脊髓损伤后调控星形胶质细胞和小胶质细胞活化的电针技术

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1812

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (29): 4675-4680.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1812

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脊髓损伤后调控星形胶质细胞和小胶质细胞活化的电针技术

潘伟滨¹，林晓敏¹，范筱²

¹漳州卫生职业学院，福建省漳州市 363000；²青岛市市立医院，山东省青岛市 266011

修回日期:2019-05-09 出版日期:2019-10-18 发布日期:2019-10-18
通讯作者: 范筱，博士，主治医师，青岛市市立医院，山东省青岛市 266011
作者简介:潘伟滨，男，1983年生，福建省漳州市人，汉族，2007年福建中医学院毕业，讲师，主要从事针灸推拿研究。
基金资助:
福建省中青年教师教育科研社科项目(社科)(JAS161084)，项目负责人：潘伟滨

Electroacupuncture regulates activation of astrocytes and microglia after spinal cord injury

Pan Weibin¹, Lin Xiaomin¹, Fan Xiao²

¹Zhangzhou Health Vocational College, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China; ²Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China

Revised:2019-05-09 Online:2019-10-18 Published:2019-10-18
Contact: Fan Xiao, MD, Attending physician, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China
About author:Pan Weibin, Lecturer, Zhangzhou Health Vocational College, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China
Supported by:
the Social Science Project of Education Research for Young and Middle-Aged Teachers of Fujian Province, No. JAS161084 (to PWB)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胶质细胞：在神经系统内广泛存在，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞等，其中星形胶质细胞和小胶质细胞与炎症的关系十分密切。星形胶质细胞在生理状态下处于静息状态，脊髓损伤后可被激活而出现增生、肥大并进入增殖状态，发生反应性星形胶质细胞增生，导致胶质瘢痕形成和介导炎症。同时，小胶质细胞作为神经系统固有免疫细胞，对炎症具有重要的激发作用和调控作用。
胶质纤维酸性蛋白：是星形胶质细胞的骨架蛋白，被认为是星形胶质细胞的典型标记物，其表达量越高提示星形胶质细胞状态越活跃、增殖越多。

摘要
背景：目前的临床试验证实，电针对脊髓损伤引起的运动功能障碍、感觉功能障碍及尿潴留等并发症具有良好的治疗效果，但有关电针治疗脊髓损伤的相关作用机制尚不十分明确。
目的：观察电针对脊髓损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞活化的调控作用，探讨电针治疗脊髓损伤的相关作用机制。
方法：将36只SD大鼠(上海斯莱克实验动物公司提供)随机分为假手术组、模型组、电针组，每组12只：假手术组仅行椎板切除，模型组和电针组制备T₉-T₁₁脊髓损伤模型，电针组术后每天双侧肝俞穴、脾俞穴给予电针干预30 min，连续干预7 d。7 d后取各组大鼠腹主动脉血与损伤部位脊髓组织，ELISA法检测血清中白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18质量浓度，尼氏染色观察神经元尼氏体形态，免疫荧光法检测ED-1和胶质纤维酸性蛋白表达，Western blot检测ED-1蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达情况。实验获得青岛市市立医院医学伦理委员会批准，批准号：QDSLYY2018-18。
结果与结论：①与假手术组比较，模型组、电针组白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18质量浓度明显增高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组上述炎性因子质量浓度明显降低(P < 0.05)；②假手术组神经元形态正常；模型组神经元受损，部分神经元溶解、液化并形成较多空洞，尼氏体破碎，形态细小，数量少；电针组神经元形态较模型组有所改善；③免疫荧光显示与假手术组比较，模型组、电针组ED-1蛋白和胶质纤维酸性蛋白阳性表达增多(P < 0.05)；与模型组比较，电针组2种蛋白阳性表达减少(P < 0.05)；④Western blot检测显示与假手术组比较，模型组、电针组胶质纤维酸性蛋白和ED-1蛋白表达升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组2种蛋白表达降低(P < 0.05)；⑤结果表明，电针可抑制脊髓损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞活化，抑制炎症反应，有利于损伤后神经元修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7366-0603(潘伟滨)

关键词: 脊髓损伤, 电针, 中医药, 反应性星形胶质细胞增生, 星形胶质细胞, 小胶质细胞, 炎症, 神经修复

Abstract:

BACKGROUND: Current clinical trials have confirmed that electroacupuncture has a therapeutic effect on motor dysfunction, sensory dysfunction and urinary retention due to spinal cord injury, but the mechanism of electroacupuncture in treating spinal cord injury is still unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of electroacupuncture on the activation of astrocytes and microglia after spinal cord injury and to explore the mechanism of electroacupuncture in the treatment of spinal cord injury.
METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats (Provided by Shanghai Slack Laboratory Animal Company, China) were randomly divided into sham operation group, model group and electroacupuncture group, with 12 rats in each group. The sham operation group was only treated with laminectomy, and the other two groups were prepared for the spinal cord injury model (T₉-T₁₁). Electroacupuncture group received electroacupuncture at Ganyu and Shenyu on both sides for 30 minutes every day for 7 continuous days. Abdominal aortic blood and spinal cord tissue at injured sites were taken from the rats in each group after 7 days of intervention. ELISA was used to detect the mass concentration of interleukin-1β, interleukin-6 and interleukin-18 in the venous blood of rats. Nissl’s staining was used to observe the neurons morphology. The expression of ED-1 and glial fibrillary acidic protein was detected by immunofluorescence, and the protein expression of ED-1 and glial fibrillary acidic protein was detected by western blot. The study was approved by the Medical Ethics Committee of Qingdao Municipal Hospital (approval No. QDSLYY2018-18).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham operation group, the mass concentration of interleukin-1β, interleukin-6 and interleukin-18 in the model group and electroacupuncture group increased significantly (P < 0.05), and the mass concentration of above inflammatory factors in the electroacupuncture group decreased significantly as compared with the model group (P < 0.05). (2) Neurons in the sham operation group were normal in morphology. Neurons in the model group were damaged, and some neurons dissolved and liquefied with more holes. Nissl body was broken and reduced in number and size. Neurons in the electroacupuncture group were better than that in the model group. (3) Compared with the sham operation group, the positive expression of glial fibrillary acidic protein and ED-1 in the model and electroacupuncture groups increased significantly (P < 0.05). Compared with the model group, the positive expression of above two proteins in the electroacupuncture group decreased significantly (P < 0.05). (4) Western blot results showed that the expression of glial fibrillary acidic protein and ED-1 protein in the model and electroacupuncture groups was higher than that in the sham operation group, while the expression of these two proteins in the electroacupuncture group was lower than that in the model group (P < 0.05). In conclusion, electroacupuncture could inhibit the activation of astrocytes and microglia after spinal cord injury, thereby inhibiting inflammatory response and facilitating the repair of injured neurons.

Key words: spinal cord injury, electroacupuncture, traditional Chinese medicine, reactive astrocyte proliferation, astrocyte, microglia, inflammation, nerve repair

中图分类号:

潘伟滨，林晓敏，范筱. 脊髓损伤后调控星形胶质细胞和小胶质细胞活化的电针技术[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4675-4680.

Pan Weibin, Lin Xiaomin, Fan Xiao. Electroacupuncture regulates activation of astrocytes and microglia after spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4675-4680.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 36只SD大鼠实验期间全部存活，进入结果分析。

2.2 尼氏染色观察各组神经元形态 如图1所示，假手术组神经元形态正常，无损伤，可见大量虎斑状尼氏体，丰富饱满；模型组神经元受损，部分神经元溶解、液化并形成较多空洞，尼氏体破碎，形态细小，数量少；电针组神经元虽有一定程度损伤，但形态较模型组有所改善，尼氏体形态和数量较模型组改善。

2.3 免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白和ED-1表达 如图2所示，胶质纤维酸性蛋白阳性表达呈绿色，为较大放射状，在细胞浆中表达；ED-1阳性表达呈绿色，为较小树桠状，在细胞浆中表达；假手术组胶质纤维酸性蛋白和ED-1阳性表达较少，模型组、电针组胶质纤维酸性蛋白和ED-1阳性表达较多。各组胶质纤维酸性蛋白和ED-1积分吸光度值如表1所示，与假手术组比较，模型组和电针组胶质纤维酸性蛋白和ED-1积分吸光度值均显著增加(P < 0.05)；与模型组比较，电针组胶质纤维酸性蛋白和ED-1积分吸光度值均显著降低(P < 0.05)。

2.4 Western bolt检测胶质纤维酸性蛋白和ED-1蛋白表达 如图3所示，假手术组胶质纤维酸性蛋白和ED-1蛋白表达较少，模型组、电针组胶质纤维酸性蛋白和ED-1蛋白表达较多。各组胶质纤维酸性蛋白和ED-1蛋白相对表达量如表2所示，与假手术组比较，模型组和电针组胶质纤维酸性蛋白和ED-1蛋白相对表达量均显著增加(P < 0.05)；与模型组比较，电针组胶质纤维酸性蛋白蛋白和ED-1蛋白相对表达量均显著降低(P < 0.05)。

2.5 ELISA检测炎性因子分泌水平 如表3所示，与假手术组比较，模型组、电针组白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18质量浓度显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18质量浓度显著降低(P < 0.05)。

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引言

脊髓损伤一直以来都是医学领域的世界性难题，其病理过程十分复杂，包括炎症、水肿、离子失衡等一系列级联反应^[1]，其中炎症在脊髓损伤病理反应中扮演重要角色。持续高水平的炎症导致损伤处组织发生炎性浸润、血管通透性改变、损伤区域扩大、血小板凝集能力改变等，引起组织水肿、缺血、细胞坏死和凋亡等。胶质细胞在神经系统内广泛存在，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞等，其中星形胶质细胞和小胶质细胞与炎症的关系十分密切。星形胶质细胞在生理状态下处于静息状态，脊髓损伤后可被激活而出现增生、肥大并进入增殖状态，发生反应性星形胶质细胞增生，导致胶质瘢痕形成和介导炎症^[2]。同时，小胶质细胞作为神经系统固有免疫细胞，对炎症具有重要的激发作用和调控作用^[3]。胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的骨架蛋白，被认为是星形胶质细胞的典型标记物，其表达量越高提示星形胶质细胞状态越活跃、增殖越多。ED-1作为小胶质细胞/巨噬细胞群的特异性标记物，常被用来反映小胶质细胞的活化程度，ED-1表达量越高则提示小胶质细胞活化越严重。研究发现脊髓中的固有小胶质细胞在脊髓损伤后活化，进入极化状态而激发白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18等炎性因子大量释放，介导炎症^[4-5]。因此，如何有效调控脊髓损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞的活化对治疗脊髓损伤有重要作用。

电针是中医学的重要治疗方法之一，临床应用广泛。临床试验证实电针对脊髓损伤引起的运动功能障碍、感觉功能障碍及尿潴留等并发症具有良好的治疗效果^[6-8]。同时，动物实验进一步证实电针对中枢神经系统具有一定的保护作用，可促进受损神经修复^[9-10]，但有关电针治疗脊髓损伤的相关作用机制尚不十分明确。因此，此次研究旨在观察电针对脊髓损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞活化的调控作用，探讨电针抑制脊髓损伤后炎症的相关机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年9月至2019年2月在青岛市市立医院中心实验室进行。

1.3 材料

实验动物与分组：10周龄SPF级SD大鼠36只，雌雄各半，体质量约220 g，购于上海斯莱克实验动物公司，许可证号码：SCXK(沪)2017-003，饲养于青岛市立医院中心实验室实验动物中心，饲养条件为：温度20-24 ℃，相对湿度45%-50%，12 h光暗循环，喂食过滤水和营养饲料。采用随机数表法将36只大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，每组12只，在动物实验中心适应性饲养7 d后进行实验。实验符合青岛市市立医院医学伦理委员会要求，批准号：QDSLYY2018-18。

实验用主要仪器及试剂：羊抗胶质纤维酸性蛋白抗体(abcam，批号：ab53554)；小鼠抗ED-1(CD68)抗体(abcam，批号：ab31630)；Alexa Fluor 488驴抗小鼠荧光二抗(赛默飞，批号：A21202)；Alexa Fluor 488驴抗山羊荧光二抗(赛默飞，批号：A11055)；DAPI染色液(博士德，武汉，批号：AR1177)；尼氏染色液(索莱宝，北京，批号：G1430)；白细胞介素1β ELISA试剂盒(博士德，武汉，批号：EK0394)；白细胞介素6 ELISA试剂盒(博士德，武汉，批号：EK0412)；白细胞介素18 ELISA试剂盒(博士德，武汉，批号：EK0592)；仪脊髓打击器(W.M. Keck神经科学协作中心，美国)；医用电针治疗仪(G6805，苏州医疗用品厂有限公司)；0.5寸毫针(华佗牌，苏州医疗用品厂有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 脊髓损伤模型制备 根据参考文献[11]制备脊髓损伤模型。具体操作为：采用7%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉，注射剂量为5 mL/kg。麻醉成功后，选择T₉-T₁₁区域备皮，暴露手术部位，消毒；沿大鼠后正中线作一长2.0-3.0 cm的纵行切口，分别切开皮肤、肌肉、筋膜等软组织，使用小型咬骨钳咬除椎板，暴露脊髓；固定鼠体，调整打击杆以瞄准脊髓，设置打击高度12.5 mm，释放打击杆撞击脊髓，出现大鼠后肢回缩扑动及尾部快速摆动提示造模成功；生理盐水冲洗伤口，逐层缝合。模型组与电针组24只大鼠均造模成功，无死亡。假手术组仅暴露脊髓，不进行打击。

1.4.2 造模后干预方法 术后第1天开始进行干预。电针组取穴为双侧肝俞穴、脾俞穴^[12]，具有定位参考《实验针灸学》中的定位方法^[13]。将毫针斜刺入上述穴位2 mm，使用2根电线，1号出口线正负极分别连接左侧肝俞穴和左侧脾俞穴，2号出口线正负极分别连接右侧肝俞穴和右侧脾俞穴，设置电针仪的电流强度为1-3 mA，频率为2 Hz，连续波，电针组大鼠每天接受电针干预30 min，次/d，持续7 d。假手术组和模型组每天同一时间同等条件抓取30 min后回笼饲养，不予任何治疗。

1.4.3 取材 麻醉成功后，每只大鼠先进行腹主动脉采血，每组随机选取6只大鼠，使用40 g/L多聚甲醛进行灌注固定，取损伤处1 cm长脊髓组织，放入40 g/L多聚甲醛溶液固定48 h；剩余6只大鼠直接取损伤处1 cm长脊髓组织，放入-80 ℃保存。

1.5 主要观察指标

尼氏染色观察神经元形态：将5 μm石蜡组织切片脱蜡至入水，使用尼氏染色液在60 ℃下染色50 min，PBS漂洗，分色液分色2 min，晾干，中性树胶封固，镜下观察并拍片。

免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白、ED-1表达：将石蜡组织切片脱蜡至入水，修复，冷却；经PBS洗涤后，用0.3%Triton X-100溶液浸泡10 min；血清室温封闭1 h，甩掉封闭液不洗；分别滴加胶质纤维酸性蛋白一抗(1∶200)和ED-1一抗(1∶200)，4 ℃过夜；次日先将切片复温0.5 h，PBS洗涤后在避光环境下加Alexa Fluor 488荧光二抗，37 ℃烤箱孵育1 h；PBS洗涤，加DAPI染色液，室温下孵育3 min；PBS洗涤，使用抗荧光减退封片剂封固，在荧光显微镜下观察并采集图像。

Western blot检测胶质纤维酸性蛋白、ED-1表达：先将脊髓组织中加入裂解液，冰浴60 min。14 000×g离心10 min，BCA法定量蛋白，计算蛋白浓度。使用凝胶电泳分离蛋白，观察Marker蛋白的位置。转膜，封闭，漂洗3次。封闭1.5 h后，先后加入胶质纤维酸性蛋白一抗(1∶1 000)、ED-1一抗(1∶1 000)和二抗(1∶1 000)。漂洗后去除二抗后使用化学发光试剂显影，在避光条件下显影，凝胶扫描成像系统进行分析。

ELISA检测炎性因子分泌：腹主动脉血离心后取上清液，按照ELISA试剂盒说明进行操作，检测血清中炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18质量浓度。

1.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据用x(_)±s表示。符合正态分布的数据采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

炎症是脊髓损伤发生后重要的病理反应之一。炎症释放的大量炎性因子及炎性细胞浸润、聚集，是导致神经元坏死、凋亡、自噬，轴突脱髓鞘等一系列病理变化的重要原因^[14-15]。目前认为，炎症与脊髓组织中的星形胶质细胞和小胶质细胞有密切关系。星形胶质细胞作为脊髓中胶质细胞系的重要成员，具有调节离子平衡和神经递质、维持血脑屏障稳定、分泌神经营养因子等重要作用^[16-17]，可被脊髓损伤后损伤组织释放的大量细胞因子激活而进入活化状态，发生增生、肥大并进入增殖状态，形成反应性星形胶质细胞增生^[18-19]。胶质纤维酸性蛋白作为一种骨架蛋白在星形胶质细胞中广泛存在，其表达量增强是星形胶质细胞反应性增生的典型标志，可反映反应性星形胶质细胞增生程度和细胞状态^[20-21]。脊髓损伤早期，轻度星形胶质细胞反应性增生形成的胶质瘢痕，可保护损伤周围组织免受有害物质侵袭，降低继发性损伤^[22-23]；但脊髓损伤后持续星形胶质细胞反应性增生引起的胶质纤维酸性蛋白高表达，可形成大量胶质瘢痕，同时释放大量炎性因子介导炎症，形成物理和化学双重屏障阻碍神经系统修复和重建^[24-25]。小胶质细胞作为中枢神经系统中的固有免疫细胞，在脊髓损伤发生后的炎症反应中发挥重要作用。研究表明脊髓损伤后，脊髓中的固有小胶质细胞活化，可介导炎症并释放大量炎性因子^[26-27]。活化状态的小胶质细胞和外周血浸润的巨噬细胞混合一起，不易区分，共同组成活化小胶质细胞/巨噬细胞群，表达特异性标记物ED-1^[28]。研究表明脊髓损伤发生后，小胶质细胞活化可在损伤后3 d左右达到高峰，发挥浸润和吞噬作用^[29-30]。小胶质细胞被炎性递质、有毒物质及三磷酸腺苷等物质激活后，可通过多条通路介导炎症。小胶质细胞活化及其介导的炎症对脊髓损伤后神经系统修复来说是一把双刃剑，一方面，早期小胶质细胞活化及轻度炎症可促进坏死细胞和组织碎片的清除，有利于损伤修复^[^31-³²^]；另一方面，持续小胶质细胞活化和炎症引起细胞毒性物质大量释放，加剧神经元坏死、凋亡等病理反应，不利于损伤后修复^[3³^-3⁴^]。此次实验结果进一步证实，脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白和ED-1表达显著上调，同时炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18质量浓度显著升高，提示星形胶质细胞和小胶质细胞在脊髓损伤后进入活化状态，介导炎症的发生。

脊髓损伤属于中医学“体惰”的范畴，亦属于痿证^[3⁵^]。脊髓损伤多由于跌扑损伤或外伤暴力导致脊髓受损，气滞血瘀，气血运行不畅，从而出现肌肉痿软无力、筋脉萎缩失养、运动不利、尿便失司等症状。中医基础理论认为肝主筋、脾主肉，两者与肢体运动关系密切，肝脾气血充足则筋脉肌肉得其所养，筋脉肌肉强健有力，运动灵活。肝腧穴和脾腧穴为膀胱经的背俞穴，与肝脾关系密切，刺激肝腧穴和脾腧穴有利于调节肝脏和脾脏的功能并通调水道。因此，临床常选取肝腧穴和脾腧穴用于治疗脊髓损伤、筋脉肌肉痿软无力等病症。这也说明应用电针治疗脊髓损伤是具有一定理论依据的。

尼氏染色显示，脊髓损伤后神经元出现尼氏体碎裂、神经元肿胀甚至溶解而呈空泡样变，这些神经元形态学上的改变是脊髓损伤神经修复的难点；电针干预7 d后发现，脊髓损伤局部的神经元形态发生一定程度的改变，尼氏体形态和数量、神经元肿胀程度等均得到了一定程度的改善，这提示电针对脊髓损伤后神经元形态具有一定的改善作用。同时ELISA检测显示，电针可降低脊髓损伤后血清中炎性因子白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素18质量浓度，这说明电针有利于抑制脊髓损伤后炎症反应，可能是电针改善脊髓损伤后局部神经元形态的原因之一，从而有利于脊髓损伤后的修复；此外，免疫组织化学和Western blot检测均显示电针对胶质纤维酸性蛋白和ED-1过度表达有良好的抑制作用，提示电针对星形胶质细胞活化引起的反应性增生和小胶质细胞活化均有良好的抑制作用，可降低脊髓损伤后损伤局部星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。鉴于星形胶质细胞活化引起的反应性增生和小胶质细胞活化对于炎症反应具有重要的介导和调控作用，因此推测电针抑制脊髓损伤后炎症反应的原因之一可能与电针抑制脊髓损伤后星形胶质细胞活化引起的反应性增生和小胶质细胞活化有关。

综上所述，此次实验可得出结论：电针治疗脊髓损伤的作用机制之一可能与其抑制脊髓损伤后星形胶质细胞活化引起的反应性增生和小胶质细胞活化，抑制脊髓损伤后炎症反应，进而有利于改善脊髓损伤后神经元形态和修复有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脊髓损伤后调控星形胶质细胞和小胶质细胞活化的电针技术

Electroacupuncture regulates activation of astrocytes and microglia after spinal cord injury

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