2.1   实验动物数量分析   实验共纳入SD大鼠12只，分为4组，实验过程无动物死亡，全部进入结果分析。
2.2   软骨及软骨下骨组织学观察及OARSI评分   病理切片见图1，空白组软骨表面光滑无裂隙，软骨结构清晰，各层软骨细胞排列规律整齐，细胞形态正常，潮线平滑且清晰可见(箭头①，②)，软骨基质染色均匀，软骨下骨未见大量明显血管生成；模型组软骨可见软骨结构完整性被破坏，潮线完全不可见，软骨基质大量流失，形成空洞，可见血管侵袭(箭头③，④)；miR-20b agomir NC组软骨表层及移行层完全撕裂(箭头⑤，⑥)，软骨细胞形态异常，潮线不可见，软骨基质流失严重；miR-20b agomir组软骨表面局部粗糙，组织结构相对完整清晰，局部可见软骨细胞密集，细胞形态相对正常，潮线清晰可见，但部分区域有上移情况(箭头⑦，⑧)，显示钙化层有所增厚，软骨基质染色相比空白组减轻但优于模型组及miR-20b agomir NC组，软骨及软骨下骨接近软骨钙化层区域未见过多小型血管。



OARSI评分见图2，miR-20b agomir组OARSI评分明显低于模型组和miR-20b agomir NC组(P=0.029，P=0.021)；模型组与miR-20b agomir NC组的OARSI评分相比差异无显著性意义(P > 0.05)。



2.3   软骨及软骨下骨组织免疫组织化学结果    免疫组织化学切片所示：HIF-1α及VEGF蛋白主要表达于软骨细胞的细胞核、细胞质以及软骨下骨的血管内，阳性表达呈棕黄色，见图3，4。



软骨及软骨下骨的HIF-1α免疫组化切片中，相较于空白组，模型组、miR-20b agomir NC组和miR-20b agomir组的平均吸光度更高(P < 0.001，P < 0.001，P=0.044)，表达程度更高，差异有显著性意义；而相对于模型组和miR-20b agomir NC组，miR-20b agomir组的平均吸光度较低，差异有显著性意义(P < 0.001，P < 0.001)。
软骨及软骨下骨的VEGF免疫组化切片中，模型组、miR-20b agomir NC组的平均吸光度均高于空白组(P < 0.001，P < 0.001)和miR-20b agomir组(P < 0.001，P < 0.001)，差异有显著性意义；而空白组与miR-20b agomir组之间的平均吸光度相比差异无显著性意义(P > 0.05)；模型组与miR-20b agomir NC组之间的HIF-1α、VEGF免疫组化平均吸光度相比差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图5及表2。



2.4   HIF-1α及VEGF mRNA表达   软骨中，模型组、miR-20b agomir组、miR-20b agomir NC组的HIF-1α及VEGF mRNA表达水平均高于空白组(P < 0.001，P < 0.001，P < 0.001，P < 0.001，P < 0.001，P < 0.001)，差异有显著性意义。miR-20b agomir组的HIF-1α及VEGF mRNA表达水平低于模型组(P < 0.001，P < 0.001)和miR-20b agomir NC组(P < 0.001，P < 0.001)，而模型组和miR-20b agomir NC组之间的表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3及图6。



软骨下骨中，模型组、miR-20b agomir NC组的HIF-1α及VEGF mRNA表达水平均高于空白组(P < 0.001，P < 0.001)和miR-20b agomir组(P < 0.001，P < 0.001)，差异有显著性意义。而空白组和miR-20b agomir组之间、模型组和miR-20b agomir NC组之间的HIF-1α及VEGF mRNA表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3及图7。



2.5   HIF-1α及VEGF 蛋白表达   软骨中，模型组、miR-20b agomir组、miR-20b agomir NC组的HIF-1α蛋白表达水平均高于空白组(P < 0.001，P < 0.001，P < 0.001)，HIF-1α表达由低到高分别为miR-20b agomir组、模型组、miR-20b agomir NC组(P < 0.001，P < 0.001，P < 0.001)，差异有显著性意义。模型组、miR-20b agomir NC组的VEGF蛋白表达水平均高于空白组(P < 0.001，P < 0.001)，差异有显著性意义；而miR-20b agomir组与空白组的VEGF蛋白表达水平相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8，9。



软骨下骨中，模型组、miR-20b agomir NC组的HIF-1α蛋白表达水平均高于空白组(P < 0.001，P=0.001)，miR-20b agomir组的HIF-1α蛋白表达低于于空白组(P=0.007)，差异有显著性意义。模型组、miR-20b agomir NC组的VEGF蛋白表达水平均高于空白组(P=0.009，P < 0.001)，差异有显著性意义；而miR-20b agomir组与空白组的VEGF蛋白表达水平相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图10。

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膝骨关节炎是一种流行程度较高的膝关节退行性疾病，其主要以膝关节软骨的变性、破坏及关节周围骨质增生为特点[1]，常见于中老年人。随着国内社会老龄化的加剧，膝骨关节炎的发病率每年以惊人速度增长，而终末期膝骨关节炎患者往往需要行膝关节置换治疗，这将给社会医疗带来沉重的负担，因此如何早期防治膝骨关节炎成为当前的研究热点。近年来，膝骨关节炎患者的软骨下骨重塑及血管新生备受重视。早期膝骨关节炎涉及软骨及软骨下骨的病理改变，特别是骨与软骨的交界区。基于膝骨关节炎病理环境下软骨下骨微环境及软骨内成骨的异常，血管容易侵袭软骨的非钙化区，促进膝骨关节炎的进展和骨赘的形成[2]。而在这种骨形成-血管生成的失衡中，缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)发挥着至关重要的作用[3]。VEGF是血管生成的标志性调节因子，在成骨细胞和软骨细胞中产生，被转录激活因子HIF-1α严格调控[4]。因此，通过调控HIF-1α/VEGF以控制血管新生可能是延缓早期膝骨关节炎进展的有效手段。MicroRNA(miRNA)是一种具有调节人体生理、病理功能的小的单链非编码RNA。既往研究中，miR-20b-5p被报道可以在肿瘤细胞中靶向调控HIF-1α和VEGF[5]。作者所在课题组前期的相关研究发现，microRNA-20b-5p(miR-20b-5p)和VEGF mRNA及蛋白的表达可能与早期膝骨关节炎的进展有关[6-7]。但miR-20b-5p
是否能通过膝关节内干预，影响早期膝骨关节炎病理环境中软骨及软骨下骨的血管新生、保护关节软骨是目前关注的问题。

此次研究拟通过建立早期膝骨关节炎模型及miR-20b-5p激动剂关节内注射干预，观察干预后软骨及软骨下骨的组织病理学变化以及血管新生相关因子HIF-1α/VEGF的mRNA和蛋白表达，探讨miR-20b-5p对早期膝骨关节炎关节软骨、软骨下骨血管新生及关节软骨保护的可能机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，采用方差分析及非参数检验的方法进行统计。
1.2   时间及地点   实验于2021年1-6月在广州中医药大学实验动物中心及岭南医学研究中心骨伤科实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物及伦理   健康SPF级雄性SD大鼠12只，体质量(200±20) g，购置于广州中医药大学实验动物中心，动物质量合格证号：NO.44005800012656，均饲养在标准SPF级环境中，自由进食SPF鼠粮，自由饮水。实验由广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20200811001。 
1.3.2   主要试剂耗材   1 mL注射器(上海双鸽，SG-ZSQ-1ML)，木瓜蛋白酶(BioFroxx，1364GR005)，L-半胱氨酸盐酸盐(BioFroxx，1207GR025)，miR-20b-5p agomir(广州锐博)，miR 20b-5p
agomir NC(广州锐博)，40 g/L多聚甲醛溶液(Biosharp，BL539A)，番红O-固绿染色液(Servicebio，G1053)，RIPA裂解液(弗德生物，FD008)，反转录试剂盒(DBI-2220，DBI)，BCA蛋白定量试剂盒(弗德生物，FD2001)，HIF-1α抗体(博奥森，bs-0737R 1∶200)，VEGF抗体(博奥森，bs-1665R 1∶200)，HRP标记山羊抗兔IgG(Servicebio，GB23303 1∶200)，HRP标记山羊抗鼠IgG(Jackson，115-035-003)，组化试剂盒DAB显色剂(Servicebio，G1211)，EDTA抗原修复液(博士德，AR0023)。
1.3.3   主要仪器设备   半自动轮式石蜡切片机(德国莱卡)，脱色摇床(其林贝尔)，脱水机(武汉俊杰)，包埋机(武汉俊杰)，正置光学显微镜(Olympus BX53)，实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)，凝胶成像系统(Tanon 4100)，台式离心机(Optima MAX-XP)。
1.4   方法   
1.4.1   实验分组   将大鼠适应性喂养后，采用SPSS 26.0软件的随机数字生成器法，从12只SD雄性大鼠中随机抽取3只作为空白组，其余9只进行早期膝骨关节炎大鼠模型建造。于造模成功后，将9只早期膝骨关节炎随机分为模型组、miR-20b agomir组、miR-20b agomir NC组，每组3只。最终分为空白组、模型组、miR-20b agomir组及miR-20b agomir NC组(n=3)。
1.4.2   早期膝骨关节炎大鼠造模   根据课题组前期实验方法[8]，给予9只SD雄性大鼠进行木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合溶液的膝关节腔注射，可以得到稳定的早期膝骨关节炎大鼠模型。具体操作为：提前配置好戊巴比妥钠溶液以及木瓜蛋白酶混合液(4%木瓜蛋白酶+0.03 mol/L L-半胱氨酸+生理盐水)。将大鼠禁食不禁水24 h后，使用3%的戊巴比妥钠以30 mg/kg对大鼠进行腹腔注射，两三分钟后大鼠进入麻醉状态。将大鼠仰卧于水平桌面，酒精棉球消毒膝关节区域，然后将大鼠双后膝关节屈曲约45°，于髌韧带下缘外上方越2 mm处进针，进针方向略偏向内后方，针尖有落空感即开始注射。注射分3次(第1，4，7天)，注射量为0.2 mL/(膝·次)。

1.4.3   早期膝骨关节炎模型干预   造模末次注射后，大鼠自由活动1周。随后使用造模相同的方式于大鼠双后膝关节内注射miR-20b-5p agomir及miR-20b-5p agomir NC等干预药物，所有药物采用5 nmol溶于0.2 mL生理盐水的方案进行配制。模型组、miR-20b agomir组、miR-20b agomir NC组分别于每膝注射0.2 mL生理盐水、miR-20b-5p agomir生理盐水溶液、miR-20b-5p agomir NC生理盐水溶液，注射操作仅进行1次。所用干预药物rno-miR-20b-5p的成熟体序列为：CAA AGU GCU CAU AGU GCA GGU AG。
1.4.4   取材   干预后4周收集实验标本，3%戊巴比妥钠麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠，用骨剪分别于股骨、胫骨1/2处剪断骨干，取完整左膝关节，去除关节囊外多余的软组织，完全浸泡在40 g/L多聚甲醛中制作石蜡切片。取大鼠右膝关节，用无菌手术刀打开关节囊，切断滑膜，刮除胫骨内外髁软骨。在去除软骨下骨外的骨皮质后，用咬骨钳取下所需软骨下骨。然后将上述材料置于-80 ℃备用。
1.4.5   石蜡切片制备   将组织从多聚甲醛固定液中取出，修整后放于脱水盒内，于脱水机中依次以体积分数75%乙醇(4 h)、90%乙醇(2 h)、95%乙醇(1 h)、无水乙醇Ⅰ(30 min)、无水乙醇Ⅱ(30 min)、醇苯(5-10 min)、二甲苯Ⅰ(5-10 min)、二甲苯Ⅱ(5-10 min)、蜡Ⅰ(1 h)、蜡Ⅱ(1 h)、蜡Ⅲ(1 h)进行脱水透明浸蜡。使用融化的石蜡在包埋机内将上述组织包埋，-20 ℃冷却凝固后取出修整蜡块，随后置于石蜡切片机上进行切片(厚度4 μm)。切片展平后，置于载玻片上，于烘箱内烤片后取出常温保存备用。 
1.4.6   番红O-固绿染色   依次以二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯Ⅱ(20 min)、无水乙醇Ⅰ(5 min)、无水乙醇Ⅱ(5 min)、体积分数75%乙醇(5 min)、自来水(1 min)进行脱蜡至水。将切片浸于固绿染液中约10 min，随后自来水冲洗切片直至软骨呈无色，分化液分化，再次使用自来水冲洗。然后将切片浸没于番红O染液中约25 s进行染色，最后将切片依次以体积分数95%乙醇Ⅰ(5 min)、95%乙醇Ⅱ(5 min)、无水乙醇Ⅰ(5 min)、无水乙醇Ⅱ(5 min)、二甲苯Ⅰ(5 min)、二甲苯Ⅱ(5 min)进行脱水透明，中性树胶封固。采用国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)“软骨病理评价系统”评分对每只大鼠病理切片的膝关节胫骨平台内、外侧区域软骨进行评价[9]。
1.4.7   HIF-1α及VEGF免疫组织化学染色   石蜡切片脱蜡至水后，浸没于EDTA抗原修复缓冲液中，置入微波炉进行抗原修复。室温下冷却，随后浸于PBS，脱色摇床洗涤3次。切片浸没于体积分数3%的H2O2溶液并避光孵育30 min，随后浸于PBS，脱色摇床洗涤3次。组化笔圈好组织，3% BSA室温封闭30 min，甩干并再次滴加3%BSA按照1∶200比例稀释的HIF-1α或VEGF抗体。4 ℃孵育过夜，次日使用PBS清洗干净。切片浸于PBS溶液，脱色摇床洗涤3次；甩干后圈内滴加二抗，室温孵育30 min；浸于PBS，脱色摇床洗涤3次；甩干后在圈内滴加DAB显色液，显色1 min左右后自来水冲洗终止显色；苏木精复染细胞核2 min，自来水冲洗；进行脱水封固。显微镜下随机选取5个带有软骨及软骨下的×400下视野进行拍摄(曝光度等参数相同)，使用image J软件对所拍摄图片进行平均吸光度分析。
1.4.8   实时荧光定量PCR检测软骨及软骨下骨中HIF-1α及VEGF mRNA表达   将组织剪碎并加入液氮后磨碎，Trizol裂解组织细粉，匀浆处理。离心(4 ℃，12 000 r/min)10 min后取上清至含有无RNA酶水的离心管中。前后分别加入三氯甲烷、异丙醇、体积分数75%的乙醇静置离心后得RNA沉淀，吸弃液体，吹干后加入无RNA酶水溶解RNA。根据反转录试剂盒说明书进行反转录操作得到cDNA。将PCR引物、cDNA模板、参考染料、ddH2O等混入0.2 mL PCR管构建反应体系。于PCR仪上进行扩增，2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达倍数，相关基因引物序列见表1。

1.4.9   Western blot检测软骨及软骨下骨中HIF-1α及VEGF蛋白表达   将组织剪碎并加入液氮后磨碎，加入适量RIPA裂解液(使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂)于冰上裂解组织细粉并匀浆，完全裂解后离心取上清转移至离心管。根据BCA蛋白定量试剂盒说明书操作计算样品蛋白浓度。将样品与适量5×SDS上样缓冲液混合后煮沸5 min变性，然后置于冰上3 min。配置10%和12%分离胶和5%浓缩胶，进行上样电泳和转膜。脱脂牛奶封闭，分别按照1∶1 000比例稀释VEGF、HIF-1α一抗，4 ℃孵育过夜；使用TBST于脱色摇床上洗涤3次；稀释二抗后，室温孵育30 min，脱色摇床上洗涤3次；化学发光显色后扫描存档胶片，Image J软件分析目标带的吸光度值。 
1.5   主要观察指标   干预后4周，取大鼠剔除皮肤、肌肉等组织的完整左膝关节制备石蜡切片，行番红O-固绿及HIF-1α、VEGF的免疫组织化学染色，并给予相关病理组织学评价及OARSI评分；取右膝关节软骨和软骨下骨组织，均利用实时荧光定量PCR及Western blot检测HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表达情况。
1.6   统计学分析   使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism 8软件进行图表绘制，所有计量资料采用表示。将数据进行正态性检验后分析方差齐性，符合正态且方差齐时，采用单因素方差分析进行多组间比较，事后比较采用Bonferroni法；当符合正态且方差不齐时，采用Dunnett’s T3法进行事后比较。数据不满足正态分布时，数值以均值±95%置信区间表示，采用非参数检验。P < 0.05则认为差异有显著性意义。

随着国内社会老龄化的加剧，与年龄显著相关的膝骨关节炎已成为威胁国内老年人肢体健康和生活质量的重要危险因素[10]。据报道，从1990-2017年，全球膝骨关节炎发病率和患病率分别增长了8.2%和9.3%，至2017年止，分别达到181.2/10万人和3 754.2/10万人[11]。但是临床上并没有能够有效逆转膝骨关节炎进展的手段，这与膝骨关节炎发病进展的具体机制尚不明确有一定关系。积极探索阐明膝骨关节炎相关的生理病理机制有助于更好地认识膝骨关节炎，从而寻找治疗膝骨关节炎新的、有效的途径。
血管新生是机体发育、修复和生殖的基础，对机功机能的维持和发展均有着重要意义[12]，血管生成是膝骨关节炎中与软骨下骨异常骨重建有关的重要病理特征之一[13]。近年来，膝骨关节炎患者的软骨下骨重塑及血管新生备受重视。许多研究表明，血管新生可能在膝骨关节炎发病进展各个方面都扮演着重要的角色。正常软骨中并没有血管存在，其所需营养一般来源于软骨下骨等其他组织的物质交换[14]。当关节软骨出现损害时，软骨下骨中血管新生可使纤维软骨形成瘢痕组织受到克制，加速骨重塑，以此促进向损伤部位修复的非板层骨的生长[15]；而当新血管越过骨软骨交界处时(至非钙化软骨层)时，则会引起以病理性的软骨细胞肥大、软骨内钙化，从而出现变厚的钙化软骨层及潮线重复的现象[16-17]。早期膝骨关节炎中，参与骨重建的破骨细胞过度产生血小板衍生生长因子BB促进异常血管新生并使软骨下骨结构发生改变，进而导致软骨的应力分布异常，使其在机械应力下逐渐发生退变[18]，而抑制软骨下骨的异常骨重建和血管新生可以有效减轻膝骨关节炎[19]。此外膝骨关节炎的全身低度炎症特性导致滑膜中各种细胞产生促血管新生因子，发育成新生毛细血管，在一定程度上维持了炎症环境的稳定及促进膝骨关节炎病理进展[20]。因此，控制关节内血管新生在减少关节软骨损伤、炎症控制及延缓疾病进展上具有重要意义。

VEGF是血管新生的标志性调节因子，可以由成骨细胞或肥大的软骨细胞分泌，广泛参与早期膝骨关节炎中异常的骨重建和血管新生[21]。肥大软骨细胞广泛存在于膝骨关节炎软骨中，其分泌的VEGF在软骨内骨化阶段可以刺激血管及破骨细胞聚集，促进相关部位的软骨吸收，最终由成骨细胞分泌VEGF刺激破骨细胞形成以完成骨重塑[22]。HAMILTON等[23]研究发现，VEGF在健康人的关节软骨内几乎不表达，而在膝骨关节炎的关节软骨和软骨下骨等方面呈现持续的表达升高。WALSH等[24]的研究结果显示软骨的血管侵袭会发生在血管活性持续性增强后的阶段。有相关研究表明，通过抑制VEGF在关节内的表达可起到延缓膝骨关节炎进展的作用[25]。HIF-1α是VEGF的主要调控因子之一，HIF-1α的产生通过缺氧诱发，缺氧是炎症组织的特征之一。在早期膝骨关节炎中，关节内的低度炎症环境可以刺激HIF-1α的集聚，上调各组织中VEGF的表达，进而影响血管生成[26]。HIF-1α/VEGF通路在某种程度上可能通过干预血管新生机制延缓软骨的血管侵袭，减缓膝骨关节炎的疾病进展。

MicroRNA-20b-5p是靶向血管内皮生长因子的抗血管生成的miRNA[27]。有研究发现，通过对骨关节炎患者血浆中miRNA关联性分析中发现，包括MicroRNA-20b-5p等12条miRNA可通干预关节组织的炎性反应及血管再生，从而参与膝骨关节炎的进展[28-29]。此外，有研究发现通过负调控miR-20b/PTEN轴以促进软骨细胞凋亡和细胞外基质降解[30]。在糖尿病大鼠玻璃体内注射MiR-20b模拟物能够降低AKT3和VEGF的表达，减少高糖诱导下人视网膜内皮细胞血管新生[31]。作者所在课题组前期的相关研究发现，microRNA-20b-5p(miR-20b-5p)和VEGF mRNA及蛋白的表达可能与早期膝骨关节炎的进展有关[6-7]。但miR-20b-5p是否能在通过膝关节内干预，影响早期膝骨关节炎病理环境中软骨及软骨下骨的血管新生、保护关节软骨是需要关注的问题。

木瓜蛋白酶诱导的是一种经典稳定的早期膝骨关节炎病理模型[32]。而关节内给药具有提高局部生物利用度、减少不良事件等许多优点，通过在膝关节腔注射miRNA相关激动剂/抑制剂可以直接接触并影响滑膜与软骨，这种干预方式已成为探讨miRNA在膝骨关节炎发病机制中作用的重要手段[33-34]。作者通过建立早期膝骨关节炎模型和miR-20b-5p相关激动剂膝关节内注射干预并探讨miR-20b-5p在膝骨关节炎关节软骨保护及软骨下骨的血管新生可能机制，具有一定意义。

OARSI评分是基于膝骨关节炎关节软骨病变的病理进程评价标准[9]，在早期膝骨关节炎评价上相较于其他评分(如Markin评分、Collines分级评分等)更加具有可比性和可重复性。此次研究发现，miR-20b agomir组OARSI评分明显低于模型组和miR-20b agomir NC组(P < 0.05)，模型组与miR-20b agomir NC组的OARSI评分相比差异无显著性意义(P > 0.05)；在病理结果中可以发现，膝骨关节炎模型组及miR-20b agomir NC组大鼠的潮线具有消失或严重向上侵袭的情况，软骨非钙化区及附近异常血管生成，且免疫组化、mRNA 和Western blot蛋白表达结果显示，软骨及软骨下骨HIF-1α、VEGF表达均增加。这表明早期膝骨关节炎中
HIF-1α/VEGF通路可能通过介导软骨和软骨下骨中的血管新生，使新生血管侵入钙化软骨层及非钙化软骨，激活软骨下骨的重塑，引发关节软骨炎症表达及软骨退化。另外，miR-20b agomir组与模型组、miR-20b agomir NC组比较中，软骨与软骨下骨中HIF-1α/VEGF mRNA 和Western blot蛋白表达水平均低于其余干预组(P < 0.05)。且从免疫组化及病理结果看，miR-20b agomir组靠近软骨钙化层区域的软骨下骨也具有较少的小型血管，而软骨非钙化区未发现明显的血管侵袭，这表明miR-20b-5p可能通过下调HIF-1α、VEGF表达，抑制HIF-1α/VEGF通路介导早期膝骨关节炎软骨及软骨下骨的血管新生，减少软骨非钙化区的血管侵袭，从而减轻血管新生引起的炎症反应，达到保护关节软骨的目的。

综上可知，过表达miR-20b-5p可能通过靶向抑制软骨及软骨下骨HIF-1α/VEGF通路的血管新生机制，减轻炎症反应，从而达到保护关节软骨的作用，这些结果提示，miR-20b-5p有可能成为治疗早期膝骨关节炎的潜在治疗靶点。此次研究也有一定不足之处：第一，此次研究为动物实验，缺乏临床样本，在后续的研究上，将收集并扩大临床标本，为miR-20b-5p作为膝骨性关节炎分子标志物提供更可靠的理论依据；第二，在细胞及分子水平上，miR-20b-5p能否进一步激活软骨细胞特异的下游靶基因及具体途径如何，还有待在软骨细胞的分子机制中进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
血管新生：从旧血管系统的基础上延伸出新的血管，该过程涉及多种细胞及分子，生理和病理状态下均可以发生。
软骨：膝关节相连骨表面的一层透明软骨，具有吸收缓冲应力的作用，在早期膝骨关节炎病变中，关节软骨损伤是重要的疾病进展
表现。
软骨下骨：与软骨钙化层相连的骨骺的骨组织，其结构的改变被认为是膝骨关节炎病变的重要特征之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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