1.1 设计 分组对照细胞实验:早期自然流产蜕膜基质细胞单独培养组和WJ-MSCs+早期自然流产蜕膜基质细胞共培养组,两组之间比较采用t检验方法;分组对照动物实验:正常妊娠组、流产组、WJ-MSCs治疗组,组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2019年1-12月在南通大学人体解剖实验室及南通大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 人蜕膜组织和人脐带组织 均由南通大学附属医院妇产科提供,人蜕膜组织来源于早期自然流产患者和要求人工终止妊娠的正常妊娠妇女,孕周<12周,排除胚胎染色体异常、子宫畸形、内分泌疾病、感染性疾病、免疫相关疾病;人脐带组织来源于正常足月(无妊娠并发症及合并症、孕周≥37周)剖宫产妇女,取长10-12 cm的脐带组织。人脐带组织及蜕膜组织的获取均获得患者知情同意,并通过南通大学伦理委员会批准,批准号:2018-L090。
1.3.2 实验动物 CBA/J雌鼠18只、DBA/2 雄鼠12只、BABL/c雄鼠6只:均为八九周龄,体质量20-22 g,SPF级,饲养于屏障环境中,购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1.3.3 实验试剂 DMEM/F12培养基、Tryple酶、0.25%胰酶/EDTA(1×)(Gibco,美国);胎牛血清(Serapro,澳洲);Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶、胰酶(Sigma,美国);Percoll(Pharmacia,美国);成脂、成骨诱导分化试剂盒、人间充质干细胞流式鉴定试剂盒(赛业生物科技有限公司,中国);A Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit(锐博生物科技有限公司,中国);Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反转录试剂盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒(诺维赞生物科技有限公司,中国);引物序列(上海生物工程有限公司,中国);鼠抗血管内皮生长因子单克隆抗体(Novus NB100-664,美国);兔抗GAPDH单克隆抗体(Abcam,ab9485);辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(碧云天生物科技公司,中国);兔抗波形蛋白单克隆抗体(Abcam,ab92547);Alexa Fluor 488 标记的羊抗兔IgG(Abcam,ab150077);鼠抗细胞角蛋白单克隆抗体(Abcam,ab668);Alexa Fluor 594 标记的羊抗鼠 IgG(Abcam, ab150120);Hoechst 33342(Sigma,中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人WJ-MSCs、早期自然流产蜕膜基质细胞的原代培养和鉴定
(1)人WJ-MSCs原代培养及传代:在无菌条件下,将长约12 cm的新鲜脐带放入装有基础培养基的无菌玻璃瓶中,将玻璃瓶置于冰盒内,尽快转运至实验室;在超净台上,将脐带放入盛有PBS的培养皿中,剪成长约1 cm的多段,并用PBS漂除血液;逐个去除每段脐带中的动脉和静脉,剥离出华通胶,放入盛有无菌基础培养基的培养皿中,然后将华通胶剪成1 cm3大小的组织块;将含有组织的基础培养基转移至50 mL无菌离心管,离心(1 200 r/min×3 min),去除上清液,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,混匀,然后移入75 cm2培养瓶,置于37 ℃,体积分数为5%CO2培养箱;每隔2 d换液,待细胞生长至80%-90%融合时,去除组织,同时传代:除去培养瓶中原有的培养基,PBS轻轻洗2遍,加入tryple 酶,置于37 ℃培养箱中静置3 min,待细胞呈球形漂浮起来,立即加入2倍体积的完全培养基终止消化;将上述消化液移入离心管中,离心(1 000 r/min×3 min),弃上清,加入PBS重悬细胞,轻轻吹打数下,离心(1 000 r/min×3 min),弃上清,重复使用PBS洗涤1遍;加入完全培养基重悬细胞,再将细胞悬液移至培养瓶中,置于37 ℃,体积分数为5%CO2培养箱。
(2)人WJ-MSCs成脂诱导分化:将第3代WJ-MSCs按照 2×105个/孔的密度接种在6孔板中,每孔加入2 mL完全培养基,置于37 ℃,体积分数为5%CO2培养箱中培养;每隔3 d换液,直至细胞融合度达到100%或者过融合;除去原有培养基,每孔加入2 mL成脂诱导A液;3 d后,除去A液,每孔加入2 mL成脂诱导B液;24 h后,再换 A 液培养;A液、B液交替培养3-5次后,持续用B液维持培养4-7 d,在这过程中每两三天换液1次;成脂诱导分化完成后,除去原有培养基,PBS冲洗2次,用体积分数为4%甲醛固定30 min;除去甲醛溶液,PBS 洗2次,每孔中加入1 mL 油红O染料染色30 min,除去染液,PBS洗2次,显微镜下观察成脂染色效果并拍照。
(3)人WJ-MSCs成骨诱导分化:加入适量 0.1%明胶到6孔板中,摇匀液体使其覆盖整个孔的底面,将6孔板放置在超净台至少30 min,然后弃去明胶,晾干;将第3代WJ-MSCs按照2×105个/孔的密度接种在已包被明胶的6孔板中,置于37 ℃,体积分数为5%CO2培养箱中培养;当细胞融合度达到60%时,轻轻吸除培养基,加入2 mL OriCell 人脐带间质干细胞成骨诱导分化完全培养基,每隔3 d换液1次(换液前培养基需预热至 37 ℃),培养2-4 周;吸除原有培养基,PBS洗2次,用体积分数为4%甲醛固定 30 min;吸除甲醛溶液,PBS洗2次,每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min;吸除茜素红染液,PBS洗3次;显微镜下观察成骨染色效果并拍照。
(4)流式细胞仪鉴定人WJ-MSCs表面分子标志物:用PBS重悬第3代WJ-MSCs,调节细胞浓度为3×109 L-1;取 1.5 mL EP管,标记一抗名称;取100 μL 细胞悬液至EP管中,每管(约3×105个细胞)加入2 μL与标记名称对应的一抗,混匀;2-8 ℃孵育30 min,然后用1 mL PBS清洗样品2次,250×g离心5 min,弃去上清;每组各加入100 μL PBS及 2 μL抗一抗的荧光二抗,重悬细胞;2-8 ℃孵育30 min,然后用1 mL PBS清洗样品2次,250×g离心5 min,弃去上清;用400 μL PBS重悬细胞后,立即上机检测。
(5)人早期自然流产蜕膜基质细胞原代培养:在无菌条件下,将新鲜蜕膜组织放入装有基础培养基的无菌玻璃瓶中,将玻璃瓶置于冰盒内,尽快转运至实验室;在超净台上,将蜕膜组织放入盛有基础培养基的培养皿中,漂除血液及绒毛,然后将组织剪碎,离心(1 200 r/min×3 min),弃上清;加入2倍体积的复合酶(0.3倍体积1%胶原酶∶0.75倍体积1%胰酶∶0.3倍体积1%透明质酸酶),混匀,置于37 ℃水浴锅中振荡消化30 min,加入2倍体积完全培养基终止消化,重复消化3次,消化液经40 μm 滤网过滤,离心(800 r/min× 10 min),弃上清,将细胞重悬于D-Hank’s液中,小心铺于不连续密度梯度界面上(含60%,40%,20% 3种密度),离心(2 500 r/min×20 min),取20%-40%密度层之间的细胞,即为初步分离的蜕膜基质细胞;将初步分离的蜕膜基质细胞洗涤2遍,重悬于完全培养基中,种植于培养瓶,置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养,第2天换液,贴壁的细胞即为纯化的蜕膜基质细胞。
(6)人早期自然流产蜕膜基质细胞鉴定:将细胞爬片铺于24孔培养板中,将原代蜕膜基质细胞按照6×104个/孔的密度种于其上,置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养过夜;除去原有培养基,PBS洗3次(5 min/次);加40 g/L多聚甲醛固定20 min,PBS洗3次(5 min/次);加入破膜封闭液,室温放置2 h;加一抗(兔抗波形蛋白单克隆抗体,鼠抗细胞角蛋白单克隆抗体)覆盖细胞表面,4 ℃过夜,PBS洗3次(5 min/次);加入二抗(用Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG和Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠IgG)覆盖细胞表面,室温避光孵育2 h,PBS洗3次(5 min/次);加入细胞核染料DAPI(1∶2 000),覆盖细胞表面,室温避光孵育10 min,PBS洗3次(5 min/次);滴加封固液于载玻片中间,将细胞爬片倒扣于上方,注意避免产生气泡;荧光显微镜下观察细胞荧光染色效果并摄片。
1.4.2 Western blot检测蜕膜基质细胞及各组蜕膜组织中血管内皮生长因子蛋白的表达 利用蛋白裂解液裂解蜕膜基质细胞、研磨后的蜕膜组织,4 ℃条件下,12 000×g离心30 min,取上清液,调节蛋白浓度一致,然后加入5×蛋白上样缓冲液(4∶1),混匀,100 ℃煮10 min,冰上冷却后立即使用。取等量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度10%),采用湿法转膜,将完成转膜的PVDF膜置于TBST溶液中摇洗3次,每次5 min,Western blot快速封闭液封闭15 min,一抗4 ℃孵育过夜,TBST溶液中摇洗3次,二抗室温孵育2 h,TBST溶液中摇洗3次,每次5 min,最后利用免疫印迹化学发光试剂ECL显影,检测蜕膜组织、蜕膜基质细胞中血管内皮生长因子蛋白的表达。
1.4.3 Real-Time PCR检测蜕膜基质细胞及各组蜕膜组织中血管内皮生长因子 mRNA的表达 利用Trizol法裂解蜕膜组织、蜕膜基质细胞,提取总RNA,测定RNA的纯度和浓度。根据反转录试剂盒说明进行反转录获得cDNA,接着以cDNA为模板,根据qPCR试剂盒说明进行Real-Time PCR反应,总反应体系为20 μL,扩增条件为95 ℃、5 min,循环1次;95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,循环40次;95 ℃、15 s,60 ℃、60 s,95 ℃、15 s,循环1次。使用StepOne实时定量荧光PCR仪进行qPCR反应,记录数据,根据CT值计算血管内皮生长因子 mRNA表达水平。引物序列见表1。
1.4.4 EdU 检测细胞增殖能力 将第1代早期自然流产的蜕膜基质细胞种在置有细胞爬片的24孔培养板内(1×105/孔),置于培养箱中培养过夜;换液,同时放置transwell小室,将第3代WJ-MSCs按 1×105/孔的密度接种在小室内,置于培养箱中培养72 h;配置50 μmol/L EdU培养基;加入EdU培养基(200 μL/孔),孵育2 h,弃培养基,PBS洗 3次,每次5 min;每孔加入500 μL 40 g/L多聚甲醛,室温孵育30 min;除去多聚甲醛,PBS缓慢摇洗3次,每次5 min;每孔加入200 μL渗透液,孵育10 min,PBS摇洗5 min;每孔加入200 μL×Apollo®染色反应液,避光、室温摇床孵育30 min,弃染色液;每孔重复加入200 μL渗透液,孵育 10 min,PBS摇洗5 min,每孔加入500 μL甲醇清洗2次,每次5 min,PBS摇洗5 min;每孔加入200 μL 1×Hoechst染液,避光室温下孵育10 min,弃染色反应液;PBS洗3次,在载玻片上滴加抗荧光淬灭剂,将细胞爬片倒扣于载玻片上;荧光显微镜下观察细胞并摄片。
1.4.5 Annexin V-FITC细胞凋亡检测 将第1代早期自然流产的蜕膜基质细胞按6×105个的密度接种在6孔培养板内,置于培养箱中培养过夜;换液,同时放置transwell小室,将第3代WJ-MSCs按6×105个的密度接种在小室内,置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养72 h。取出transwell小室,把细胞培养液吸出至15 mL离心管内,PBS洗涤贴壁细胞1遍,加入500 μL 0.25%胰酶消化细胞,室温孵育至细胞可以轻轻吹打下来,立即加入完全培养基终止消化,把细胞轻轻吹打下来;把先前收集的细胞培养液和消化细胞后收集的培养液一起转移到离心管内,离心,弃上清,收集细胞,用PBS重悬细胞沉淀,充分混匀后计数细胞;取5×104个重悬的细胞, 1 000×g 离心5min,弃上清,加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞;加入5 μL Annexin V-FITC,轻轻混匀;加入10 μL碘化丙啶染色液,轻轻混匀;室温(20-25 ℃)避光孵育10 min,随后置于冰浴中,立即上流式细胞仪检测。
1.4.6 复制自然流产小鼠模型及细胞移植 流产小鼠模型:雌性CBA/J×雄性DBA/2;正常妊娠小鼠模型:雌性CBA/J×雄性BABL/c,以1∶1合笼,检出阴道栓为妊娠第1天。实验分组:流产组于孕1,3,5 d尾静脉注射PBS 0.1 mL,治疗组于孕1,3,5 d尾静脉注射WJ-MSCs悬液0.1 mL(1×1010 L-1),正常组于孕 1,3,5 d尾静脉注射PBS 0.1 mL。孕14 d时小鼠眼球取血,采用ELISA检测各组小鼠血清中血管内皮生长因子水平;取子宫大体标本,计算胚胎吸收率,胚胎吸收率=吸收胚胎数量/(吸收胚胎数量+正常妊娠胚胎数量);剖开子宫取蜕膜组织,采用Western blot、Real-Time PCR检测各组蜕膜组织中血管内皮生长因子蛋白和mRNA的表达。
1.4.7 ELISA检测血清中血管内皮生长因子水平 孕14 d时,小鼠眼球取血,将血液收集于血清分离管中,室温下离心, 1 200×g离心10 min,取上层淡黄色血清备用。配制适当量的洗涤液:将洗涤液(20×)用双蒸水或去离子水稀释至1×;按说明书要求配制7个标准品浓度,分别是1 000,500,250,125,62.5,31.25,0 ng/L;取出预包被的板条,将样品或不同浓度标准品加入相应孔中(100 μL/孔),封板膜封住反应孔,室温孵育2 h;洗板5次,最后一次置于吸水纸上拍干;再洗板5次,最后一次置于吸水纸上拍干;加生物素化抗体(100 μL/孔),封板膜封住反应孔,室温孵育1 h;加辣根过氧化物酶标记Streptavidin(100 μL/孔),封板膜封住反应孔,室温避光孵育20 min;再洗板5次,最后一次置于吸水纸上拍干,加TMB溶液(100 μL/孔),封板膜封住反应孔,室温避光孵育15-20 min;加入终止液50 μL/孔,混匀后立即测量450 nm处的吸光度值,计算得出血清中血管内皮生长因子水平。
1.5 主要观察指标 ①与WJ-MSCs共培养后,自然流产蜕膜基质细胞增殖、凋亡情况及血管内皮生长因子表达水平;②自然流产小鼠尾静脉移植WJ-MSCs后,统计胚胎吸收率,蜕膜及血清中血管内皮生长因子表达水平。
1.6 统计学分析 所有实验至少重复3次,采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示。组间数据差异比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验,P < 0.05为差异有显著性意义。