以电纺丝膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3229

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (22): 3500-3504.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3229

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以电纺丝膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的影响

刘珂珂，段昕，马向瑞，张云涛

滨州医学院附属医院口腔修复科，山东省滨州市 256600

收稿日期:2020-06-09 修回日期:2020-06-13 接受日期:2020-07-29 出版日期:2021-08-08 发布日期:2021-01-19
通讯作者: 张云涛，副主任医师，滨州医学院附属医院口腔修复科，山东省滨州市 256600
作者简介:刘珂珂，女，1996年生，河南省周口市人，汉族，滨州医学院在读硕士，主要从事口腔种植修复研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划面上项目(2017WS231)，项目负责人：马向瑞；滨州医学院科研计划与科研启动基金(BY2015KYQD24)，项目负责人：马向瑞

Effect of cinnamaldehyde on osteoblasts in high glucose environment with the electrospinning membrane as a carrier

Liu Keke, Duan Xin, Ma Xiangrui, Zhang Yuntao

Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital to Binzhou Medical University, Binzhou 256600, Shandong Province, China

Received:2020-06-09 Revised:2020-06-13 Accepted:2020-07-29 Online:2021-08-08 Published:2021-01-19
Contact: Zhang Yuntao, Associate chief physician, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital to Binzhou Medical University, Binzhou 256600, Shandong Province, China
About author:Liu Keke, Master candidate, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital to Binzhou Medical University, Binzhou 256600, Shandong Province, China
Supported by:
the General Project of Shandong Medicine and Health Technology Development Plan, No. 2017WS231 (to MXR); the Research Plan and Research Startup Fund of Binzhou Medical University, No. BY2015KYQD24 (to MXR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
电纺丝：是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场下的喷射来制备纳米级超精细纤维的新型加工方法，在外加电场作用下，被表面张力作用保持在喷嘴处的高分子液滴在电场诱导下表面聚集电荷，受到与表面方向相反的电场力作用；当电场力足够大时，聚合物液滴战胜外表张力构成喷发细流，细流在喷发进程中溶剂蒸腾或固化，最终形成纳米级的纤维，并随机沉降落在接纳设备上形成连续的交联纤维支架结构。
桂皮醛：别名肉桂醛，是桂皮的主要成分，属于苯丙醛类，被广泛应用于食品添加剂中，熔点为-7.5 ℃，沸点为253 ℃，为无色或淡黄色液体，难溶于水、甘油和石油醇，易溶于丙酮、乙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等有机溶剂；临床上常用于解热、抗炎、镇痛、抗菌、抗肿瘤、抗氧化，近年来有研究发现桂皮醛在降血糖和促进成骨方面效果显著。

背景：前期研究发现，桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的生物学性能具有促进作用。
目的：以静电纺丝薄膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞增殖与分化的影响。
方法：采用静电纺丝法制备聚己内酯薄膜。将对数生长期的MC3T3-E1细胞分4组培养：空白对照组加入高糖培养液，聚己内酯组加入聚己内酯薄膜支架与高糖培养液，药物组加入含桂皮醛的高糖培养液，联合组加入聚己内酯薄膜与含桂皮醛的高糖培养液。培养1，4，7 d时，采用CCK-8法检测细胞增殖，碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性；培养7 d时，采用RT-qPCR法检测细胞骨钙蛋白mRNA表达。
结果与结论：①CCK-8检测显示，聚己内酯组、药物组、联合组各时间点的细胞增殖快于空白对照组(P < 0.05)，联合组培养4，7 d时的细胞增殖快于聚己内酯组、药物组(P < 0.05)，药物组培养4，7 d时的细胞增殖快于聚己内酯组(P < 0.05)；②聚己内酯组、药物组、联合组培养4，7 d时的碱性磷酸酶活性高于空白对照组(P < 0.05)，联合组培养4，7 d时的碱性磷酸酶活性高于聚己内酯组、药物组(P < 0.05)，药物组培养7 d时的碱性磷酸酶活性高于聚己内酯组(P < 0.05)；③4组骨钙蛋白mRNA表达由高到低依次为联合组、药物组、聚己内酯组、空白对照组，组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，聚己内酯静电纺丝薄膜与桂皮醛可协同促进高糖环境下成骨细胞的增殖与分化。

https://orcid.org/0000-0001-7355-319X (刘珂珂)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 聚己内酯, 静电纺丝薄膜, 载体, 桂皮醛, MC3T3-E1细胞, 增殖, 分化, 高糖环境, 双重作用

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have found that cinnamaldehyde can promote the biological properties of osteoblasts in high glucose environment.
OBJECTIVE: To observe the effect of cinnamaldehyde on proliferation and differentiation of osteoblasts under high glucose with electrospinning membrane as carrier.
METHODS: The polycaprolactone membranes were prepared by electrospinning. MC3T3-E1 cells in logarithmic growth phase were divided into four groups: blank control group was added with high glucose medium. Polycaprolactone group was added with polycaprolactone membrane scaffold and high glucose medium. Drug group was added with high glucose medium containing cinnamaldehyde. Combined group was added with polycaprolactone membrane and high glucose medium containing cinnamaldehyde. CCK-8 method was used to detect cell proliferation and alkaline phosphatase kit was used to detect alkaline phosphatase activity at 1, 4 and 7 days of culture. RT-qPCR was used to detect the expression of osteocalcin mRNA at 7 days.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay showed that the cell proliferation of polycaprolactone group, drug group and combined group was faster than that of blank control group at each time point (P < 0.05). Cell proliferation of combined group was faster than that of polycaprolactone group and drug group at 4 and 7 days (P < 0.05), and cell proliferation of drug group was faster than that of polycaprolactone group at 4 and 7 days (P < 0.05). (2) The alkaline phosphatase activity of polycaprolactone group, drug group, and combined group was higher than that of blank control group at 4 and 7 days (P < 0.05). The alkaline phosphatase activity of combined group was higher than that of polycaprolactone group and drug group at 4 and 7 days (P < 0.05). The alkaline phosphatase activity of drug group was higher than that of polycaprolactone group at 7 days (P < 0.05). (3) The expression of osteocalcin mRNA in the four groups from high to low was the combined group, drug group, polycaprolactone group, and blank control group; there were significant differences between the two groups (P < 0.05). (4) Results suggest that polycaprolactone electrospinning membrane and cinnamaldehyde can promote the proliferation and differentiation of osteoblasts in high glucose environment.

Key words: bone, materials, polycaprolactone, electrospinning membrane, carrier, cinnamaldehyde, MC3T3-E1 cells, proliferation, differentiation, high glucose environment, dual effects

中图分类号:

刘珂珂, 段昕, 马向瑞, 张云涛. 以电纺丝膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3500-3504.

Liu Keke, Duan Xin, Ma Xiangrui, Zhang Yuntao. Effect of cinnamaldehyde on osteoblasts in high glucose environment with the electrospinning membrane as a carrier[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(22): 3500-3504.

图/表（结果） 4

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引言

随着医疗技术的进步，牙列缺损修复技术也随之不断改善，作为一门新兴学科，口腔种植学在近十年高速发展，其在美观和舒适度方面较传统义齿修复有很大的优势，因此越来越多的患者倾向于选择种植修复缺失牙，但在临床应用过程中也不乏局限性，比如口腔种植修复中骨结合状态会直接影响到种植修复的最终效果[1-2]，种植后的种植体周围炎也是影响其远期疗效的重要因素。糖尿病作为常见的系统性疾病之一，近年来发病率明显上升，而牙周病又被称为糖尿病的第六大并发症，所以糖尿病伴牙周病患者往往更易发生附着丧失，因而较正常人来说糖尿病患者的牙列缺损发病率明显增高，所以在种植手术的受众中糖尿病患者占很大的比例。但是有研究表明，糖尿病患者体内高糖环境会造成晚期糖基化终末产物的聚集，糖基化终末产物通过激活位于牙周组织的糖基化终末产物受体参与糖尿病患者牙周组织的愈合与改建，这些最终产物使牙龈和牙周成纤维细胞产生的基质蛋白减少，如胶原和骨钙蛋白等[3]。骨钙蛋白代表成骨细胞的活性，糖尿病患者体内的高糖环境通过抑制骨钙蛋白的表达对成骨细胞的增殖、分化产生影响，继而影响种植体植入后的骨结合[4-6]，所以一直以来糖尿病都被视为种植手术的相对禁忌证。糖尿病患者作为牙周病的高危人群，在种植修复方面有很大的需求。
作者所在团队前期通过实验发现，桂皮醛对高糖环境下的成骨细胞生物学性能具有促进作用[7-8]，且在质量浓度为20 mg/L时作用最为明显[9]。电纺丝技术作为一种制备纳米级超精细纤维的新型加工方法[10-11]，由于其良好的性能现被广泛应用于各个领域。静电纺丝技术制备的电纺丝纤维膜具有良好的生物学性能，在生物工程、药物载体、医学修复等方面有较好的应用前景[12-13]。通过静电纺丝技术制备的支架模型具有立体多孔的结构[14-16]，已被证实有利于细胞的增殖黏附[17]。因此，实验以静电纺丝支架为载体加载20 mg/L的桂皮醛，观察两者是否具有协同促进成骨作用，为提高糖尿病患者种植后的骨结合率及远期疗效并应用于临床提供理论依据和数据支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年6月在滨州医学院中心实验室完成。
1.3 材料聚己内酯(sigma，美国)；MC3T3-E1细胞、桂皮醛(四川大学赠送)；N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷(国药集团试剂)；微量注射泵(康康医疗，安徽)；78-1型磁力加热搅拌器(格莱莫，武汉)；酶标仪(SpectraMax M2，MolecuLar Devices，美国)；高压电源(东文高压电源，天津)；CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；扫描电子显微镜(EVO LS15，Zeiss，德国)；激光扫描共聚焦显微镜(TCS SPE，Leica，德国)；紫外-可见光分光光度计(NanoDrop2000，Thermo Fisher Scientific，美国)；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁)；荧光实时定量PCR仪(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亚)；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天)；α-MEM培养液(Hyclone)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养 MC3T3-E1细胞加入α-MEM 培养基(含体积分数10%的胎牛血清、100 mg/L的链霉素、100 U/mL的青霉素)，置于 37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，经3次细胞传代后实验。
1.4.2 含桂皮醛培养液的配制配制含桂皮醛20 mg/L的高糖培养液，葡萄糖浓度为25 mmol/L[18]。
1.4.3 静电纺丝的制备超泽(CZ)电子天平下称取2.4 g聚己内酯置于玻璃瓶内，依次将7.5 mL三氯甲烷及2.5 mL N，N-二甲基甲酰胺逐滴加入瓶内，78-1型磁力加热搅拌器搅拌至聚己内酯完全溶解，搅拌过夜直至溶液稳定，获得电纺丝溶液。用10 mL注射器吸取电纺丝溶液，然后将其固定于微量注射泵上，通过聚氯乙烯管与9号针头(内径为0.6 mm)相连，将针头尖端接于直流高压电正极，平铺锡箔纸的接收板与高压电负极相连并将导线接地，设定参数：高压电压(25.0±0.5) kV，流速3 mL/h，接收距离20 cm，在适宜湿度和室温条件下纺织静电纺丝。电纺完成后将锡箔纸置于真空干燥箱内干燥24 h，小心揭下即可获得静电纺丝薄膜。
1.4.4 细胞增殖实验将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以5×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板，设空白对照组、聚己内酯组、药物组和联合组，每组5个复孔，每孔接种100 μL；培养24 h后，空白对照组更换为含25 mmol/L葡萄糖的完全培养液；聚己内酯组更换为含25 mmol/L葡萄糖的完全培养液，并加入聚己内酯薄膜；药物组加入含20 mg/L桂皮醛与25 mmol/L葡萄糖的完全培养液；联合组更换为含20 mg/L桂皮醛与25 mmol/L葡萄糖的完全培养液，并加入聚己内酯薄膜。培养 1，4，7 d 时，每孔加入100 μL CCK-8混合液孵育1 h，用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度值(A值)。
1.4.5 碱性磷酸酶活性检测将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以5×107 L-1 的细胞浓度接种于6孔板，每孔加入1 mL细胞悬液，24 h细胞贴壁后按1.4.4分组进行干预，每组设置3个复孔。培养 1，4，7 d时弃原培养液，每孔再加入细胞裂解液200 μL，充分裂解，收集细胞，离心机离心后取上清液，按说明书进行操作，酶标仪测定405 nm波长下的吸光度值(A值)。
1.4.6 RT-qPCR检测各组细胞骨钙蛋白mRNA的表达将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞以5×107 L-1 的细胞浓度接种于6孔板，每孔加入1 mL细胞悬液，24 h细胞贴壁后按1.4.4分组进行干预。培养7 d后，按照总RNA提取试剂盒的说明提取总RNA，用紫外-可见光分光光度计测定提取的总RNA 纯度，经测定得各组的 A260 ∶A280值均为1.8-2.1，表明各组的总RNA纯度较高。
用反转录试剂盒合成 cDNA。目的基因骨钙蛋白引物及内参GAPDH由上海生工生物公司合成(表1)，采用荧光染料法行实时定量反转录聚合酶链反应，根据 SYBR Premix Ex Taq 说明选择20 μL 体系：上游引物 0.8 μL，下游引物0.8 μL，SYBRⅡ 10 μL，DEPC水6.8 μL，RT反应液1.6 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，45个循环。绘制荧光信号熔解曲线分析，实时定量反转录聚合酶链反应结果用荧光阈值表示；依据公式(2-∆∆Ct)计算目的基因表达量，假定对照组的基因表达量为 1，计算各组基因的相对表达量。

1.5 主要观察指标各组细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨钙蛋白mRNA表达
1.6 统计学分析数据运用SPSS 21.0软件进行统计学分析，结果用x±s表示。实验组组间两两比较采用t检验，组间差异采用单因素方差分析，以P < 0.05为检验水准。

讨论

与传统材料相比，纳米材料因具有良好的性能而被广泛应用。由静电纺丝技术制备的纳米纤维在很多性能上较普通材料优越，比如纤维直径均一、高比表面积、高孔隙率等特点，因此被广泛应用于生物医用材料、纳米传感器等各种领域。纳米技术制备的静电纺丝膜具有类似天然细胞外基质的三维立体结构，因其良好的生物学性能现在已被广泛应用于临床[19-20]。静电纺丝支架具有三维立体和疏松多孔的结构，有助于细胞的黏附与并为其提供足够的生长空间[21]。在材料的选择上，电纺丝因其应用于临床所以需要选择生物相容性好的材料，聚己内酯作为一种生物材料已得到美国食品及药物管理局(FDA)的批准，因其有着高弹性、良好的生物相容性和生物降解性等优点成为目前最常用的基质材料[22-23]。桂皮醛作为一种中药提取剂可以抑制炎性细胞因子的产生，提供抗菌活性，目前临床上主要用于抗炎。有学者以双侧卵巢切除的雌性大鼠为实验对象，用不同剂量的桂皮醛进行干预，最后取股骨远端进行苏木精-伊红染色、显微CT扫描和免疫组织化学分析等，结果表明桂皮醛可促进碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原的表达[24]。并且作者所在团队在之前的研究中也发现，桂皮醛对于高糖环境下成骨细胞的增殖分化具有促进作用，且在质量浓度为20 mg/L时促进效果最佳[25]。基于电纺丝膜作为载体的良好性能，实验以静电纺丝作为支架的同时进行桂皮醛药物干预，旨在观察两者是否具有协同作用，为临床载体及药物选择提供理论依据及数据支持[26]。
通过扫描电镜观察静电纺丝薄膜支架呈相互交错的网状结构，类似细胞外基质的三维支架立体结构增加了细胞附着的表面积，也为细胞的生长提供了空间[27]。CCK-8细胞增殖结果显示，以静电纺丝薄膜支架作为载体同时加以20 mg/L桂皮醛进行药物干预时细胞的增殖作用最为明显，纯药物组次之，表明在静电纺丝和桂皮醛的共同干预下可以更好地促进成骨细胞的增殖。碱性磷酸酶活性是检测成骨细胞早期分化的重要指标[28]。实验结果表明，在电纺丝膜上加载20 mg/L桂皮醛时对碱性磷酸酶活性的促进作用最为明显，说明在两者共同作用下对成骨细胞的早期分化具有更好的促进作用。骨钙蛋白代表成骨细胞的活性，同时也是成骨的重要标记物之一[29]。FERRON等[30]发现当患者血糖浓度越高时骨钙蛋白的表达越低，说明高糖环境可以抑制骨钙蛋白的表达水平[31-32]，从而影响成骨细胞的增殖和分化。作者所在团队在前期实验时发现桂皮醛可以减少高糖环境对骨钙蛋白表达的抑制作用[33]。实验以静电纺丝薄膜为支架的同时进行桂皮醛干预，发现对骨钙蛋白的促进作用比纯药物组更为明显，说明在以静电纺丝膜为载体的情况下桂皮醛对成骨细胞的增殖和分化促进作用更明显。
静电纺丝膜作为载体具有较大的比表面积和类似于细胞外基质的三维立体结构，使细胞更好地附着生长，此次实验中在相同质量浓度桂皮醛作用下，因载体的作用使其对成骨细胞的增殖分化促进作用更明显，因此静电纺丝支架与桂皮醛对成骨细胞的增殖与分化具有协同促进作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Effect of cinnamaldehyde on osteoblasts in high glucose environment with the electrospinning membrane as a carrier

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