A、B组的膝关节滑膜可见大量血管生成，血管附近伴有较为严重的炎症细胞浸润现象，且滑膜衬里细胞层明显增加，排列紊乱，滑膜增厚；C、D、E组的膝关节滑膜血管数量明显较少(P < 0.05)，炎症细胞浸润较轻(P < 0.05)，其中C、D组滑膜衬里细胞层轻度增多，E组表现较为正常的1-3层，且具有最低的血管密度(P < 0.05)。各组大鼠膝关节滑膜组织炎症细胞浸润评分，见图2。各组大鼠膝关节滑膜组织血管密度，见图3。







2.2.2   免疫组织化学染色结果   膝关节滑膜血管内皮生长因子、Notch1免疫组织化学切片所示，血管内皮生长因子蛋白主要表达于胞浆和血管周围，Notch1蛋白主要表达于细胞膜、细胞核和血管周围，见图4，5。

多重比较显示，C、D、E组滑膜切片中的血管内皮生长因子、Notch1蛋白阳性表达评分均低于A组(血管内皮生长因子：P < 0.001，P=0.001，P < 0.001；Notch1：均为P < 0.001)、B组(血管内皮生长因子：P均< 0.001；Notch1：P=0.017，P=0.033，P=0.001)；C、D组血管内皮生长因子、Notch1阳性表达评分均高于E组(血管内皮生长因子：P=0.013，P < 0.001；Notch1：P=0.040，P=0.019)；C组和D组之间的血管内皮生长因子、Notch1蛋白阳性表达评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。



2.3   各组大鼠膝关节软骨及软骨下骨组织学观察    
2.3.1   苏木精-伊红染色结果   见图7。

A组大鼠软骨结构完全紊乱，局部软骨损伤至软骨下骨，软骨细胞形态异常，软骨和软骨下骨交界区明显可见多处血管生成，潮线完全消失。B组大鼠软骨结构紊乱，软骨损伤至辐射层以及钙化层，潮线不可见，软骨和软骨下骨交界区可见血管生成，严重侵袭并破坏软骨结构，潮线基本消失。C组大鼠软骨表面局部表现粗糙，软骨结构较为完整，细胞形态较为正常，软骨及软骨下骨交界区未见明显血管侵袭，潮线模糊可见，但整体相对上移且局部向上突出，移行层和辐射层部分软骨基质的伊红染色较淡，提示可能有轻度软骨基质流失。D组大鼠软骨表面略为粗糙，软骨结构相对完整，细胞形态相对正常，局部辐射层细胞数量减少，软骨及软骨下骨交界区未见血管侵袭，潮线不清晰。E组大鼠软骨表面略为粗糙，软骨结构完整，层次分明，软骨细胞形态较为正常，软骨及软骨下骨交界区未见明显血管侵袭，潮线较为清晰且平滑规整，但可见轻度双重潮线现象。
2.3.2   番红O-固绿染色结果   见图8。

A组大鼠软骨番红O几乎未见着色，且软骨组织出现空洞，提示软骨基质流失严重；B组大鼠软骨番红O同样未见着色，且软骨及软骨下骨交界区域血管侵袭部位可见空洞，该组大鼠软骨基质流失情况与模型组类似。C组大鼠软骨番红O染色优于A、B组，但移行层和辐射层染色稍淡，潮线整体上移且局部向上突出，表现与苏木精-伊红染色结果一致，提示该组软骨基质的轻度流失。D组大鼠软骨番红O染色较C组略深，但潮线不规整，提示钙化层向非钙化层的侵袭。相较于其他组，E组大鼠软骨番红O染色整体最深，潮线最为清晰平滑，但能清晰地看到轻度双重潮线现象，表现与苏木精-伊红染色结果一致，提示可能具有轻微的辐射层软骨基质流失。
2.3.3   OARSI评分   见图9。

C、D、E组的软骨OARSI评分均低于A组(P < 0.001，P=0.001，P < 0.001)和B组(P均< 0.001)；C、D组的软骨OARSI评分均高于E组(P=0.025；P=0.009)；C组和D组之间的软骨OARSI评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.3.4   免疫组织化学染色结果  膝关节软骨及软骨下骨血管内皮生长因子、Notch1免疫组化切片所示，血管内皮生长因子蛋白主要表达于软骨细胞胞浆和侵蚀软骨的血管周围；Notch1蛋白主要表达于细胞膜、细胞核和血管周围，见图10，11。

多重比较显示，C、D、E组软骨及软骨下骨切片中的血管内皮生长因子、Notch1蛋白阳性表达评分均低于A组(血管内皮生长因子：P均< 0.001；Notch1：P=0.002，P=0.001，P < 0.001)、B组(血管内皮生长因子：P均< 0.001；Notch1：P=0.009，P=0.004，P < 0.001)；C、D组的血管内皮生长因子、Notch1阳性表达评分均高于E组(血管内皮生长因子：P=0.004，P=0.002；Notch1：P=0.002，P=0.006)；C组和D组之间的血管内皮生长因子、Notch1蛋白阳性表达评分表差异无显著性意义(P > 0.05)，见图12。

骨关节炎是一种临床常见的退行性关节疾病，通常涉及关节内滑膜增生、关节软骨退化及软骨下骨异常重塑等病理改变[1]，膝关节是最常见的发病关节之一，随着疾病进展导致的损伤和疼痛严重影响了患者的步行能力和生活质量，但膝骨关节炎的发病机制目前尚不清楚。近年来，血管新生已成为膝骨关节炎研究中被日益重视的病理特征，病理性的血管新生主要发生于膝骨关节炎患者的膝关节滑膜、软骨和软骨下骨交界等区域[2]。受炎症刺激，滑膜组织产生各种促血管生成因子促使新生血管的发育成熟，这些成熟血管分泌的相关因子又稳定甚至加重了膝关节微环境的炎症，进而促进了膝骨关节炎的进展[3]。而在软骨及软骨下骨，血管新生和异常骨重塑共同参与软骨下骨微环境病理改变，促进新生血管影响到关节软骨，导致软骨的退变和关节疼痛[4]。血管内皮生长因子是生理性和病理性血管新生的基本调节因子，几乎参与膝骨关节炎各组织血管新生的每一个环节[2]。关节内抑制血管内皮生长因子，通过预防关节软骨内血管新生有效减轻了大鼠的创伤后膝骨关节炎[5]。Notch信号转导通路是一条与血管内皮生长因子和血管新生有关的高度保守的细胞间通路，通过血管内皮生长因子激活的Notch信号(主要为Notch1参与)反过来也可以影响血管内皮生长因子的表达，这种相互作用在血管新生中发挥着至关重要的作用[6-7]。  

  川芎嗪是一种具有改善微循环作用的活性生物碱，主要提取于中药川芎。课题组在前期研究中发现川芎嗪对早期膝骨关节炎大鼠软骨有保护作用，且川芎嗪可能通过上调大鼠软骨和软骨下骨中miR-20b-5p和抑制血管内皮生长因子的mRNA及蛋白表达，减轻膝骨关节炎症状[8-10]。基于血管内皮生长因子相关研究展示的miR-20b-5p抗血管新生作用[11-12]，作者推测川芎嗪和miR-20b-5p可能参与调控了血管内皮生长因子/Notch途径介导的膝关节各组织血管新生。因此，此次实验旨在通过滑膜、软骨和软骨下骨等组织病理切片观察，初步探讨川芎嗪和过表达miR-20b-5p在多组织上对血管内皮生长因子/Notch介导的血管新生的可能影响，阐释川芎嗪和过表达miR-20b-5p可能延缓膝骨关节炎进展的整体作用效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，主要统计方法为单因素方差分析和秩和检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年2-4月在广州中医药大学实验动物中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物    健康雄性SD大鼠25只，SPF级，体质量(200±20) g，购于广州中医药大学实验动物中心。所有大鼠饲养于实验动物中心的SPF环境，环境温度为20-25 ℃、湿度65%、12 h光照/黑暗交替，给予SPF饲料，自由进食和饮水。实验由广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为20200811001，环境许可证号为No.00256348。实验过程遵循了《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   主要试剂耗材   miR-20b-5p agomir(干预相关药物rno-miR-20b-5p的成熟体序列为：CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG)、agomir NC(广州锐博)；磷酸川芎嗪片(丽珠，国药准字H44024348)；木瓜蛋白酶(BioFroxx，1364GR005)；L-半胱氨酸盐酸盐(BioFroxx，1207GR025)；40 g/L多聚甲醛溶液(Biosharp，BL539A)；苏木精-伊红染液(碧云天，C0105S)；番红O-固绿染色液(Servicebio，G1053)；兔抗血管内皮生长因子抗体(博奥森，bs-1665R)；兔抗Notch1抗体(博奥森，bs-1335R)；HRP标记山羊抗兔IgG(Servicebio，GB23303)；DAB显色剂(Servicebio，G1211)；EDTA抗原修复液(博士德，AR0023)。
1.3.3   主要仪器设备   病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)；载玻片及盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司，10212432C)；脱水机(武汉俊杰电子有限公司，JJ-12J)；脱色摇床(其林贝尔，TS-1000)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，JB-P5)；光学显微镜(Olympus BX53)。
1.4   实验方法   
1.4.1   早期膝骨关节炎大鼠造模   根据课题组前期实验方法[13]，将25只大鼠采用木瓜蛋白酶与L-半胱氨酸混合溶液左膝关节腔注射的方式进行早期膝骨关节炎模型建造。在末次注射之后，使大鼠于1周内跑步3 d(10 min/次，第1，4，7天跑步)，随后确定造模成功。参照骨关节炎软骨组织病理学评价系统(OARSI)评分标准[14]，膝骨关节炎具有软骨退化等明显病理特征，观察模型组织切片以确定造模成功。

1.4.2   早期膝骨关节炎模型干预   于早期膝骨关节炎大鼠造模成功后第2天，将造模成功的25只大鼠利用随机抽签法分5组，每组5只。A组膝关节腔注射生理盐水于0.2 mL+灌胃给予生理盐水5 mL/kg，B组膝关节腔注射agomir NC，C组膝关节腔注射miR-20b-5p agomir，D组灌胃给予川芎嗪+膝关节腔注射agomir NC，E组灌胃给予川芎嗪+膝关节腔注射miR-20b-5p agomir。膝关节腔注射为单次给药，灌胃给药为1次/d，连续灌胃4周。

将每5 nmol的miR-20b-5p agomir或agomir NC药物溶于0.2 mL生理盐水，用于膝关节腔注射。膝关节腔注射完成的第2天，进行灌胃给药。将500 mg的磷酸川芎嗪片溶于温水中，充分摇匀，获得10 g/L的川芎嗪混悬液，待冷却后，再次摇匀并迅速抽取灌胃量的混悬液进行灌胃，灌胃剂量为5 mL/kg。
1.4.3   取材   灌胃结束后，使用3%戊巴比妥钠溶液麻醉并处死各组大鼠，使用骨剪剪断股骨与胫腓骨骨干，取下大鼠完整左膝关节，剪刀轻轻除去关节囊外肌肉、韧带等多余软组织，然后将左膝关节浸没于40 g/L多聚甲醛中固定以备制作石蜡切片。
1.4.4   石蜡切片制备   左膝关节组织于40 g/L多聚甲醛中固定72 h以后，取出组织置于通风橱修平整，随后转移组织到脱水盒，放进脱水机。依次使用体积分数75%乙醇(4 h)、体积分数90%乙醇(2 h)、体积分数95%乙醇(1 h)、无水乙醇Ⅰ(30 min)、无水乙醇Ⅱ(30 min)、醇苯(5-10 min)、二甲苯Ⅰ(5-10 min)、二甲苯Ⅱ(5-10 min)、蜡Ⅰ(1 h)、蜡Ⅱ(1 h)、蜡Ⅲ(1 h)进行脱水透明浸蜡。随后于包埋机内包埋，待石蜡冷却凝固后取出蜡块于切片机上切片，厚度4 μm。将切片在温水中展平，最后置于载玻片上，烤片后取出常温保存备用。
1.4.5   苏木精-伊红染色   依次以二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯Ⅱ(20 min)、无水乙醇Ⅰ(5 min)、无水乙醇Ⅱ(5 min)、体积分数90%乙醇(5 min)、体积分数80%乙醇(5 min)、体积分数70%乙醇(5 min)、蒸馏水(5 min)进行脱蜡至水。将切片浸入苏木精染液3-8 min，取出切片并使用蒸馏水将染液冲洗干净，盐酸分化，再次冲洗，氨水返蓝，冲洗干净后置入伊红染液1-3 min。最后将切片依次以体积分数95%乙醇Ⅰ(5 min)、体积分数95%乙醇Ⅱ(5 min)、无水乙醇Ⅰ(5 min)、无水乙醇Ⅱ(5 min)、二甲苯Ⅰ(5 min)、二甲苯Ⅱ(5 min)进行脱水透明，中性树胶封固。
1.4.6   番红O-固绿染色   切片常规脱蜡至水后浸入固绿染液约10 min，蒸馏水冲洗至软骨无色，分化并再次冲洗干净后，置入番红O染液中30 s进行染色。最后常规脱水透明，中性树胶封固。
1.4.7   血管内皮生长因子及Notch1免疫组织化学染色   切片常规脱蜡至水后，浸入EDTA抗原修复缓冲液进行抗原修复(微波炉内中火5 min，转低火10 min，中间停火5 min)。自然冷却后将切片移至PBS洗涤3次(5 min/次)。随后再将切片置于体积分数3%过氧化氢溶液避光孵育30 min，完成后再次洗涤。组化笔圈住目标染色组织以防抗体流失，滴上3%BSA室温封闭30 min。以3% BSA稀释血管内皮生长因子、Notch1一抗(稀释比例1∶200)，然后在已圈好组织分别滴加血管内皮生长因子或Notch1一抗，使其完全覆盖目标组织。移动切片至湿盒内4 ℃孵育过夜，次日使用PSB清洗切片并重复上述操作，滴加相应二抗(稀释比例1∶200)，室温孵育30 min。洗涤切片，滴加DAB显色液，显色1 min左右，蒸馏水洗涤以终止显色。最后使用苏木精染液复染2 min，蒸馏水洗涤干净后脱水封固。
1.4.8   组织切片分析   苏木精-伊红染色切片中细胞核蓝色，细胞质红色，软骨基质呈现淡粉色。参考MOULD等[15]和陈永等[16]的方法于各组滑膜苏木精-伊红染色切片上计算病变严重区域血管密度及炎症细胞浸润程度。炎症细胞浸润程度：无炎症细胞=0；炎症细胞轻度浸润=1；炎症细胞中度浸润=2；炎症细胞重度浸润=3。采用OARSI评分对软骨组织切片进行评分(胫骨平台外侧髁区域)，见表1。

番红O-固绿染色切片中软骨呈红色或橙红色，软骨及软骨下骨钙化区域呈现一定程度绿色。

免疫组织化学染色切片中，相关蛋白阳性表达为黄色或棕黄色。通过Image J软件的IHC Profiler插件对各组免疫组织化学切片进行阳性表达强度及面积的综合评分[17]。评分规则为：H得分=强阳性百分比×3+阳性百分比×2+弱阳性百分比×1，得分越高，则相关蛋白在组织中阳性表达越高。
1.5   主要观察指标   各组大鼠膝关节滑膜组织切片的血管密度、炎症细胞浸润程度，软骨及软骨下骨组织切片的软骨基质流失程度及OARSI评分，所有组织免疫组织化学切片的血管内皮生长因子/Notch1蛋白阳性表达情况。
1.6   统计学分析   统计分析采用SPSS 26.0软件，统计图表绘制采用GraphPad Prism 8软件。此研究所得数据为计量资料，采用W 检验和Levene法进行正态性检验并分析方差齐性。数据为正态分布且方差齐时采用单因素方差分析进行比较，多重比较选用LSD法；数据为正态分布但方差不齐时采用Dunnett’s T3法进行比较。对于不满足正态分布的数据，采用秩和检验进行多组间比较。以P < 0.05认为差异有显著性意义。文章统计学方法已经广州中医药大学统计学专家审核。

血管新生是指从旧血管基础上延伸出新的血管，生理状态下一般发生于胚胎的生长发育、伤口愈合和女性生殖周期等活动[18]。多项研究显示，血管新生在膝骨关节炎发病进展中扮演着重要的角色并表现于滑膜、软骨及软骨下骨病变方面。滑膜组织在生理状态下具有高度血管化的特征，并通过分泌滑液为无血管的关节软骨提供营养和氧气，但发生骨关节炎时，抗血管生成因子和促血管生成因子之间失衡，导致血管内皮细胞增殖的增加，促进了更多的血管新生[19]。膝骨关节炎进展的早期阶段，滑膜血管新生可能更加严重。BENITO等[20]发现相较于晚期膝骨关节炎患者，早期膝骨关节炎患者滑膜组织的免疫组化染色结果表现出更多的血管新生；此外，该实验结果还表明了早期膝骨关节炎患者滑膜组织中更多单核细胞浸润和炎症递质的过度表达，提示了在早期膝骨关节炎患者滑膜组织中血管新生和炎症之间的密切联系。滑膜炎症是膝骨关节炎的重要病理特征之一，滑膜组织中的滑膜成纤维细胞、单核细胞或巨噬细胞通过分泌相关基质金属蛋白酶(基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9等)和炎症细胞因子引起软骨损伤[21-23]。滑膜的炎症状态能够刺激血管新生，而新生的血管反过来又维持或促进了炎症[3]。抑制骨关节炎大鼠滑膜血管新生的同时，可以降低关节滑液中炎症因子(白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α)的水平[24]。与滑膜不同，软骨及软骨下骨交界区域的血管新生被认为与异常骨重塑有关，软骨下骨通过不断的骨重塑维持稳定，并给予关节软骨机械支撑；早期膝骨关节炎中，与骨重塑有关的破骨细胞分泌血小板衍生生长因子BB驱动病理性软骨下骨血管新生，改变软骨下骨微结构[25]。新生血管侵入关节软骨的非钙化层，不仅导致病理性软骨细胞肥大，使关节软骨退化，还可能刺激、引导感觉神经的生长，使感觉神经沿着血管穿过软骨钙化层，到达非钙化层甚至半月板，引起关节疼痛[26-28]。研究表明通过抑制过度激活的破骨细胞和软骨下骨病理性血管新生可维持软骨下骨微结构，减缓骨关节炎的进展[29]。因此，控制膝关节内滑膜、软骨及软骨下骨的血管新生，在减轻炎症、保护软骨及改善关节疼痛上具有重要意义。

课题组前期研究发现，早期膝骨关节炎模型大鼠软骨、软骨下骨中的miR-20b-5p表达均低于正常组大鼠，血管内皮生长因子mRNA及蛋白均高于正常组大鼠；且发现川芎嗪对早期膝骨关节炎大鼠软骨有保护作用，经过不同浓度川芎嗪治疗的早期膝骨关节炎大鼠软骨、软骨下骨中的miR-20b-5p表达相较模型组上调，血管内皮生长因子 mRNA及蛋白下调，提示软骨、软骨下骨中miR-20b-5p与血管内皮生长因子介导的血管新生之间可能存在一定关联[8-10]。有研究表明，川芎嗪可能通过影响软骨细胞增殖与凋亡、软骨基质合成与代谢和关节内各组织的炎症反应，从而发挥防治膝骨关节炎的作用[30]。MiR-20b-5p是具有抗血管新生功能的miRNA，通过靶向缺氧诱导因子、信号传导及转录激活蛋白3等多途径调控血管内皮生长因子的表达[31-33]。此外也有研究报道，miR-20b直接靶向血管内皮生长因子的 3′-UTR而负性调控其表达[34]。一项骨关节炎患者血浆miRNA关联性分析研究表明，miR-20b-5p可能通过调控血管新生参与骨关节炎进展[35]。虽然研究发现了负调控miR-20b/PTEN轴后软骨细胞凋亡及细胞外基质降解的增强[36]，但miR-20b在膝骨关节炎患者膝关节滑膜、软骨和软骨下骨血管新生中的作用仍不清楚。因此，作者在此次实验中进一步对膝骨关节炎大鼠分别单独使用川芎嗪、过表达miR-20b-5p和联合用药治疗，以探讨其在膝骨关节炎进展中的抗血管新生作用。此次实验结果表明，在使用川芎嗪或过表达mir-20b-5p agomir干预大鼠后，agomir组、川芎嗪+agomir NC组和川芎嗪+agomir组大鼠的膝关节滑膜血管、炎症浸润表现以及软骨基质流失、软骨OARSI评分均轻于模型组、agomir NC组大鼠，其中川芎嗪+agomir组表现最好，并且在表现较好的3个干预组的软骨及软骨下骨中均未见到明显血管侵袭软骨层。该结果提示过表达miR-20b-5p膝关节注射或川芎嗪灌胃可能减轻早期膝骨关节炎大鼠滑膜组织的血管新生和炎症细胞浸润，以及软骨、软骨下骨组织的退变和血管侵袭现象，从多种组织上改善病理状况以抑制膝骨关节炎的进展，且在联合应用两种干预后这种效果更加明显。此外，基于前期研究中川芎嗪干预后软骨、软骨下骨血管内皮生长因子 mRNA及蛋白的改变，此次实验还探讨了血管新生相关血管内皮生长因子和Notch1蛋白在川芎嗪和过表达miR-20b-5p干预后大鼠滑膜、软骨和软骨下骨中的免疫组化情况，以探讨川芎嗪和过表达miR-20b-5p发挥作用的机制。

血管内皮生长因子是血管新生的标志性调节因子。研究显示，血管内皮生长因子在膝骨关节炎患者滑膜衬里细胞和软骨细胞中高表达，与膝骨关节炎的严重程度呈现正相关[37]。软骨细胞分泌释放的血管内皮生长因子以入侵的内皮细胞作为靶标，积极参与肥大软骨新生血管形成[38]。此外，血管内皮生长因子还参与软骨及软骨下骨区域的“血管生成-成骨耦合”。激活软骨细胞中的雷帕霉素复合体机制性靶点能够促进血管内皮生长因子分泌至软骨下骨，并刺激H型血管形成[39]。而H型血管被报道具有消化软骨基质的能力[40]。抑制异常H型血管的生成可以改善软骨下骨微环境，减轻关节软骨的退化[41]。已有许多通过抑制滑膜或软骨下骨中血管内皮生长因子依赖的血管生成进而减轻骨关节炎的报道[42-45]，但较少有人关注Notch信号通路在此发挥的作用。Notch信号通路是一条能够调节多种细胞分化、增殖和凋亡的高度保守的细胞间信号通路，被发现与血管新生密切相关[46]。经典Notch信号的转导主要与Notch受体(哺乳动物为Notchl、Notch2、Notch3和Notch4)、Notch配体(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged 2)和下游转录因子CSL(人类为Cbf1)有关，激活的Notch信号通过HES1和Hey1等效应器负调控下游靶基因在不同组织中的表达[47]。Notch1是参与血管新生的主要形式，与Notch配体DLL4或Jagged1的相互作用介导着血管新生[48-49]。研究显示，DLL4可能是血管内皮生长因子介导的血管生成的负性调节因子，血管内皮生长因子与Notch信号通路之间的相互作用是血管新生过程中重要组成部分[50]。一方面，血管内皮生长因子可以促进Notch受体的表达，从而进一步激活Notch信号通路；另一方面，Notch信号与血管内皮生长因子受体具有一定的交叉作用，可以反过来影响血管内皮生长因子的表达[51-52]。据报道，中药成分骨碎补总黄酮在大鼠缺损模型中激活上调Notch1、Hes1表达的同时也促进了血管内皮生长因子和CD31的表达，展示出影响“血管生成-成骨耦合”的能力[53]。而抑制Notch1可以有效阻断血管内皮生长因子/血管生成素2诱导的滑膜组织血管生成，以及脂肪来源干细胞异位成骨时血管内皮生长因子的表达[54-55]。此次实验免疫组化染色结果显示，模型组、agomir NC组大鼠滑膜、软骨及软骨下骨之中的血管内皮生长因子、Notch1蛋白阳性表达明显高于agomir组、川芎嗪+agomir NC组和川芎嗪+agomir组，且前两组中均可见血管内皮生长因子、Notch1表达于血管周围。而采用川芎嗪或过表达mir-20b-5p减轻滑膜、软骨及软骨下骨血管新生的同时，还抑制了这些组织中血管内皮生长因子、Notch1蛋白的表达，这在一定程度上提示了川芎嗪和过表达mir-20b-5p可能在早期膝骨关节炎大鼠滑膜、软骨及软骨下骨中通过抑制血管内皮生长因子/Notch1途径介导的血管新生进而达到缓解膝骨关节炎进展的效果。虽然也有研究报道了Notch信号通路在关节软骨中具有双重作用[56]，即持续的Notch信号通路在关节软骨导致早期骨关节炎病理进展，而短暂的Notch信号激活促进软骨基质的合成，维护软骨的生理环境。此次实验通过川芎嗪联合过表达miR-20b-5p更加抑制软骨及软骨下骨区域Notch1蛋白后，仍然表现出较好的软骨保护作用(软骨基质流失最轻)，作者推测这可能是因为川芎嗪联合过表达miR-20b-5p对疾病进展同时期的滑膜血管新生及炎症状态改善较为明显，导致滑膜对软骨及软骨下骨的损伤作用减弱，进而间接保护了软骨及软骨下骨。

总而言之，此次实验结果表明，在早期膝骨关节炎大鼠滑膜、软骨及软骨下骨中，川芎嗪和过表达miR-20b-5p可能通过抑制血管内皮生长因子/Notch1介导的血管新生在一定程度上改善多方面的组织学表现，抑制早期膝骨关节炎进展。

实验也有一定不足之处：通过组织学观察初步探讨了川芎嗪和miR-20b-5p对早期膝骨关节炎滑膜、软骨和软骨下骨的保护作用，以及对血管内皮生长因子/Notch蛋白介导的血管新生的可能抑制效果，但尚未进行PCR、Western blot等实验以更加明确这种抑制作用；并且结合作者前期实验结果来看，川芎嗪对miR-20b-5p的表达水平可能也具有一定的上调作用，川芎嗪是否直接通过上调miR-20b-5p从而发挥靶向调控血管内皮生长因子/Notch影响血管新生并不清楚，这有待进一步地探讨验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
软骨：膝关节相连骨表面的一层透明软骨，具有吸收缓冲应力的作用，一般认为其营养来源于滑膜分泌的滑液和软骨下骨的血供系统。膝骨关节炎的进展主要表现为软骨的损伤，也常伴随着滑膜、软骨下骨病变。
Notch信号转导通路：是一条与血管内皮生长因子和血管新生有关的高度保守的细胞间通路，通过血管内皮生长因子激活的Notch信号(主要为Notch1参与)反过来也可以影响血管内皮生长因子的表达，这种相互作用在血管新生中发挥着至关重要的作用。
血管新生：从旧血管系统基础上延伸出新的血管，该过程涉及多种细胞及分子，生理和病理状态下均可以发生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

川芎嗪是提取于活血化瘀重要川芎的一种活性生物碱，具有改善微循环、减轻骨内压的作用。大量研究显示了川芎嗪在肿瘤、肝纤维化等疾病中的抗血管新生作用，但在骨关节炎研究中报道较少。团队前期实验表明，川芎嗪改善膝骨关节炎大鼠软骨及软骨下骨血管新生的同时还上调了miR-20b-5p的表达。miR-20b-5p被报道靶向负调控血管内皮生长因子蛋白，然而miR-20b-5p是否通过抑制血管内皮生长因子及其下游因子在膝骨关节炎滑膜、软骨和软骨下骨中发挥抗血管新生作用尚未见相关报道。因此，此次实验将川芎嗪、miR-20b-5p与血管内皮生长因子/Notch信号转导通路联系起来，分别采用川芎嗪和miR-20b-5p对膝骨关节炎大鼠进行干预，观察了膝关节滑膜、软骨和软骨下骨的病理改变，表明了川芎嗪和过表达miR-20b-5p对血管内皮生长因子/Notch1介导的血管新生的可能抑制作用，为防治膝骨关节炎等衰老性骨疾病提供一定的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程