的影响   术后1周，慢性压迫性神经损伤模型组的机械缩足反射阈值和热阈值明显低于对照组及假手术组，见表1，2。

为观察miR-132-3p对慢性压迫性神经损伤小鼠神经性疼痛的影响，于术后第7天鞘内注射miR-132-3p-mimic，在不同时间点监测动物行为指标，结果发现鞘内注射miR-132-3p-mimic明显提高慢性压迫性神经损伤小鼠的机械缩足反射阈值和热阈值，减轻小鼠的机械和热痛觉过敏，见图6A，B。随后各组选取3只小鼠麻醉处死，分离术侧背根神经节，采用RT-qPCR、Western blot检测miR-132-3p、Ptch1、Shh信号通路标记蛋白以及P2X4R的表达，结果显示慢性压迫性神经损伤小鼠背根神经节中miR-132-3p表达下调(P < 0.05)，见图6C，Ptch1表达上调(P < 0.05)，见图6D，E，Shh信号通路处于激活状态(P < 0.05)，见图6D，F，P2X4R表达上调(P < 0.05)，见图6D，E，鞘内注射miR-132-3p-mimic可以下调Ptch1的表达，抑制Shh信号通路的激活发挥镇痛作用，减轻慢性压迫性神经损伤小鼠的神经性疼痛，见图6C-F。

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微小RNA(microRNA，miRNA)是动植物中广泛存在的一类由内源基因编码的无蛋白编码功能的小分子单链RNA，长度一般在22个核苷酸左右。miRNA 是经典的转录后调节分子，通过种子序列(seed sequence)识别靶基因mRNA 的3′非翻译区上的特定序列并形成RNA诱导沉默复合物来抑制靶基因的翻译或mRNA的降解，从而在基因表达的转录后水平发挥抑制作用。尽管miRNA发现迄今已超过20年，人和动物中发现的miRNA种类也有数万个，但是研究者对miRNA在各种疾病中发挥的调节作用依然有限，深入发掘与人类疾病发生发展密切相关的且有潜力成为生物治疗靶点的miRNA，仍是医学研究者当前乃至今后相当长一段时间内努力的方向。miR-132序
列在脊椎动物中高度保守，通过调控多个靶基因的转录和翻译与神经元的可塑性改变密切相关[1]。多项研究证实miR-132在大脑中大量表达，可以调节认知、神经可塑性和记忆，调节突触的结构和功能。存在于海马区的miR-132通过抑制乙酰胆碱酯酶调节应激诱导的认知缺陷[2-4]。miR-132与疼痛的发生发展过程密切相关[5-6]，最近有研究发现miR-132参与慢性压迫性神经损伤(chronic constriction injury，CCI)导致的神经性疼痛[7]。脊髓中的miR-132也被认为是坐骨神经分支选择结扎导致神经性疼痛的递质[8]。miR-132-3p为miR-132的亚型之一，在神经系统相关疾病、免疫疾病以及癌症中发挥不同的生物学功能。miR-132-3p通过直接靶向SOX11抑制套细胞淋巴瘤的发展[9]，过表达miR-132-3p可以减轻β-淀粉样蛋白25-35诱导的神经元损伤[10]，但目前关于miR-132-3p在慢性压迫性神经损伤小鼠神经病理性疼痛中的作用及其机制尚不明确。

研究表明miR-132在肺癌细胞系中高表达，通过靶向调节Ptch1基因的表达促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及克隆形成[11]。Sonic Hedgehog (Shh)信号通路包含细胞膜表面特异性受体Patched (Ptch1)和转录因子Gli1，对不同祖细胞的生成至关重要。Shh-Ptch1-Gli通路的失调导致多种人类疾病，包括出生缺陷和癌症[12-13]。Ptch1是RND转运蛋白家族的成员，能与Hh配体直接结合。Shh与Ptch1结合消除了Ptch1对Smo的抑制作用，激活的Smo活化下游Gli1，对神经管起诱导作用。Shh可与Ptch/Smo蛋白复合物结合，参与调节神经元在内的各种细胞的生长和分化，在神经发育过程中起重要作用，Shh信号通路的失调可能参与创伤后周围神经病变性疼痛的发展[14-15]。

该实验采用100 μg/L脂多糖刺激小鼠小胶质细胞BV2建立小胶质细胞活化模型用于体外研究，应用RT-qPCR检测miR-132-3p的表达水平，然后BV2细胞转染miR-132-3p-mimic或inhibitor 24 h后用脂多糖刺激培养24 h，研究miR-132-3p对神经损伤中小胶质细胞激活的影响，运用生物信息学数据库预测miR-132-3p靶向调节的基因并通过双荧光素酶报告基因实验进行验证，随后共转染miR-132-3p-mimic和pcDNA-Ptch1 24 h后用脂多糖刺激BV2细胞24 h，研究miR-132-3p的作用机制，最后通过向慢性压迫性神经损伤小鼠鞘内注射miR-132-3p-mimic，进行行为学检测以及通过Western blot检测Ptch1、P2X4R和Shh通路标记蛋白的表达,进一步验证miR-132-3p-mimic在神经性疼痛中所发挥的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验联合体内实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2018年12月至2020年10月在河南中医药大学第二附属医院医学研究中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   C57BL/6小鼠30只，8-10周龄，雌雄不限，体质量20-25 g，由河南省中医院提供，合格证号：SYXK(豫)2016-0009。
1.3.2   实验主要试剂与仪器   高糖DMEM(Gibco公司)；脂多糖(L2880-10MG，美国Sigma公司)；兔抗小鼠IBA1抗体、Shh抗体、Gli1抗体、Ptch1抗体、山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶、驴抗山羊IgG-辣根过氧化物酶(美国Abcam公司)；山羊抗小鼠P2X4R抗体(MyBioSource公司)；热痛刺激仪、Von Frey纤维丝测痛仪(天津伯尔尼科技有限公司)；Nano Drop 2000荧光分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)；荧光定量PCR仪、蛋白电泳仪、蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   细胞的培养及处理   BV2细胞系由作者所在实验室保存并培养于含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，使用Lipofectamine 2000转染试剂将miR-132-3p-mimic、inhibitor和Ptch1的表达载体pcDNA-Ptch1及siRNA转染BV2细胞24 h，在此基础上使用100 μg/L脂多糖刺激培养小胶质细胞BV2[16]，刺激24 h[17]。
1.4.2   慢性压迫性神经损伤小鼠模型的建立及干预   C57BL/6小鼠随机分为3组：对照组6只，假手术组6只，慢性压迫性神经损伤模型组18只。慢性压迫性神经损伤模型组小鼠充分麻醉后，在无菌条件下暴露左侧坐骨神经，使用羊肠线将坐骨神经结扎3道，然后缝合肌肉及皮肤；假手术组找到神经后不结扎直接缝合切口；对照组不做任何处理。术后监测后肢对机械刺激的反应阈值(the mechanical withdrawal threshold，MWT)和对温度刺激的反应潜伏期(the thermal withdrawal latency，TWL)。为观察miR-132-3p对慢性压迫性神经损伤小鼠神经性疼痛的影响，将慢性压迫性神经损伤模型组小鼠鞘内置管成功后随机分为3组：模型对照组、NC-mimic组、miR-132-3p-mimic组，每组6只，于术后第7天鞘内注射miR-132-3p-mimic和NC-mimic，模型对照组鞘内注射无核酸酶水，注射后不同时间点监测上述动物行为指标。实验方案经河南省中医院动物实验中心伦理委员会批准，批准号为HNUCM-2018006。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

1.5   主要观察指标   
1.5.1   Western blot检测蛋白表达水平   胰酶消化离心收集各组BV2细胞，使用RIPA裂解液于冰上裂解细胞，离心取上清，经BCA试剂盒检测蛋白浓度后，取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将目的大小的条带转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，4 ℃过夜孵育相应的一抗：兔抗小鼠IBA1抗体、Shh抗体、Gli1抗体、Ptch1抗体、GAPDH抗体、山羊抗小鼠P2X4R抗体，次日用TBST漂洗后加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，使用ECL试剂盒检测目的条带的表达。
1.5.2   RT-qPCR检测miRNA表达水平   收集各组BV2细胞，使用Trizol试剂盒按照说明书提取总RNA，经Nano-300微量分光光度计检测RNA浓度和纯度，吸取1 ng RNA反转录为cDNA作为后续RT-qPCR的模板。使用TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)试剂盒配制25 μL反应体系于CFX96 Real-Time PCR Detection System进行RT-qPCR检测目标基因miRNA表达水平。所用引物序列如下：miR-132-3p-F：5'-CCA GCA TAA CAG TCT ACA GCC-3'，miR-132-3p-R：5'-TAT GGT TGT TCA CGA CTC CTT CAC-3'；U6-F：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，U6-R：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。
1.5.3   双荧光素酶报告基因实验   将Ptch1 3'-UTR克隆至pGL3-basic载体中构建荧光素酶质粒，随后与miR-132-3p-mimic共同转染HEK-293T细胞，48 h后通过监测荧光素酶的活性变化来检测报告基因表达的变化，以此来确定miR-132-3p通过与Ptch1 3'-UTR结合靶向调节Ptch1的表达。
1.5.4   各组小鼠行为学检测   术前、术后1，3，7 d检测并比较慢性压迫性神经损伤模型组与假手术组的机械缩足反射阈值，于鞘内注射3，6，12，18，24 h检测并比较NC-mimic组和miR-132-3p-mimic组的机械缩足反射阈值。自由活动的小鼠置于塑料网格中适应环境，然后使用Von Frey纤维丝测痛仪垂直匀速地刺激小鼠左后足底部正中的皮肤，检测各组小鼠对机械刺激的反应阈值，von Frey纤维丝从0.004 4 g开始增加，一直持续到小鼠出现缩足反射，间隔2 min重复测定3次，取平均值。

术前、术后1，3，7 d检测并比较慢性压迫性神经损伤模型组与假手术组的热阈值，于鞘内注射3，6，12，18，24 h检测并比较注射NC-mimic组和注射miR-132-3p-mimic组的热阈值。使用热痛刺激仪检测各组小鼠对温度刺激的反应潜伏期。将小鼠放在一个透明、无底的盒子中，下置一玻璃板，玻璃板下方有一盏灯将光束定向照到小鼠后爪的脚垫处进行辐射热刺激。当老鼠抬起爪子时，光束会自动关闭，这样就可以测量光束从开始照射到抬爪所需的时间，即对温度刺激的反应潜伏期，间隔5 min测1次，取3次测定的平均值作为结果，热刺激的最长时间为25 s。

各组小鼠在完成行为学检测后麻醉处死，分离术侧背根神经节，使用RIPA裂解液提取组织总蛋白质，经BCA法测定蛋白浓度后，通过Western blot检测背根神经节中疼痛相关蛋白的表达以及Sonic Hedgehog(Shh)信号通路相关蛋白(Shh、Gli1)的表达，表明Shh信号通路的激活状态及其在慢性压迫性神经损伤小鼠神经性疼痛中的作用。
1.6   统计学分析   采用SPSS 24.0软件进行分析，数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过河南中医药大学第二附属医院生物统计学专家审核。

神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统损伤或疾病直接造成的疼痛，属于慢性疼痛，临床表现为自发性疼痛、痛觉过敏和感觉异常等[20-21]。小胶质细胞在痛觉的产生与发展过程中起重要作用[22]，该研究采用脂多糖刺激BV2细胞系建立小胶质细胞活化模型用于进一步研究miR-132-3p在神经病理性疼痛中的作用及其机制，结果发现在激活的小胶质细胞中miR-132-3p的表达水平下调，提示miR-132-3p可能在神经病理疼痛中发挥保护作用，miR-132-3p的缺失可能和神经病理性疼痛的发生有关。

研究表明，神经损伤后释放的ATP可以通过作用于P2受体，在神经病理性疼痛的信号传导中发挥重要作用[23-25]。已证实P2X2/3、P2X4及P2X7在神经病理性疼痛中起重要作用，外周神经损伤后小胶质细胞表面P2X4受体表达增加[26-28]。由于P2X4受体只存在于小胶质细胞表面，脊髓小胶质细胞和P2X4受体在引起神经性疼痛中起主要作用，将P2X4受体阳性的小胶质细胞经鞘内注入正常大鼠能够产生显著的机械痛觉过敏[29-31]。研究发现CB2受体激活剂通过上调miR-124的表达，下调P2X4和P2X7受体的表达，减轻慢性压迫性神经损伤大鼠的疼痛[32]。该研究通过将miR-132-3p-mimic或inhibitor转染BV2细胞24 h后用脂多糖刺激培养24 h，然后通过检测小胶质细胞激活标记物IBA1以及P2X4受体的表达探讨miR-132-3p的镇痛作用，结果发现miR-132-3p-mimic抑制小胶质细胞的激活以及P2X4受体的表达，可见miR-132-3p通过某种途径影响P2X4受体的表达，从而抑制其介导的小胶质细胞的激活。自该研究结束之日，尚未见到miR-132-3p对小胶质细胞激活调节的确切作用。直至2022年初，GONG等[33]学者才发表了其团队关于miR-132-3p调节帕金森病患者小胶质细胞功能的研究成果。

为进一步研究miR-132-3p在神经病理性疼痛中的作用机制，通过在线数据库starBase预测miR-132-3p的下游靶基因，选择在神经病理性疼痛中发挥重要作用的Shh信号通路结合蛋白Ptch1进行进一步研究[34-35]。随后通过双荧光素酶报告基因实验验证了miR-132-3p通过与Ptch1的3'-UTR结合靶向调节Ptch1的表达。Ptch受体是一种跨膜蛋白，由Patched编码，在哺乳动物中包括Ptch1和Ptch2两种，均能与Hh配体直接结合。Ptch1受Hh信号通路调节且能通过抑制Smoothened co-receptor(Smo)对Hh信号通路起负调控作用[36]。当Shh沉默时，Ptch与Smo结合，Smo的活性被抑制；当Shh作为起始蛋白被激活，与受体Ptch结合，使Smo游离并被激活，活化下游Gli1，Gli1被激活后进入细胞核，对细胞产生生物调节作用[37]。Shh是分泌性糖蛋白因子，可与Ptch/Smo蛋白复合物结合，参与调节神经元在内的各种细胞的生长和分化，在神经发育过程中起重要作用，多项研究表明Shh信号通路参与外周神经损伤后的再生和修复[38-40]。Shh在脊髓腹侧模型的建立、基底板的诱导和运动神经元的形成等方面发挥重要作用，并在早期胚胎发育中发挥多种功能[41]。该研究发现在脂多糖刺激BV2细胞建立的小胶质细胞活化模型中，Shh信号通路标记蛋白的表达显著上调，与在神经病理性疼痛模型大鼠中的表达变化相同[42-43]。将Ptch1表达载体或siRNA转染后用脂多糖刺激培养BV2细胞，发现敲低Ptch1抑制Shh通路的激活以及IBA1和P2X4R的表达。这与环巴明通过抑制Shh信号通路缓解大鼠神经病理性疼痛的研究结果相一致[44]。单独转染miR-132-3p-mimic或与pcDNA-Ptch1共转染BV2细胞24 h后用脂多糖刺激培养24 h，检测Shh信号通路标记蛋白的表达，发现miR-132-3p抑制Shh信号通路的激活以及IBA1和P2X4R的表达，而过表达Ptch1可以逆转其抑制作用。最后通过建立慢性压迫性神经损伤小鼠模型经鞘内注射miR-132-3p-mimic进一步在体内验证miR-132-3p在神经病理性疼痛中所发挥的作用及其具体机制，所得结果与体外实验一致：miR-132-3p-mimic转染后显著减轻小鼠慢性压迫性神经损伤导致的神经性疼痛，抑制Shh信号通路和神经炎症因子的分泌。

综上所述，miR-132-3p-mimic通过与Ptch1的3’-UTR结合靶向调节Ptch1的表达，抑制Shh信号通路的激活以减轻小鼠慢性压迫性神经损伤导致的神经性疼痛，该结果为临床缓解神经病理性疼痛提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
Ptch1：由Patched编码的Ptch受体，能与Hh配体直接结合。当Shh沉默时，Ptch与Smo结合抑制Smo的活性，当Shh被激活时，与Ptch结合使Smo游离并被激活，活化下游Gli1。Shh可与Ptch/Smo蛋白复合物结合，参与调节神经元在内的各种细胞的生长和分化，在神经发育过程中起重要作用。
慢性压迫性神经损伤：慢性压迫性神经损伤造成由躯体感觉传入神经系统损伤所引起的疼痛，属于神经病理性疼痛，建立慢性压迫性神经损伤小鼠模型可用于研究神经病理性疼痛产生、维持的机制，为其治疗寻找新的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

神经病理性疼痛通常是由躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的一种慢性疾病，包括慢性压迫性神经损伤和非完全性神经损伤，并且伴有复杂的病理变化。临床根据药物的疗效/安全比和患者的情况，如：并发症、禁忌证、合并用药情况等选择药物进行治疗，实验研究还表明电针刺激可有效缓解慢性压迫性神经损伤诱发的神经性疼痛症状，无明显不良反应。该研究探讨了miR-132-3p在慢性压迫性神经损伤中所发挥的作用及其机制，并且发现鞘内注射miR-132-3p-mimic可以减轻慢性压迫性神经损伤小鼠的神经性疼痛，该研究结果可以为慢性压迫性神经损伤的治疗提供新的靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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