1.1 设计 随机对照动物实验。组间进行t检验,多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2020年5 月至 2021年11月在空军军医大学西京医院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 选取湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供的60只SPF级SD雄性大鼠,合格证书为:SCXK(湘)2020-0009,体质量220-280 g,25 ℃、50%相对湿度、自然光照下饲养,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。实验方案经南部战区海军第二医院实验动物伦理委员会批准,批准号为202004-10。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术,并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 仪器与试剂 弗氏完全佐剂(货号:F5881,北京伊塔生物科技有限公司);miR-23b inhibitor(货号:hsa-miR-23b,百奥迈科生物技术有限公司);重组腺病毒载体转染试剂盒(货号:YIJI60036,上海一基实业有限公司);高速冷冻离心机(货号:5024R,德国Eppendorf公司);多聚甲醛(货号:158127,Sigma-AldrichLLC.公司);培养瓶(货号:430720,北京伊塔生物科技有限公司);巨噬细胞集落刺激因子(货号:BRP144,北京博尔西科技有限公司);培养箱(货号:D180-P,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);自动包埋机(货号:EG1150,德国Leica公司);苏木素染液(货号:G1080,北京索莱宝科技有限公司);伊红染液(货号:AG1100-100ml,上海吉至生化科技有限公司);光学显微镜(货号:CX-60,日本OLYMPUS公司);荧光实时定量PCR仪(货号:7500,美国 Invitrogen 公司);PowerPacTM 基础电泳仪(货号:164-5051,美国 Bio-Rad公司);实时Real-Time PCR 试剂盒(货号:7000,美国 ABI 公司);超纯RNA提取试剂盒(货号:SN0300,北京翔悦环宇科技发展有限公司);紫外分光光度计(货号:UH5700,上海正晃商贸有限公司);DNA Eraser(货号:21190,北京启维益成科技有限公司);cDNA 第一链合成试剂盒(货号:KR104,北京天根生化科技有限公司);免疫组化试剂盒(货号:YDDEF001,上海羽哚生物科技有限公司);DAB显色试剂盒(货号:R2751,北京康瑞纳生物科技有限公司);抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色试剂盒(货号:387A-1KT,上海宇劲生物技术有限公司);Triton X-100(货号:FT21411yy,上海梵态生物科技有限公司);鬼笔环肽-罗丹明标记(货号:BY23102,西安百萤生物科技有限公司);激光扫描共聚焦显微镜(货号:FV3000,奥林巴斯销售服务有限公司);转化生长因子β1抗体(货号:PL0304412,上海雅吉生物科技有限公司);生理盐水(货号:YT3740,北京伊塔生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠分组及风湿关节炎模型的建立 选取60只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常对照组、模型组、miR-NC组、miR-23b inhibitor组,每组15只。除正常对照组外,对其他3组大鼠进行风湿关节炎建模。首先将大鼠固定好,将其后肢消毒后,于足趾皮下注射0.1 mL的弗氏完全佐剂,7 d后再注射1次,观察大鼠后肢出现明显红肿且后肿胀持续,则视为建模成功,正常对照组同期给予同体积生理盐水。基因转染:按照重组腺病毒载体转染试剂盒说明书,将miR-NC、miR-23b inhibitor质粒与载体分别加入到不含血清的DMEM培养液中,混合均匀后室温条件下孵育10 min,然后分别取等量miR-NC、miR-23b inhibitor加入到脂质体中配置成转染液,密封保存以备后续实验。建模成功后1 d,miR-NC组尾静脉注射20 μL 1×108 L-1的miR-NC,miR-23b inhibitor组尾静脉注射20 μL 1×108 L-1的miR-23b inhibitor,均1次/d持续21 d,正常对照组、模型组同期尾静脉注射同体积生理盐水。
1.4.2 标本采集处理 在实验结束后将大鼠用75 mg/kg的氯胺酮麻醉处死,腹主动脉收集血样静置4 h,在4 ℃、3 500 r/min条件下离心10 min,取上清液于冰箱中密封保存。同时取双肢关节组织及滑膜组织,左肢滑膜组织用40 g/L的多聚甲醛溶液固定96 h后,生理盐水漂洗干净,放入冰箱中密封保存,右肢滑膜组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块后将其置入培养瓶内培养,24 h换1次培养液,待组织块间生长的成纤维细胞彼此接触时去除组织块,将其继续培养至3代后,将其接种于6孔板内,加入20 g/L巨噬细胞集落刺激因子进行诱导破骨细胞,然后将其置于体积分数5%CO2的培养箱中,在37 ℃的条件下培养3周,以备后续实验。
1.4.3 大鼠关节组织病理检测 取各组关节组织,用梯度乙醇依次脱水、二甲苯透明后,进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡处理,然后将切片用体积比为1∶19的冰醋酸和体积分数95%的乙醇固定1 min,自来水冲洗后,用苏木精-伊红染液染色,染色完成后,用梯度乙醇及二甲苯脱水、透明后,中性树胶封固处理,用光学显微镜进行组织病理学观察。
1.4.4 大鼠血清中miR-23b的mRNA检测 采用Real-time PCR 法检测,严格按照实时Real-Time PCR试剂盒步骤进行检测,取大鼠血清,用超纯RNA 提取试剂盒提取总RNA,用紫外分光光度计检测RNA纯度,用电泳仪检测其完整性,用DNA Eraser对残留DNA进行消化,然后根据cDNA 第一链合成试剂盒说明,进行反转录合成 cDNA;利用荧光实时定量PCR仪,在95 ℃条件下预变性10 min,变性30 s,70 ℃条件下延伸1 min,60 ℃条件下退火30 s,此循环进行40次,收集miR-23b的荧光信号,反应结束后用软件自动分析并绘制PCR 产物熔解曲线图,然后以同一样本中的U6的Ct值作为内参,采用2-ΔΔCt计算其基因相对表达量,miR-23b引物序列为,上游:ACA CTC CAG CTG GGA TCA CAT TGC CAG G,下游:CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG GGT AAT CC,154 bp;U6上游:CTC GCT TCG GCA GCA CA,下游:AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT,112 bp。
1.4.5 大鼠滑膜组织转化生长因子β1蛋白表达检测 采用免疫组化法进行检测,取各组大鼠滑膜组织,进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡后,在清水中冲洗一段时间,然后用体积分数3%的 H2O2去离子水孵育10 min,清水洗涤2次,PBS洗涤3次,高压修复3 min,冷却后在37 ℃,2%BSA条件下封闭30 min,按说明书用封闭液稀释一抗(1∶200),加入稀释的转化生长因子β1的一抗4 ℃冰箱过夜,PBS洗涤3次,加入二抗(1∶200),37 ℃轻摇室温孵育30 min;PBS洗涤5次,加入SP,37 ℃室温孵育30 min,PBS洗涤3次,用DAB进行8 min显色后,自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、中性树胶封固处理,用光学显微镜观察,然后用计算机病理图像处理系统对其阳性表达进行半定量测定,并用积分吸光度值来展示统计的结果。
1.4.6 滑膜成纤维细胞诱导破骨细胞TRAP染色观察破骨细胞形成情况 根据TRAP染色试剂盒使用说明书,取各组诱导完成的破骨细胞,PBS洗涤3次,室温下40 g/L多聚甲醛固定10 min后,去离子水洗涤3次,加入37 ℃预热的TRAP染色液,避光染色1 h,去离子水洗涤3次后,苏木素染色1 min,PBS洗涤3次,待干燥后用中性树胶进行封固,在光学显微镜下拍照观察,TRAP阳性细胞核≥3的为破骨细胞,然后用计算机病理图像处理系统对其阳性表达进行半定量测定,并用积分吸光度值来展示统计的结果。
1.4.7 滑膜成纤维细胞诱导破骨细胞鬼笔环肽染色观察肌动蛋白环变化 取各组诱导完成的破骨细胞,PBS洗涤3次,室温下40 g/L多聚甲醛固定10 min,PBS洗涤3次后,加入0.1% 的Triton X-100透膜10 min,在5% BSA条件下封闭60 min,PBS洗涤3次,用罗丹明标记的鬼笔环肽避光染色30 min,PBS洗涤3次后,用DAPI核染3 min,PBS洗涤3次,用荧光封片液封固,在激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照,绿色为肌动蛋白环,蓝色为细胞核,然后用计算机病理图像处理系统对其阳性表达进行半定量测定,并用积分吸光度值来展示统计的结果。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠关节组织苏木精-伊红染色观察;②血清中miR-23b mRNA相对表达情况;③滑膜组织转化生长因子β1蛋白表达情况;④滑膜成纤维细胞诱导破骨细胞TRAP染色观察;⑤滑膜成纤维细胞诱导破骨细胞鬼笔环肽染色观察。
1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0对各组大鼠观察指标进行统计分析,实验数据采用x±s描述,组间进行t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经南部战区海军第二医院生物统计学专家审核。