机械牵张对人肺上皮细胞纤维增殖的影响

doi:10.12307/2022.560

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3821-3825.doi: 10.12307/2022.560

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

机械牵张对人肺上皮细胞纤维增殖的影响

张容，梁珍婷，杨淳，刘冬冬，席寅，张洁，王亚，徐永昊，刘晓青，黎毅敏

广州医科大学附属第一医院广州呼吸健康研究院呼吸与危重症医学科，广东省广州市 510120

收稿日期:2021-07-03 接受日期:2021-08-30 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 黎毅敏，博士，主任医师，广州医科大学附属第一医院广州呼吸健康研究院呼吸与危重症医学科，广东省广州市 510120
作者简介:张容，女，1986年生，在读博士，主治医师，主要从事呼吸机相关肺损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81700080)，项目负责人：张容

Effects of mechanical stretch on fiber proliferation in human lung epithelial cells

Zhang Rong, Liang Zhenting, Yang Chun, Liu Dongdong, Xi Yin, Zhang Jie, Wang Ya, Xu Yonghao, Liu Xiaoqing, Li Yimin

Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Guangzhou Institute of Respiratory Disease, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Received:2021-07-03 Accepted:2021-08-30 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: Li Yimin, MD, Chief physician, Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Guangzhou Institute of Respiratory Disease, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Zhang Rong, Doctoral candidate, Attending physician, Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Guangzhou Institute of Respiratory Disease, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81700080 (to ZR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
转化生长因子β1：是转化生长因子β超家族成员之一，由2条单链组成的一类能够调节细胞生长和分化的多肽。体内的转化生长因子β1通常以非活性形式存在，活化后的转化生长因子β1与受体结合可激活相关信号通路并表现出生物活性，加速器官纤维化的发生，是调节细胞生长、促进组织纤维化的重要细胞因子。
BEAS-2B细胞：是人正常支气管上皮细胞。最初从1名非癌个体的正常人支气管上皮病理切片中分离出上皮细胞，由腺病毒12-SV40病毒杂交病毒感染并克隆，经连续传代后生命周期延长并已永生化。目前，国内外常利用这株细胞对辐射、牵张、化学物致癌及分化等机制进行研究。

背景：机械通气是目前重症呼吸疾病重要有效的治疗支持手段之一，但不适当的机械通气可使肺损伤加重，甚至纤维化形成。如何最大程度减少呼吸机相关肺损伤，发挥呼吸机的真正保护作用显得至关重要。肺是一个力学器官，机械通气使肺泡反复充气，对邻近的肺上皮细胞产生牵张作用，使其处于一个非正常的损伤修复过程。因此，过度机械牵张在促进肺纤维增殖发生中可能扮演重要角色。目前国内外关于机械牵张对肺上皮细胞纤维增殖的影响报道较少，其具体发生机制并不清楚。
目的：观察不同机械牵张强度及牵张时间对人肺上皮BEAS-2B细胞中转化生长因子β1、波形蛋白及Ⅰ型胶原表达的影响。
方法：体外培养人肺上皮细胞株 BEAS-2B，取对数生长期的细胞分为静止对照组、10%牵张组、20%牵张组。采用FX-5000T 细胞应力加载系统对人肺上皮BEAS-2B细胞以频率20次/min，正弦波形式分别牵张24，48，72 h，采用倒置显微镜观察细胞形态变化，RT-qPCR和免疫荧光方法检测转化生长因子β1、Ⅰ型胶原mRNA表达及波形蛋白表达变化。
结果与结论：①静止对照组BEAS-2B细胞呈卵圆形贴壁生长，20%牵张组牵张72 h后细胞形态由鹅卵圆形变为长梭样，细胞间隙增宽；②随着机械牵张强度的增加，BEAS-2B细胞中转化生长因子β1、Ⅰ型胶原mRNA表达及波形蛋白水平较静止对照组均增加，并呈时间依赖趋势 (P < 0.05)；与静止对照组比较，10%牵张组转化生长因子β1、Ⅰ型胶原mRNA及波形蛋白变化不明显；③结果表明，过度机械牵张可刺激人肺上皮BEAS-2B细胞中转化生长因子β1、波形蛋白及Ⅰ型胶原表达增加，过度机械牵张在促进肺纤维增殖发生中发挥重要作用。

https://orcid.org/0000-0003-2184-0546 (张容)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 机械牵张, 肺上皮细胞, 肺纤维增殖, 转化生长因子β1, 波形蛋白

Abstract: BACKGROUND: Mechanical ventilation is currently one of important and effective treatment and support methods for severe respiratory diseases, but improper mechanical ventilation can aggravate lung injury and even form fibrosis. How to minimize the lung damage associated with the ventilator and play real protective role of the ventilator is very important. The lung is a mechanical organ. Mechanical ventilation causes the alveoli to be inflated repeatedly, which stretches the neighboring lung epithelial cells, and puts it in an abnormal damage repair. Therefore, excessive mechanical stretch may play an important role in promoting the occurrence of lung fibrosis. At present, there are few reports on the effect of mechanical stretch on the proliferation of lung epithelial cells at home and abroad, and the specific mechanism is not clear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of different mechanical stretch strengths and stretch time on expression of transforming growth factor β1, vimentin, and type I collagen in human lung epithelial BEAS-2B cells.
METHODS: Human lung epithelial BEAS-2B cells were cultured in vitro. Cells at logarithmic growth phase were divided into control static group, 10% stretch group, and 20% stretch group. The FX-5000 system was used to stretch BEAS-2B cells at 20 times/min and sine wave for 24, 48, and 72 hours. The morphological changes in cells were observed with the inverted microscope. The expression levels of transforming growth factor β1, vimentin, and type I collagen mRNA were evaluated by RT-qPCR and immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) BEAS-2B cells displayed cobblestone morphology and linked closely in the control static group. The cell morphology changed from cobblestone shape into long spindle, and intercellular space increased obviously after 20% mechanical stretch for 72 hours. (2) The expression of mRNA and protein of transforming growth factor β1, vimentin, and type I collagen in human lung epithelial BEAS-2B cells was up-regulated with increasing stretch force in a time-dependent manner compared with the control static group (P < 0.05). Compared with the control static group, the changes in transforming growth factor β1, vimentin, and type I collagen were not significant in the 10% stretch group. (3) It is concluded that mechanical stretch increases the expression of transforming growth factor β1, vimentin, and type I collagen in human lung epithelial BEAS-2B cells. Excessive mechanical stretch plays an important role in promoting lung fiber proliferation.

Key words: mechanical stretch, lung epithelial cells, pulmonary fibrosis, transforming growth factor β1, vimentin

中图分类号:

张容, 梁珍婷, 杨淳, 刘冬冬, 席寅, 张洁, 王亚, 徐永昊, 刘晓青, 黎毅敏. 机械牵张对人肺上皮细胞纤维增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3821-3825.

Zhang Rong, Liang Zhenting, Yang Chun, Liu Dongdong, Xi Yin, Zhang Jie, Wang Ya, Xu Yonghao, Liu Xiaoqing, Li Yimin. Effects of mechanical stretch on fiber proliferation in human lung epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3821-3825.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计体外人肺上皮细胞牵张实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于 2018年1月至2020年5月在广州医科大学国家呼吸重点实验室完成。
1.3 材料人肺上皮BEAS-2B细胞(ATCC，Rockville，USA)；Flexcell® Tension Plus FX-5000T应变加载系统(Flexcell公司，USA)；鼠抗人波形蛋白单抗(BD Transduction Laboratories，San Jose，CA)；山羊抗鼠Cy3二抗和山羊抗鼠异硫氰酸荧光素(FITC，EaahOx公司，加拿大)；Trizol RNA提取液(Invitrogen，USA)；SYBRPremix Ex TaqTM荧光定量PCR、Reverse Transcription System试剂盒(TaKaRa，日本)；DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰酶(Gibco，USA)；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；CO2孵箱中(Sanyo公司，日本)；6孔牵张培养板(Flexcell公司，美国)。
1.4 方法
1.4.1 细胞牵张和实验分组人肺上皮BEAS-2B细胞在37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱中进行传代培养，以4×105个/孔密度接种至Bioflex硅胶弹性细胞双向拉力6孔牵张培养板，静置培养24 h后换用无血清DMEM/F12培养基继续培养12 h。实验使用细胞牵张力加载装置，加载程序由FX-5000计算机软件自动控制，细胞所受力值大小由培养皿底部弹性膜拉伸应变率(%)表示，牵张频率为20次/min，以正弦波进行牵张，牵张时间分别为24，48，72 h。
实验分为3组：静止对照组、10%牵张组、20%牵张组，均置于37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱进行培养。每个实验重复3次。

1.4.2 荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 细胞受牵张刺激后，采用TRIZOL提取细胞RNA，经紫外分光光度法测定纯度和浓度后，按试剂盒DRR037说明反转录成cDNA。应用Premier5.0软件设计转化生长因子β1 、Ⅰ型胶原引物，见表1，均由上海英俊有限公司合成。qPCR反应体系为20 μL(SYBG Primer Ex Taq 10 μL，PCR Forward Primer 0.4 μL，PCR Reverse Primer 0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.8 μL)，每孔设置3个复孔。qPCR反应条件：预变性95 ℃(30 s)，PCR反应95 ℃(5 s)，退火60 ℃(30 s)，40个循环。qPCR根据2-ΔΔCt方法计算转化生长因子β1 、Ⅰ型胶原mRNA表达水平。GAPDH基因的扩增产物为内参照。

1.4.3 细胞免疫荧光检测蛋白表达变化将牵张刺激后的细胞以2×104/孔接种于预先放有盖玻片的24孔培养板，用无血清DMEM/F12培养基静置培养24 h后去除培养基，PBS清洗，40 g/L多聚甲醛溶液固定10 min，羊血清封闭1 h，0.2%曲通-X100室温孵育5 min，鼠抗人波形蛋白单抗(1∶100)孵育过夜，PBS清洗5 min×3次，用FITC标记的山羊抗鼠二抗避光室温孵育60 min，PBS清洗5 min×3次，加入DAPI孵育10 min，抗荧光淬灭封固剂(甘油-PBS)封固，共聚焦显微镜下观察、成像。
1.5 主要观察指标 ①显微镜下观察机械牵张后肺上皮细胞形态变化；②RT-PCR检测机械牵张后人肺上皮细胞中转化生长因子β1、Ⅰ型胶原mRNA表达；③免疫荧光技术检测机械牵张后人肺上皮细胞中波形蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism version 5.00c统计软件进行统计学处理，计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

机械通气为重症呼吸衰竭患者临床支持治疗的手段之一，然而越来越多证据表明机械通气是一把“双刃剑”，在其发挥治疗作用同时，不适当的机械通气可引起或加重原有肺损伤，甚至导致肺损伤后修复过度发生纤维增殖[10-12]。PAPAZIAN等[13]对接受机械通气时间大于5 d的急性呼吸窘迫综合征患者开胸肺活检，其并发肺纤维化的发生率高达53%。MARTIN等[14]研究表明对于接受机械通气时间平均为12 d的急性呼吸窘迫综合征患者中，并发肺纤维化的发生率高达64%。关于机械通气对肺纤维化的影响及可能的作用机制目前并不十分清楚，相关研究目前国内外相对较少。
该实验采用Flexercell 5000基底膜拉伸系统加载装置建立体外肺上皮细胞牵张模型，细胞所受的应力为均一性的。TSCHUMPERLIN等[15]研究表明肺上皮基底膜表面积增加25%时，相当于8%-12%牵张应力，这是生理范围内的牵张；当肺上皮基底膜表面积增加37%-50%时，相当于17%-22%牵张应力，这种病理牵张会对细胞造成损伤。该实验以人肺上皮细胞BEAS-2B为研究对象，采用10%和20%的牵张应力分别代表生理性牵张和病理性牵张，从体外实验研究生理性牵张和病理性牵张以及不同牵张时间对BEAS-2B细胞纤维增殖的影响。首先从细胞形态证实20%机械牵张诱导BEAS-2B细胞发生形态改变，未牵张的BEAS-2B细胞呈典型的上皮细胞形态，经过度的机械牵张刺激后，部分细胞由鹅卵圆形转变为梭形长条样，相邻细胞间连接变得疏松。进一步从基因和蛋白水平检测了转化生长因子β1、波形蛋白和Ⅰ型胶原表达的变化，20%机械牵张刺激细胞后，转化生长因子β1、波形蛋白和Ⅰ型胶原表达都有不同程度升高，提示过度机械牵张引起肺上皮细胞纤维增殖改变。
过度机械牵张引起肺上皮细胞纤维增殖的具体分子机制目前并不十分清楚。课题组前期研究表明过度的机械牵张会引起肺上皮损伤，持续的上皮损伤可以导致病理性修复发生细胞转分化[15]。转化生长因子β1目前被公认为是器官纤维化进程中关键的致纤维化因子[8，16]。DING等[17]研究表明机械牵张可以诱导心肌细胞中转化生长因子β1上调，在心肌肥大发展到心肌纤维化过程中起重要作用；HAMZEH等[18]研究表明机械牵张可使人肾小管上皮细胞中转化生长因子β1表达上调，在牵张诱导的肾纤维化进程中起重要作用。近年也有国外研究表明机械牵张通过上调转化生长因子β1促进动物和人肺纤维化进展[15]。研究结果显示肺上皮细胞给予20%牵张作用24，48，72 h，转化生长因子β1表达水平出现升高；在10%牵张72 h后，转化生长因子β1表达水平也出现升高，不同牵张强度及牵张时间对肺上皮细胞转化生长因子β1的表达有影响，提示转化生长因子β1可能在机械牵张引起肺上皮细胞纤维增殖分化过程中起重要作用。既往研究表明转化生长因子β1可以促进上皮间质转化，抑制成纤维细胞的凋亡，还可促进一系列的促纤维化细胞因子的合成，导致持续的纤维化反应[19-21]。因此，当机体内环境稳态被打破，如机械牵张后肺上皮细胞受损，机体进行损伤修复，释放多种促纤维化因子，持续的上皮损伤可活化转化生长因子β1，相关信号通路发生了改变，合成大量细胞外基质，导致病理性修复，介导肺纤维细胞增殖的发生。
该研究对肺上皮细胞予以20% 牵张作用72 h后，发现Ⅰ型胶原mRNA表达及波形蛋白表达明显增加。大量研究表明肺纤维增殖是机体对损伤性刺激的一种异常且过度的修复过程[22-24]，其主要病理特征是大量细胞外基质沉积、肺组织结构破坏，尤其是在组织重构期，Ⅰ型胶原逐渐替代Ⅲ型胶原，交叉偶联增加[24-26]。Ⅰ型胶原是不溶性纤维型蛋白质，属于一类细胞外基质，Ⅰ型胶原含量增加会使组织纤维化程度加重，其分泌增多是纤维增殖形成的特征性表现[27]。在呼吸机相关性肺损伤动物模型中，既往也有研究表明过度的机械牵张力可促进肺部胶原的产生，机械通气模式与肺部胶原生成有关[28-29]。该研究在体外水平表明过度机械牵张可促进肺上皮细胞胶原的产生。波形蛋白是一种细胞骨架蛋白，附着于细胞核、内质网及线粒体的旁边或末端，对维持细胞形状、完整性及稳定细胞骨架起重要作用，同时也是细胞分化过程中最先表达的蛋白[30]。研究结果提示在病理性机械损伤刺激下，肺上皮细胞可能通过刺激产生转化生长因子β1发生细胞表型与功能的变化。
以往研究认为肺纤维化主要与持续炎症有关，但抗炎治疗并未能取得满意疗效[31]。近年来在其他领域纤维化的研究中，上皮细胞被证实参与了肾脏与肝脏纤维化的病理过程，使研究者认识到肺上皮细胞可能亦参与了肺纤维化的发生发展过程[32]。WILLIS等[33]研究结果使人们认识到肺纤维化并不是一个持续性炎症过程，而是一个非正常的损伤修复过程。在损伤修复过程中处于核心地位的是上皮细胞的损伤修复。研究显示在重症医学科监护病房，超过80%行机械通气的患者出现不同程度的肺上皮损伤[34]。因此，未来机械通气对肺上皮细胞纤维增殖的影响值得引起关注。
该研究也存在一定的局限性：首先，体内环境极为复杂，与体外实验环境有很大差别，且影响因素众多，机械通气对肺纤维增殖的影响必然受到其他细胞如内皮细胞、成纤维上皮细胞等的影响；其次，机械牵张具体通过哪些分子信号通路影响纤维细胞增殖，如何阻断机械性信号向生物化学性信号转导，从而减轻肺纤维增殖，未来仍然需要更深入的研究。
综上所述，过度机械牵张可导致肺上皮细胞持续受损，转化生长因子β1表达增加，波形蛋白表达上调，骨架蛋白发生改变，同时合成大量细胞外基质，促进细胞纤维增殖，导致病理性修复，介导肺纤维增殖发生，该研究从细胞力学水平为呼吸机相关肺损伤的发病机制提供了理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

机械牵张对人肺上皮细胞纤维增殖的影响

Effects of mechanical stretch on fiber proliferation in human lung epithelial cells

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