miR-132-3p过表达对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1844

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (1): 59-64.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1844

miR-132-3p过表达对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

孙芬1，刘名燕2，刘铭3，孙心旖3，冯云霞1

¹山西医科大学口腔医学院▪口腔医院，山西省太原市 030000；²苏州牙博士口腔机构，江苏省苏州市 215000；³山西医科大学基础医学院，山西省太原市 030000

收稿日期:2019-03-23 修回日期:2019-04-02 接受日期:2019-05-23 出版日期:2020-01-08 发布日期:2019-12-12
通讯作者: 冯云霞，教授，山西医科大学口腔医学院▪口腔医院，山西省太原市 030000
作者简介:孙芬，女，1990年生，陕西省渭南市人，2019年山西医科大学毕业，硕士，主要从事正畸学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81400566)

Effect of microRNA-132-3p overexpression on proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

Sun Fen¹, Liu Mingyan², Liu Ming³, Sun Xinyi³, Feng Yunxia¹

¹Shanxi Medical University School and Hospital of Stomatology, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; ²Dental Doctor, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; ³School of Basic Medical Science, Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China

Received:2019-03-23 Revised:2019-04-02 Accepted:2019-05-23 Online:2020-01-08 Published:2019-12-12
Contact: Feng Yunxia, Professor, Shanxi Medical University School and Hospital of Stomatology, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
About author:Sun Fen, Master, Shanxi Medical University School and Hospital of Stomatology, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81400566

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

miRNA：是一类小的非编码RNA，长度约为22个核苷酸，其主要通过结合靶标mRNA的3'UTR区诱导靶标mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录及转录后水平调控相关基因的表达。miRNA在细胞增殖、分化及凋亡等多种生物学活动过程中起着非常重要的调控作用，并且发现它是调控骨组织细胞增殖和分化过程的重要因子之一。

MC3T3-E1细胞：是新生C57BL/6小鼠颅顶骨中分离培养所建立的一株成骨细胞株，它能够展现骨组织中成骨细胞的各个发育阶段和各种生物学特性。作为研究成骨细胞增殖和分化的理想模型，被广泛应用于国内外各种骨组织工程学研究。

背景：机械牵引力能够影响MC3T3-E1细胞的增殖分化过程，并引起细胞内miR-132-3p的差异表达。然而，牵引力是否通过调控miR-132-3p的表达来影响成骨细胞增殖分化仍需进一步研究。

目的：明确12%牵引力作用下MC3T3-E1细胞中成骨分化标志因子及miR-132-3p表达变化，并进一步探讨miR-132-3p对细胞增殖分化的影响。

方法：MC3T3-E1细胞分别加载0%，12%牵张应力，检测应力加载后碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白及miR-132-3p mRNA的表达水平；细胞内瞬时转染miR-132-3p模拟物及其阴性对照，qRT-PCR检测转染后碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA的表达，CCK-8法检测miR-132-3p对细胞增殖能力的影响。

结果与结论：①12%牵张应力作用下，MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白mRNA表达水平下调(P < 0.01)，miR-132-3p表达水平显著升高(P < 0.05)；②细胞内转染miR-132-3p后，miR-132-3p模拟物组成骨分化标志因子碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)；③相比于阴性对照组，miR-132-3p 模拟物转染24，48，72 h后细胞增殖能力明显降低(P < 0.001)，且在转染48 h后降低最明显；④结果说明12%周期性循环牵张应力能够通过过表达miR-132-3p负向调节MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化。

ORCID: 0000-0003-0696-3329(孙芬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 机械牵引力, miR-132-3p, MC3T3-E1细胞, 细胞分化, 碱性磷酸酶, 骨钙蛋白, 细胞增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mechanical stress can influence the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells and trigger differential expression of miR-132-3p. However, further research is warranted concerning whether tensile stress can influence the proliferation and differentiation of osteoblasts by regulating miR-132-3p.

OBJECTIVE: To determine the expression of osteogenic differentiation markers and miR-132-3p in MC3T3-E1 cells under 12% cyclic stretch and to explore the effect of miR-132-3p on cell proliferation and differentiation.

METHODS: MC3T3-E1 cells were loaded with 0% and 12% tensile stress, and alkaline phosphatase activity, osteocalcin mRNA and miR-132-3p expression levels were detected. MC3T3-E1 cells were transiently transfected with miR-132-3p mimics and a negative control transfection group was set up. The expression of alkaline phosphatase, osteocalcin and Runx2 mRNA in transfected cells were detected by qRT-PCR, and the effect of miR-132-3p on cell proliferation were detected by cell counting kit-8 assay.

RESULTS AND CONCLUSION: The alkaline phosphatase activity and osteocalcin mRNA expression were down-regulated in MC3T3-E1 cells under 12% stretch stress (P < 0.01), and the expression of miR-132-3p was significantly increased (P < 0.05). QRT-PCR results showed the expression levels of osteogenic differentiation markers alkaline phosphatase activity, osteocalcin, and Runx2 mRNA in miR-132-3p mimics group were significantly decreased after intracellular transfection of miR-132-3p (P < 0.05). Compared with the negative control transfection group, the cell proliferation in the miR-132-3p mimic group was decreased at 24, 48, and 72 hours after transfection (P < 0.001), and the most obvious reduction was observed after 48-hour transfection. These findings indicate that 12% cyclic tensile stress can negatively regulate the proliferation and differentiation ability of MC3T3-E1 cells by overexpressing miR-132-3p.

Key words: mechanical stress, miR-132-3p, MC3T3-E1 cells, cell differentiation, alkaline phosphatase, osteocalcin, cell proliferation, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

孙芬, 刘名燕, 刘铭, 孙心旖, 冯云霞. miR-132-3p过表达对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(1): 59-64.

Sun Fen, Liu Mingyan, Liu Ming, Sun Xinyi, Feng Yunxia. Effect of microRNA-132-3p overexpression on proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(1): 59-64.

图/表（结果） 5

2.1 应力加载对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性及骨钙蛋白mRNA表达的影响相比于对照组，12%应力加载组细胞中碱性磷酸酶活性显著下调(t=6.17，P=0.004)，见图1A。同时，12%应力加载组细胞中骨钙蛋白mRNA表达降低(t=24.495，P < 0.001)，见图1B。这些结果表明，12%周期性循环牵引力可能抑制MC3T3-E1细胞成骨分化。

2.2 应力加载对MC3T3-E1细胞中miR-132-3p表达的影响与对照组比，12%周期性牵张应力作用下，MC3T3-E1细胞中miR-132-3p的表达水平显著升高(t=-8.074，P=0.015)，见图2。结果说明：miR-132-3p可能参与调节12%牵张应力作用下MC3T3-E1细胞成骨分化过程。

2.3 MC3T3-E1细胞瞬时转染后细胞内miR-132-3p的表达带Cy3荧光标记的miR-132-3p mimics/NC转染至MC3T3-E1细胞中，转染24 h后荧光显微镜同视场下可观察到90%左右细胞有红色荧光表达，见图3A-D。转染24，48 h后，使用qRT-PCR对转染效果进行验证。与空白对照组和miR-132-3p NC组相比，miR-132-3p mimics组细胞中miR-132-3p的表达显著提高(24 h：F=852.473，P < 0.001；48 h：F=192.028，P < 0.001)。转染24，48 h后，miR-132-3p mimics组细胞中miR-132-3p相对表达量约为miR-132-3p NC组的9倍和110倍，miR-132-3p NC组与空白对照组间miR-132-3p的表达水平差异无显著性意义(24 h：P= 0.351；48 h：P=0.991)，见图3E。证明MC3T3-E1细胞中已过表达miR-132-3p。

2.4 miR-132-3p对细胞成骨分化标志因子表达的影响相较于miR-132-3p NC组及空白对照组，miR-132-3p mimics组细胞中碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA表达水平在转染24 h后显著降低(碱性磷酸酶：F=6.606，P=0.03；骨钙蛋白：F=15.93，P=0.004；Runt标志转录因子2：F=23.93，P=0.001)，与转染24 h相比，各成骨分化标记因子在转染48 h时降低最明显(碱性磷酸酶：F=44.172，P < 0.001；骨钙蛋白：F=43.673，P < 0.001；Runt标志转录因子2：F=152.14，P < 0.001)，见图4。结果表明过表达miR-132-3p能够显著抑制MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2表达水平。

2.5 miR-132-3p对细胞增殖能力的影响转染后24，48，72 h，miR-132-3p mimics组细胞增殖能力明显低于miR-132-3p NC组及空白对照组(F_{24 h}=57.697，P_{24 h}< 0.001；F_{48 h}=204.883，P_{48 h}< 0.001；F_{72 h}=486.948， P_{72 h}< 0.001)，在转染48 h时细胞增殖能力降低最明显，见图5。这说明过表达miR-132-3p可明显降低MC3T3-E1细胞的增殖能力。

参考文献

[1] GARLET TP, COELHO U, SILVA JS, et al. Cytokine expression pattern in compression and tension sides of the periodontal ligament during orthodontic tooth movement in humans. Eur J Oral Sci. 2007;115(5):355-362.
[2] FELLER L, KHAMMISSA RA, SCHECHTER I, et al. Periodontal Biological Events Associated with Orthodontic Tooth Movement: The Biomechanics of the Cytoskeleton and the Extracellular Matrix. Scientific World Journal. 2015;2015: 894123.
[3] SHEN T, QIU L, CHANG H, et al. Cyclic tension promotes osteogenic differentiation in human periodontal ligament stem cells. Int J Clin Exp Pathol. 2014;7(11):7872-7880.
[4] KOIKE M, SHIMOKAWA H, KANNO Z, et al. Effects of mechanical strain on proliferation and differentiation of bone marrow stromal cell line ST2. J Bone Miner Metab. 2005; 23(3):219-225.
[5] AMBROS V. microRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 2001;107(7):823-826.
[6] DRAGOMIR M, MAFRA ACP, DIAS SMG, et al. Using microRNA Networks to Understand Cancer. Int J Mol Sci. 2018;19(7): E1871.
[7] LI Z, HASSAN MQ, JAFFERJI M, et al. Biological functions of miR-29b contribute to positive regulation of osteoblast differentiation. J Biol Chem. 2009;284(23):15676-15684.
[8] HASSAN MQ, MAEDA Y, TAIPALEENMAKI H, et al. miR-218 directs a Wnt signaling circuit to promote differentiation of osteoblasts and osteomimicry of metastatic cancer cells. J Biol Chem. 2012;287(50):42084-42092.
[9] BHUSHAN R, GRÜNHAGEN J, BECKER J, et al. miR-181a promotes osteoblastic differentiation through repression of TGF-β signaling molecules. Int J Biochem Cell Biol. 2013; 45(3):696-705.
[10] 孙芬,刘铭,刘名燕. 牵引力介导MC3T3-E1细胞microRNA的差异表达[J]. 口腔医学, 2018, 38(3):222-226.
[11] TOGNINI P, PIZZORUSSO T. MicroRNA212/132 family: molecular transducer of neuronal function and plasticity. Int J Biochem Cell Biol. 2012;44(1):6-10.
[12] BICKER S, LACKINGER M, WEIß K, et al. MicroRNA-132, -134, and -138: a microRNA troika rules in neuronal dendrites. Cell Mol Life Sci. 2014;71(20):3987-4005.
[13] QU X, CHEN Z, FAN D, et al. MiR-132-3p Regulates the Osteogenic Differentiation of Thoracic Ligamentum Flavum Cells by Inhibiting Multiple Osteogenesis-Related Genes. Int J Mol Sci. 2016;17(8): E1370.
[14] BIJKERK R, DE BRUIN RG, VAN SOLINGEN C, et al. Silencing of microRNA-132 reduces renal fibrosis by selectively inhibiting myofibroblast proliferation. Kidney Int. 2016;89(6):1268-1280.
[15] 陈熙,郭健民,元宇,等.不同牵张应力对成骨细胞MC3T3-E1分化及Wnt信号转导通路的影响研究[J].中国骨质疏松杂志, 2016, 22(1):9-13.
[16] CHEN Z, ZHANG Y, LIANG C, et al. Mechanosensitive miRNAs and Bone Formation. Int J Mol Sci.2017;18(8): E1684.
[17] LIU L, LIU M, LI R, et al. MicroRNA-503-5p inhibits stretch-induced osteogenic differentiation and bone formation. Cell Biol Int. 2017;41(2):112-123.
[18] CHANG M, LIN H, FU H, et al. MicroRNA-195-5p Regulates osteogenic differentiation of periodontal ligament cells under mechanical loading. J Cell Physiol. 2017;232(12):3762-3774.
[19] GUO Y, WANG Y, LIU Y, et al. MicroRNA-218, microRNA-191*, microRNA-3070a and microRNA-33 are responsive to mechanical strain exerted on osteoblastic cells. Mol Med Rep. 2015;12(2):3033-3038.
[20] ARFAT Y, BASRA MAR, SHAHZAD M, et al. miR-208a-3p suppresses osteoblast differentiation and inhibits bone formation by targeting ACVR1. Mol Ther Nucleic Acids.2018; 11:323-336.
[21] WANG H, SUN Z, WANG Y, et al. miR-33-5p, a novel mechano-sensitive microRNA promotes osteoblast differentiation by targeting Hmga2. Sci Rep. 2016;6:23170.
[22] QI L, ZHANG Y. The microRNA 132 regulates fluid shear stress-induced differentiation in periodontal ligament cells through mTOR signaling pathway. Cell Physiol Biochem. 2014;33(2):433-445.
[23] HU Z, WANG Y, SUN Z, et al. miRNA-132-3p inhibits osteoblast differentiation by targeting Ep300 in simulated microgravity. Sci Rep. 2015;5:18655.
[24] WANG Y, ZOU X, GUO Y, et al. Mechanical Strain Affects Some Microrna Profiles in Pre-Oeteoblasts. Cell Mol Biol Lett. 2015;20(4):586-596.
[25] PICHLER S, GU W, HARTL D, et al. The miRNome of Alzheimer's disease: consistent downregulation of the miR-132/ 212 cluster. Neurobiol Aging. 2017;50:167.e1-167.e10.
[26] LEINDERS M, ÜÇEYLER N, PRITCHARD RA, et al. Increased miR-132-3p expression is associated with chronic neuropathic pain. Exp Neurol. 2016;283(Pt A):276-286.
[27] GUAN H, SHANG G, CUI Y, et al. Long noncoding RNA APTR contributes to osteosarcoma progression through repression of miR-132-3p and upregulation of yes-associated protein 1. J Cell Physiol. 2019;234(6): 8998-9007.
[28] KIM HR, HWANG SJ, SHIN CH, et al. SRSF3-regulated miR-132/212 controls cell migration and invasion by targeting YAP1. Exp Cell Res. 2017;358(2):161-170.
[29] LIU K, LI X, CAO Y, et al. MiR-132 inhibits cell proliferation, invasion and migration of hepatocellular carcinoma by targeting PIK3R3. Int J Oncol. 2015;47(4):1585-1593.
[30] ZHANG M, LI Y, WANG H, et al. LncRNA SNHG5 affects cell proliferation, metastasis and migration of colorectal cancer through regulating miR-132-3p/CREB5. Cancer Biol Ther. 2019;20(4):524-536.

引言

机械应力介导下牙周组织的改建是正畸牙齿移动的生物学基础。在牙周组织中，牙槽骨的改建主要表现为成骨与破骨动态平衡的生理过程^[1-2]。成骨细胞主要负责骨基质的形成和钙化，在骨组织应力改建过程中发挥着重要作用。因此，深入研究其力学生物学反应，对了解正畸牙齿移动机制起着至关重要的作用。机械牵引力能引起骨组织代谢的改变。SHEN等^[3]研究发现，对人牙周膜干细胞施加12%的循环牵引力能促进成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2的表达。但是也有研究发现，骨髓基质细胞加载10%，15%拉伸应变力时，细胞碱性磷酸酶活性、cbfaL/Runx2及骨钙蛋白mRNA表达下调^[4]。尽管学者们对骨组织细胞的力学生物学反应进行了大量研究，但是由于细胞种类以及应力加载方式、大小、持续时间等不同，细胞对机械应力的反应也不同。作者前期研究发现12%的拉伸应力能很好地模拟正畸应力作用下牙周组织的受力状态，并促进人牙周膜细胞(HPDLC)分化为成骨细胞样细胞；然而，12%周期性牵引力对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响还需进一步研究。 microRNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，它能够通过结合靶标mRNA 3'UTR区调控相关基因的表达^[5-6]。越来越多的研究发现，miRNA是调控细胞成骨分化的重要因子之一^[7-9]。作者前期通过miRNA基因芯片验证发现，在12%周期性牵张应力作用下，MC3T3-E1细胞内miR-132-3p表达水平升高^[10]。miR-132家族位于人染色体17p13.3上，其序列在脊椎动物中高度保守^[11-12]，miR-132-3p为miR-132的亚型之一。研究发现，miR-132-3p能够靶向FOXO1、GDF5和SOX6 mRNA并下调其蛋白质表达，从而影响胸腺黄韧带细胞成骨分化^[13]。BIJKERK等^[14]认为miR-132低表达能够抑制肌成纤维细胞的增殖能力。以上研究表明，miR-132-3p参与调控细胞的成骨分化和增殖能力。然而，机械牵引力是否通过调控miR-132-3p的表达来影响成骨细胞增殖分化尚不清楚。基于此，该研究首先通过12%周期性牵张应力刺激MC3T3-E1细胞，观察细胞中碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白mRNA表达变化，并进一步确定力学刺激对miR-132-3p表达的影响；随后通过转染使细胞过表达miR-132-3p，观察其对细胞成骨分化标志因子碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA表达及增殖能力的影响，从基因学角度为深入研究成骨细胞的力学生物学反应提供实验数据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性细胞实验。

1.2 时间及地点实验于2017年11月至2019年1月在山西医科大学基础医学院实验室完成。

1.3 材料 MC3T3-E1细胞(北京协和医学院细胞资源中心)；α-MEM培养基(Gibco公司，美国)；Lipofectamine^TM 2000转染试剂(Invitrogen，美国)；碱性磷酸酶测试盒(南京建成)；TRIzol试剂(Invitrogen，美国)； miR-132-3p模拟物及阴性对照(吉玛，上海)；CCK-8试剂盒(博士德，中国)；实时荧光定量通用试剂(Cat# GMRS-001吉玛，上海)。

1.4 实验方法

1.4.1 MC3T3-E1细胞培养用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱常规培养MC3T3-E1细胞，每3 d换液1次，待细胞融合度达80%-90%时进行传代培养。

1.4.2 细胞牵张应力加载生长良好的MC3T3-E1细胞(第5代后)经胰酶消化后离心、吹散，以3×10⁸ L^-1接种至6孔弹性培养板上(Flexcell)，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱孵育过夜。实验分为对照组及应力加载组，应力加载组利用Flexcell(FX-3000)细胞牵张仪对细胞加载12%单轴拉伸应变力，干预时间为24 h，力学刺激频率为每分钟6个周期(5 s拉伸、5 s松弛，1 min内重复6个周期)。对照组在相同培养条件下加载0%拉伸应力。

1.4.3 碱性磷酸酶活性检测应力加载后，PBS轻柔洗涤细胞2次，每孔加入1 mL 0.2%Triton X-100，4 ℃过夜。根据碱性磷酸酶检测试剂盒说明，取5 μL细胞裂解物加入96孔板中，然后加入基质液和缓冲液，混匀，37 ℃下反应15 min后添加显色剂，酶标仪490 nm波长下检测各孔吸光度值。实验同时设标准孔和空白对照孔。每组3个复孔，根据酶活性定义计算各组碱性磷酸酶活性。

1.4.4 实时荧光定量PCR反应检测miR-132-3p和骨钙蛋白mRNA的表达应力加载后，通过Trizol法提取总RNA并进行反转录反应，根据实时荧光定量通用试剂盒(Cat# GMRS-001，吉玛，上海)说明进行定量检测，反应条件为：95 ℃，3 min；95 ℃，12 s；62 ℃，40 s；共40个循环。分别以U6和GAPDH作为内参检测miR-132-3p和骨钙蛋白mRNA的相对表达量，使用2^-∆∆Ct方法进行半定量分析。检测基因引物序列见表1。

1.4.5 细胞转染生长良好的MC3T3-E1细胞(第5代后)按5×10⁵/孔接种至6孔板，混匀后常规培养。待第2天细胞密度达80%左右，按Lipofectamine^TM 2000说明书进行转染，具体如下：分别使用无血清培养液稀释miR-132-3p模拟物(miR-132-3p mimics)及Lipofectamine 2000，室温静置5 min，将二者轻轻混匀后静置20 min，然后在每孔中加入混匀液，转染6 h后更换为完全培养基。实验同时设空白对照组及阴性对照组，阴性对照组转染miR-132-3p NC(与目的基因序列无同源性的RNA片段)，miR-132-3p mimics及miR-132-3p NC序列见表2。转染24，48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4.6 实时荧光定量PCR反应检测转染后细胞内miR-132-3p及碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA的表达细胞转染24，48 h后，通过Trizol法提取各组细胞总RNA并进行反转录反应，根据实时荧光定量试剂盒说明进行定量检测，反应条件为：95 ℃，3 min；95 ℃，12 s；62 ℃，40 s；共40个循环。分别以U6和GAPDH作为内参检测miR-132-3p和目的基因mRNA的相对表达量，使用2^-^∆∆Ct方法进行半定量分析。检测基因引物序列见表1。

1.4.7 CCK-8细胞增殖实验收集对数生长期的MC3T3-E1细胞(第5代后)，以3×10³/孔接种至96孔板中，随机分为空白对照组、miR-132-3p NC组及miR-132-3p mimics组，每组设5个复孔。培养24 h后倾去培养液，按说明书进行转染6 h换成完全培养基。于转染后0，24，48，72 h每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光37 ℃培养2 h，酶标仪450 nm波长测各孔吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①应力加载后MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶活性及骨钙蛋白、miR-132-3p mRNA表达水平；②过表达miR-132-3p后，MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2 mRNA表达水平及增殖能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

机械应力在骨组织细胞分化过程中发挥着重要作用。陈熙等^[15]研究发现，12%牵引力(0.5 Hz，8 h，Flexcell系统)刺激下，MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶活性和骨钙蛋白mRNA表达降低。这与作者的研究结果相似，MC3T3-E1细胞在12%周期性牵引力作用下，细胞内碱性磷酸酶活性和骨钙蛋白mRNA表达降低。KOIKE等^[4]研究了不同机械拉伸方式对骨髓基质细胞系的影响，发现当细胞加载0.8%，5%(FLexcell 系统)拉伸应变力时，细胞碱性磷酸酶活性、cbfaL/Runx2及骨钙蛋白mRNA表达上调，但加载10%，15%应变力时，细胞碱性磷酸酶活性下降，cbfaL/ Runx2及骨钙蛋白mRNA表达下调，提示加载轻力能够促进细胞成骨分化，重力则相反。综上结果不难看出，12%周期性牵张应力可能负调节MC3T3-E1细胞成骨分化。研究显示，miRNA能够通过多种途径来调控骨组织细胞的功能活性^[16-18]，并且机械牵引力能够改变骨组织细胞内miRNA的表达水平^[19-21]。这为研究牵引力作用细胞成骨分化提供了新的思路。作者前期通过miRNA基因芯片发现，在12%周期性牵张应力作用下，MC3T3-E1细胞内miR-132-3p表达显著升高^[10]。研究发现在流体剪切应力作用下，人牙周膜细胞中miR-132表达水平显著升高^[22]；也有研究表明在后肢卸载大鼠的股骨组织及暴露于微重力的大鼠成骨细胞中miR-132-3p表达水平发生变化^[23]，这说明机械应力能够改变细胞内miR-132-3p的表达。然而WANG等^[24]研究结果提示同一种细胞加载应力的方式、时间不同，细胞内miRNA的差异表达谱也不相同。因此，为了进一步明确12%周期性牵张应力对miR-132-3p表达水平的影响，课题组通过对MC3T3-E1细胞分别加载0%，12%牵引力 24 h，结果发现12%牵引力作用下，细胞内miR-132-3p表达水平显著升高。与作者之前的研究结果相同，说明12%牵引力能够促进MC3T3-E1细胞中miR-132-3p表达。目前关于miR-132-3p的研究已有较多报道，但主要集中在神经精神疾病以及肿瘤的形成和进展等领域^[25-28]。在细胞成骨分化方面，HU等^[23]研究表明miR-132-3p在模拟微重力环境中能够通过靶向抑制Ep300来降低成骨分化标志因子Runx2、Osx和碱性磷酸酶的表达水平；QU等^[13]研究表明，miR-132-3p能够通过靶向调节FOXO1、GDF5和SOX6抑制黄韧带细胞的成骨分化，这些研究均提示miR-132-3p可以负向调节细胞成骨分化。然而，也有研究发现miRNA-132高表达促进了流体剪切应力介导的牙周膜细胞成骨分化^[22]。为了进一步明确牵引力作用下miR-132-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响，该实验通过脂质体转染技术发现，当MC3T3-E1细胞高表达miR-132-3p时，细胞内成骨分化标志因子碱性磷酸酶、骨钙蛋白、Runt标志转录因子2表达水平显著下降。结合之前的研究结果：MC3T3-E1细胞加载12%牵张应力，细胞内碱性磷酸酶活性及骨钙蛋白mRNA表达水平下降。作者推测，周期性牵引力能够通过调节miR-132-3p表达水平来降低MC3T3-E1细胞成骨分化标志物的表达。在细胞增殖方面，LIU等^[29]研究发现miR-132过表达能够抑制肝癌细胞增殖；GUAN等^[27]研究表明miR-132-3p过表达能够显著抑制骨肉瘤细胞的增殖；ZHANG等^[30]研究表明miR-132-3p可以通过靶向下调 SNHG5和CREB5的表达抑制结直肠癌细胞的增殖，这些结果提示miR-132-3p过表达可能抑制细胞的增殖能力。然而，对于miR-132-3p在成骨细胞增殖方面的研究尚未见报道。因此，实验通过细胞内过表达miR-132-3p，进一步检测其对成骨细胞增殖能力的影响，发现转染miR-132-3p模拟物后24，48，72 h，MC3T3-E1细胞增殖能力与阴性对照组相比显著降低，这说明miR-132-3p过表达可降低MC3T3-E1细胞的增殖能力。综上所述，12%周期性牵张应力可能抑制MC3T3-E1细胞成骨分化相关因子表达，在此过程中miR-132-3p表达水平显著上调；进一步通过转染成骨细胞使其高表达miR-132-3p，结果表明miR-132-3p能够负向调节细胞成骨分化和增殖能力，作者推测miR-132-3p在牵引力介导成骨细胞增殖分化过程中发挥着重要作用，为研究正畸力下局部骨改建机制提供新思路，也为进一步探索通过细胞内miRNA干预来调节正畸过程中牙周组织细胞成骨分化提供理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

miR-132-3p过表达对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

Effect of microRNA-132-3p overexpression on proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

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[1]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[2]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[3]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[4]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[5]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[6]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[7]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[8]	唐小凯, 李伟明. Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3914-3920.
[9]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[10]	刘珂珂, 段昕, 马向瑞, 张云涛. 以电纺丝膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3500-3504.
[11]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[12]	余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.
[13]	魏琴, 张雪, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 贾麒钰, 马创. 血小板衍生生长因子BB诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2953-2957.
[14]	戴雅玲, 陈乐文, 何肖君, 林华伟, 贾微微, 陈立典, 陶静, 柳维林. miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3024-3030.
[15]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔, 王玲, 古丽, 迪丽达尔•塔西甫拉提, 王珊, 尹宏斌. 转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2664-2669.