甲基强的松龙抑制脊髓损伤模型大鼠小胶质细胞活化介导的炎症

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1250

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
小胶质细胞：系神经组织中唯一来源于中胚层的细胞，其细胞体很小，呈短棒状，伸出数支枯条样突起，突起表面粗糙，显有棘刺，分支少；胞核较小，约为5 μm，形态不规则，可呈肾形、椭圆形或三角形，核染色质多。作为中枢神经系统固有免疫细胞，小胶质细胞被认为是神经炎症的发动者。
糖皮质激素：是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类类固醇激素，主要为皮质醇，具有调节糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。称其为“糖皮质激素”是因为其调节糖类代谢的活性最早为人们所认识，在临床工作中激素因具有较强的抗炎抗变态反应作用而广泛应用于支气管哮喘治疗中。

摘要
背景：小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，已被证实参与调控中枢神经系统损伤后的神经炎症。甲基强的松龙冲击疗法作为目前脊髓损伤早期临床常用治疗方法，其对脊髓损伤后神经炎症的作用及机制尚不清楚。
目的：观察甲基强的松龙对脊髓损伤后小胶质细胞活化介导炎症的作用。
方法：36只SD大鼠购自上海斯莱克实验动物责任有限公司。将大鼠随机分为假手术组、模型组、甲强龙组，每组12只。假手术组仅行椎板切除术；模型组和甲强龙组均采用NYU脊髓打击器制备脊髓损伤模型，甲强龙组给予甲基强的松龙尾静脉注射；假手术组和模型组给予等量0.9%氯化钠尾静脉注射。干预后3 d取材，采用尼氏染色光镜观察形态，Elisa检测大鼠静脉血中白细胞介素1β和白细胞介素18水平，激光共聚焦扫描显微镜观察活化的小胶质细胞IBA-1/ED-1双阳性细胞数，Western blot检测ED-1蛋白表达情况，qPCR检测白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达量。
结果与结论：①尼氏染色提示甲基强的松龙可改善脊髓损伤后神经元形态，促进神经元恢复；②与模型组比较，甲强龙组白细胞介素1β和白细胞介素18表达水平显著降低(P < 0.05)；③与模型组比较，甲强龙组IBA-1/ED-1双阳性细胞数显著减少(P < 0.05)；④与模型组比较，甲强龙组ED-1蛋白表达量显著减少(P < 0.05)；⑤与模型组比较，甲强龙组白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达水平显著降低；⑥结果说明，甲基强的松龙抑制炎症的机制与其抑制脊髓损伤后小胶质细胞活化介导的炎症有关，从而有利于神经元恢复。

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ORCID: 0000-0002-9372-685X(黄星球)

关键词: 脊髓损伤, 甲基强的松龙, 小胶质细胞, 炎症, ED-1蛋白, 白细胞介素18 mRNA, 尾静脉注射

Abstract:

BACKGROUND: Microglia, an innate immunocyte of central nervous system, has been shown to be involved in the regulation of neuroinflammation following central nervous system injury. Methylprednisolone pulse therapy is a common clinical treatment for early spinal cord injury, but its effect on the neuroinflammation after spinal cord injury is unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of methylprednisolone on inflammation mediated by activated microglia after spinal cord injury.
METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats (provided by Shanghai Slack Laboratory Animals Co., Ltd.) were randomly divided into sham (laminectomy plus 0.9% sodium chloride ), modeling (spinal cord injury model plus 0.9% sodium chloride) and methylprednisolone groups (spinal cord injury model plus injection of methylprednisolone via tail vein) (n=12/group). The spinal cord injury model was established with NYU spinal cord impactor. Three days after administration, the morphology of Nissl body in neurons was observed under light microscope. The levels of interleukin-1β and interleukin-18 in venous blood were detected by ELISA. The number of IBA-1/ED-1 positive activated microglia was tested by laser confocal scanning microscope. The expression of ED-1 protein was detected by western blot assay. The expression levels of interleukin-1β and interleukin-18 mRNA were detected by qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Nissl staining results revealed that methylprednisolone can improve the morphology of neuron after spinal cord injury, and promote neuron repair. (2) Compared with the modeling group, the levels of interleukin-1β and interleukin-18 in the methylprednisolone group were significantly decreased (P < 0.05). (3) The number of IBA-1/ED-1 positive activated microglia in the methylprednisolone group was significantly less than that in the modeling group (P < 0.05). (4) The expression level of ED-1 protein in the methylprednisolone group was significantly lower than that in the modeling group (P < 0.05). (5) The expression levels of interleukin-1β and interleukin-18 mRNA in the methylprednisolone group were significantly lower than those in the modeling group. (6) To conclude, the mechanism of methylprednisolone inhibiting inflammation is related to inhibiting inflammation induced by activated microglial after spinal cord injury, which is conducive to the recovery of neurons.

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Key words: spinal cord injury, methylprednisolone, microglia, inflammation, ED-1 protein, interleukin-18 mRNA, injection via tail vein

中图分类号:

R446
R318

黄星球，廖绪强，史成龙，张秀丽. 甲基强的松龙抑制脊髓损伤模型大鼠小胶质细胞活化介导的炎症[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 3050-3055.

Huang Xingqiu, Liao Xuqiang, Shi Chenglong, Zhang Xiuli . Methylprednisolone inhibits inflammation mediated by activated microglia after spinal cord injury in rat models [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 3050-3055.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠36只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 尼氏染色观察神经元形态假手术组神经元形态规则，结构完整，细胞内可见虎斑样尼氏体，尼氏体饱满，数量较多；模型组神经元形态不规则，部分神经元水肿明显，部分神经元固缩坏死，可见神经元溶解、液化后形成的空泡样结构，尼氏体碎裂，较小，数量较少；甲强龙组神经元形态较模型组改善，虽然可见少量神经元水肿以及空泡样结构形成，但程度较模型组轻，尼氏体较饱满，数量较多。见图1。

2.3 Elisa检测静脉血白细胞介素1β和白细胞介素18水平见图2。假手术组白细胞介素1β和白细胞介素18水平较低，模型组白细胞介素1β和白细胞介素18水平较高；与假手术组相比，模型组和甲强龙组白细胞介素1β和白细胞介素18表达水平显著增高(P < 0.05)；与模型组比较，甲强龙组白细胞介素1β和白细胞介素18表达水平显著降低(P < 0.05)。

2.4 激光共聚集检测IBA-1/ED-1双阳性细胞 IBA-1阳性细胞呈红色，为小胶质细胞；ED-1阳性细胞呈绿色，为被激活的小胶质/巨噬细胞；IBA1/ED-1双阳性细胞呈黄色，为活化的小胶质细胞。阳性反应细胞均呈树桠状，散在分布于脊髓中，见图3。与假手术组比较，模型组和甲强龙组IBA1/ED1双阳性细胞数显著增多(P < 0.05)；与模型组比较，甲强龙组IBA1/ED1双阳性细胞数显著减少(P < 0.05)，见图4。

2.5 Western blot检测ED-1蛋白表达假手术组ED-1蛋白表达量较低，模型组ED-1白表达量较高，见图5；与假手术组相比，模型组和甲强龙组ED-1蛋白表达量显著增高(P < 0.05)；与模型组比较，甲强龙组ED-1蛋白表达量显著降低(P < 0.05)。见图6。

2.6 qPCR检测白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达假手术组白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达水平较低，模型组白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达水平较高；与假手术组相比，模型组和甲强龙组白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达水平显著增高(P < 0.05)；与模型组比较，甲强龙组白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年12月至2018年5月在佛山市第一人民医院科研中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组 36只220 g的健康成年SPF级SD大鼠(雌雄各半)，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2017-0006。实验过程及方法符合佛山市第一医院伦理委员会要求。上述大鼠被随机分为假手术组、模型组和甲强龙组，每组12只。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器甲基强的松龙(辉瑞制药，批号：H20130301)；一抗：小鼠抗ED-1抗体、山羊抗IBA-1抗体(Abcam，美国)；二抗：驴抗山羊Alexa Fluor 568荧光二抗、驴抗小鼠Alexa Fluor 488荧光二抗(Thermo Fisher，美国)；DAPI染色液(博士德，武汉)；尼氏染色液(索莱宝，北京)；Elisa试剂盒(西塘生物，上海)；NYU脊髓打击器(W. M. Keck 神经科学协作中心，美国)；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(Q111-02/03，维诺赞)、HiScript II Q RT SμperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(R223-01，维诺赞)。

1.4 实验方法

1.4.1 制备脊髓损伤模型根据参考文献[6]制备脊髓损伤模型。具体操作为：将体积分数7%水合氯醛腹腔注射，注射剂量为5 mL/kg；麻醉成功后，备皮，消毒；沿背部T₉-T₁₁中线作长约3 cm切口，去除椎板，暴露脊髓；调整NYU打击器，设置打击高度1.25 cm，将打击杆瞄准脊髓并打击，见大鼠后肢回缩抽搐及尾部痉挛性摆动则提示造模成功；冲洗伤口，逐层缝合。

1.4.2 各组大鼠处理方法 36只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、甲强龙组，每组12只。假手术组仅行椎板切除术；甲强龙组和模型组采用上述方法制备脊髓损伤模型，甲强龙组术后立即给予甲基强的松龙30 mg/kg尾静脉注射，15 min内完成，45 min后给予甲基强的松龙5.4 mg/(kg•h)尾静脉注射，持续23 h；模型组术后立即给予等量0.9%氯化钠溶液尾静脉注射；假手术组大鼠仅行椎板切除术，不损伤脊髓，术后立即给予等量0.9%氯化钠溶液尾静脉注射。

1.4.3 取材干预3 d后取材。麻醉成功后，每只大鼠采集静脉血；每组随机6只大鼠采用40 g/L多聚甲醛灌注固定，取损伤周围脊髓段约2 cm，放入40 g/L多聚甲醛固定48 h；另6只大鼠采用直接取材，取损伤周围脊髓段约2 cm，-80 ℃保存备用。

实验动物造模过程的相关问题
造模目的：	研究甲基强的松龙是否通过抑制小胶质细胞活化介导的炎症而有利于脊髓损伤后神经元修复
借鉴已有标准实施动物造模：	参考文献[6]制备脊髓损伤模型
模型与所研究疾病的关系：	①借鉴脊髓损伤发生后活化小胶质细胞/巨噬细胞群迅速向损伤区域聚集，在损伤后3 d左右即可达到高峰，发挥浸润和吞噬作用的以往研究结果^[7]；②此次研究选择脊髓损伤后3 d作为时间点观察脊髓损伤后的炎症反应
选择动物的条件：	①SD大鼠；②SPF级；③健康成年；④体质量220 g；⑤雌雄各半
动物来源及品系：	SPF级SD大鼠购自上海斯莱克实验动物责任有限公司
造模技术描述：	沿背部T₉-T₁₁中线作长约3 cm切口，去除椎板，暴露脊髓；调整NYU打击器，设置打击高度1.25 cm，将打击杆瞄准并打击脊髓
动物数量及分组方法：	36只大鼠分为假手术组n=12、模型组n=12和甲强龙组n=12
造模成功评价指标：	①大鼠后肢回缩抽搐；②尾部痉挛性摆动
造模后实验观察指标：	①观察：大鼠脊髓神经元尼氏体形态，静脉血中白细胞介素1β和白细胞介素18表达；②激光共聚焦扫描显微镜观察：IBA-1/ED-1双阳性细胞数；③Western blot检测：ED-1蛋白表达；④qPCR检测：白细胞介素1β mRNA和白细胞介素18 mRNA表达
造模后动物处理：	麻醉成功后：①采集大鼠静脉血；②取损伤周围脊髓段约2 cm
伦理委员会批准：	实验方案经佛山市第一人民医院动物实验伦理委员会批准

1.5 主要观察指标

1.5.1 尼氏染色将5 μm厚石蜡组织切片采用梯度乙醇脱蜡至入水，使用尼氏染色液染色50 min，PBS漂洗，分色液分色2 min，晾干，中性树胶封固，镜下观察并拍片。

1.5.2 Elisa检测将采集的大鼠静脉血离心后，取上清液，按照Elisa试剂盒说明进行操作，依次检测大鼠静脉血中白细胞介素1β和白细胞介素18水平。

1.5.3 免疫荧光染色石蜡切片脱蜡入睡，漂洗后枸橼酸盐缓冲液高压修复，滴加封闭液室温孵育1 h，甩掉封闭液不洗，滴加IBA-1一抗(1∶200)和ED-1一抗(1∶200)混合液4 ℃过夜；第2天复温，漂洗后避光滴加Alexa Fluor 568(1∶200)和Alexa Fluor 488(1∶200)荧光二抗混合液，室温反应2 h，DAPI染色3 min，漂洗后封固，拍片。每个标本切6张切片，每个切片取6个视野图片，计数双阳性细胞数。

1.5.4 Western Blot检测脊髓组织冰浴60 min。采用BCA法定量蛋白。使用酶标仪检测标准曲线和吸光度，计算蛋白浓度。蛋白变性后，使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。转膜，封闭1.5 h，先后加入ED-1一抗(1∶1 000)和二抗(1∶1 000)，TBST漂洗。避光使用化学发光试剂显影，凝胶扫描成像系统进行分析。

1.5.5 qPCR检测提取总RNA后进行反转录，反应体系为20 μL。反应条件为：51 ℃反应2 min，96 ℃预变性 10 min，96 ℃变性10 s，退火60 ℃反应30 s，40个循环。先算出?Ct值，再将目的基因的表达差异计算出来，-??Ct = -(?Ct处理样本-?Ct未处理样本)。引物序列详见表1。

表1 引物序列表

Table 1 Primer sequences

名称	引物序列
白细胞介素1β	上游引物：5^'CTC TGA CAG GCA ACC ACT TAC 3^' 下游引物：5^'GAT GTG CTT GTG CTT CAT TCA TAA 3^'
白细胞介素18	上游引物：5^'TGT GAA GGA TGG AAG GAT GTC TA 3^' 下游引物：5^'AGT AGG TTA TCA TAA GGC TCG TGT A 3^'
GADPH	上游引物：5^'ACG GCA AGT TCA ACG GCA CAG 3^' 下游引物：5^'GAA GAC GCC AGT AGA CTC CAC GAC 3^'

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据采用x(_)±s表示。符合正态分布的数据，采用单因素方差分析。

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讨论

炎症是脊髓损伤发生后重要的病理反应之一^[8]。炎症释放的大量炎性因子以及炎性细胞浸润、聚集是导致神经元坏死、凋亡、自噬，轴突脱髓鞘，血管通透性改变和水肿等病理变化的重要原因^[9]。小胶质细胞作为中枢神经系统中的固有免疫细胞，在脊髓损伤发生后的炎症反应中发挥重要作用^[10]。正常状态下，小胶质细胞处于静止状态，对神经系统主要有支持、营养和保护作用。损伤发生后，受损组织和细胞释放的大量细胞因子和物质激活小胶质细胞，活化状态的小胶质细胞和外周血浸润的巨噬细胞混合一起，不易区分，共同组成活化小胶质细胞/巨噬细胞群，表达特异性标记物ED-1^[11]。脊髓损伤发生后活化小胶质细胞/巨噬细胞群迅速向损伤区域聚集，在损伤后3 d左右即可达到高峰，发挥浸润和吞噬作用^[7]。因此，此次研究选择损伤后3 d作为时间点进行观察。小胶质细胞被炎性递质、有毒物质以及三磷酸腺苷等物质激活后可通过多条通路介导炎症。其中，比较关键的通路为细胞膜通透性发生改变，细胞内外钠离子、钾离子和钙离子失衡，激活细胞的嘌呤受体以及NLRP3炎症体等，进一步活化Caspase1，对白细胞介素1β前体和白细胞介素18前体进去剪切，使其成熟为具有促炎作用的炎性因子并释放到细胞外^[12-14]。脊髓损伤发生后活化小胶质细胞参与的炎症反应对神经系统修复来说是一把双刃剑。一方面，损伤早期轻度小胶质细胞活化和炎症反应有利于清除坏死细胞和组织碎片，保护未损伤组织，促进组织修复^[15-16]；另一方面，随着损伤持续以及损伤-炎症恶性循环，过度小胶质细胞活化和持续高水平炎症反应产生大量炎性递质及细胞毒性物质，导致细胞坏死、凋亡、神经退行性变等阻碍组织修复的病理结果^[17-18]。此次研究亦证实，脊髓损伤发生后小胶质细胞可被大量激活，IBA-1/ED-1双阳性细胞显著增多，ED-1作为活化小胶质细胞的标记物，其蛋白表达量在脊髓损伤后显著增高，炎性因子白细胞介素1β和白细胞介素18的表达水平上调，从而介导炎症反应。由此可见，小胶质细胞是脊髓损伤发生后炎症反应的主要发动者和调控者，针对小胶质细胞活化进行干预，通过降低小胶质细胞活化程度进而维持低水平炎症是治疗脊髓损伤的新思路和切入点。

甲基强的松龙是一种临床常用糖皮质激素，具有很强的免疫抑制作用以及抗炎作用。美国国立急性脊髓损伤研究会(NASCIS)Ⅲ期临床研究证实，急性脊髓损伤早期使用高剂量甲基强的松龙冲击疗法治疗脊髓损伤是有效的^[19]。NASCIS提出了一套治疗急性脊髓损伤的标准方案，即脊髓损伤发生后尽早给予甲基强的松龙30 mg/kg 15 min内静脉滴注完成，45 min后给予甲基强的松龙 5.4 mg/(kg•h)23 h内持续静脉滴注^[20]。目前已知，甲基强的松龙的应用于脊髓损伤治疗中发挥的作用包括：能够抑制脊髓损伤后脂质过氧化反应^[21]，改善脊髓微循环并抑制细胞凋亡^[22]，抑制炎症和炎性物质释放^[23-24]，改善血管通透性和组织水肿^[25]，抑制兴奋性氨基酸毒性作用，促进神经营养因子等多种细胞因子释放等，但是，甲基强的松龙发挥作用的深入分子机制尚不清楚。

此次研究结果进一步证实，大剂量甲基强的松龙冲击疗法治疗脊髓损伤有助于损伤后神经元形态改善。同时，大剂量甲基强的松龙冲击疗法可有效降低炎性因子白细胞介素1β和白细胞介素18表达水平，抑制炎症，因此推测甲基强的松龙通过抑制炎症而有利于脊髓损伤后微环境的改善，使损伤处及损伤周围的组织环境有利于损伤后神经元修复，从而发挥一定的神经元保护作用。为了明确甲基强的松龙在脊髓损伤后抑制炎症的作用机制，此次研究将目标瞄准与神经系统炎症有密切关系的小胶质细胞，通过检测活化小胶质细胞数量及小胶质细胞活化的标记物，进一步发现甲基强的松龙可降低脊髓损伤后IBA-1/ED-1双阳性细胞数目即活化小胶质细胞数量以及ED-1蛋白表达，因此推测甲基强的松龙降低白细胞介素1β和白细胞介素18表达而抑制炎症的机制与其抑制小胶质细胞活化程度有关。这些结果说明甲基强的松龙可抑制脊髓损伤后小胶质细胞活化介导的炎症，从而降低损伤，有利于神经元修复。

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