甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架的制备与表征

doi:10.12307/2024.531

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (22): 3517-3523.doi: 10.12307/2024.531

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甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架的制备与表征

袁勋1，2，丁振罡1，付力伟2，吴江2，郑亚哲1，2，张智超2，田广招2，眭翔2，刘舒云2，郭全义1，2

1贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；2解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2023-09-14 接受日期:2023-11-02 出版日期:2024-08-08 发布日期:2024-01-20
通讯作者: 郭全义，博士，主任医师，教授，贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853
作者简介:袁勋，男，1993年生，贵州省贵阳市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事软骨组织工程相关方向的研究。
基金资助:
国家重点研发计划课题项目(2019YFA0110600)，项目负责人：郭全义

Preparation and characterization of methacryloylated hyaluronic acid/acellular Wharton’s jelly composite hydrogel scaffold

Yuan Xun1, 2, Ding Zhengang1, Fu Liwei2, Wu Jiang2, Zheng Yazhe1, 2, Zhang Zhichao2, Tian Guangzhao2, Sui Xiang2, Liu Shuyun2, Guo Quanyi1, 2

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Institute of Orthopedics, First Medical Center, General Hospital of Chinese PLA, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine, Military Key Laboratory of Orthopedic Warfare Trauma, Beijing 100853, China

Received:2023-09-14 Accepted:2023-11-02 Online:2024-08-08 Published:2024-01-20
Contact: Guo Quanyi, MD, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Institute of Orthopedics, First Medical Center, General Hospital of Chinese PLA, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine, Military Key Laboratory of Orthopedic Warfare Trauma, Beijing 100853, China
About author:Yuan Xun, Master candidate, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Institute of Orthopedics, First Medical Center, General Hospital of Chinese PLA, Beijing Key Laboratory of Orthopedic Regenerative Medicine, Military Key Laboratory of Orthopedic Warfare Trauma, Beijing 100853, China
Supported by:
National Key Research and Development Plan Project, No. 2019YFA0110600 (to GQY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

甲基丙烯酰化透明质酸：是采用甲基丙烯酸酐对透明质酸进行改性得到的一种改性透明质酸水凝胶，含有化学活性取代基，可通过紫外线照射快速聚合，具有良好的可复制性和理化性能可调节特性，被视为良好的光固化打印生物材料。
脱细胞华通胶：是由人脐带剥离血管及表面被膜后得到的胶冻样组织，具有与软骨组织相似的组成和功能，被认为是组织工程软骨的潜在支架材料。

背景：随着组织工程为关节软骨损伤修复这一世界难题带来了新的希望，构建成分仿生的光固化3D打印水凝胶支架对软骨组织工程具有重要意义。

目的：通过数字光处理3D打印技术构建成分仿生的甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架，评价其生物相容性。
方法：从人脐带中分离提取华通胶组织后进行脱细胞处理，冷冻干燥后磨成粉末，溶于PBS中制备50 g/L的脱细胞华通胶溶液。制备甲基丙烯酰化透明质酸，冻干后溶于PBS中制备50 g/L的甲基丙烯酰化透明质酸溶液。将脱细胞华通胶溶液与甲基丙烯酰化透明质酸溶液以体积比1∶1混合，加入光引发剂后作为生物墨水。通过数字光处理3D打印技术分别制备甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶支架(记为HAMA水凝胶支架)与甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架(记为HAMA/WJ水凝胶支架)，表征支架的微观结构、溶胀性能、生物相容性与促软骨分化性能。

结果与结论：①扫描电镜下见两组支架均呈三维立体的网状结构，其中HAMA/WJ水凝胶支架纤维连接更加均匀；两组支架均在10 h内达到溶胀平衡，HAMA/WJ水凝胶支架的平衡溶胀比低于HAMA水凝胶支架(P < 0.05)。②CCK-8实验显示相较于HAMA水凝胶支架，HAMA/WJ水凝胶支架可促进骨髓间充质干细胞的增殖；死活染色显示骨髓间充质干细胞在两组支架上生长良好，并且HAMA/WJ水凝胶支架上的细胞立体分布均匀、细胞数量更多；鬼笔环肽染色显示相较于HAMA水凝胶支架，HAMA/WJ水凝胶支架上的骨髓间充质干细胞黏附与铺展更佳。③将骨髓间充质干细胞接种于两组支架后进行成软骨诱导培养，qRT-PCR检测结果显示，HAMA/WJ水凝胶支架组聚集蛋白聚糖、SOX9、Ⅱ型胶原mRNA表达量均高于HAMA水凝胶支架组(P < 0.05，P < 0.01)。④结果表明，数字光处理3D生物打印HAMA/WJ水凝胶支架可促进骨髓间充质干细胞的增殖、黏附及成软骨分化。

https://orcid.org/0009-0003-2356-399X(袁勋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 华通胶, 甲基丙烯酰化透明质酸, 水凝胶, 支架, 数字光处理3D打印, 软骨损伤, 骨髓间充质干细胞, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: As tissue engineering brings new hope to the worldwide problem of articular cartilage repair, the construction of light-curing 3D printed hydrogel scaffolds with biomimetic composition is of great significance for cartilage tissue engineering.
OBJECTIVE: To construct a biomimetic methacryloylated hyaluronic acid/acellular Wharton’s jelly composite hydrogel scaffold by digital light processing 3D printing technology, and to evaluate its biocompatibility.
METHODS: Wharton’s jelly was isolated and extracted from human umbilical cord, then decellulated, freeze-dried, ground into powder, and dissolved in PBS to prepare 50 g/L acellular Wharton’s jelly solution. Methylallylated hyaluronic acid was prepared, lyophilized and dissolved in PBS to prepare 50 g/L methylallylated hyaluronic acid solution. Acellular Wharton’s jelly solution was mixed with methacrylyacylated hyaluronic acid solution at a volume ratio of 1:1, and was used as bio-ink after adding photoinitiator. Methylacrylylated hyaluronic acid hydrogel scaffolds (labeled as HAMA hydrogel scaffolds) and methylacrylylated hyaluronic acid/acellular Wharton’s jelly gel scaffolds (labeled as HAMA/WJ hydrogel scaffolds) were prepared by digital light processing 3D printing technology, and the microstructure, swelling performance, biocompatibility, and cartilage differentiation performance of the scaffolds were characterized.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under scanning electron microscope, the two groups of scaffolds showed a three-dimensional network structure, and the fiber connection of HAMA/WJ hydrogel scaffold was more uniform. Both groups achieved swelling equilibrium within 10 hours, and the equilibrium swelling ratio of HAMA/WJ hydrogel scaffold was lower than that of HAMA hydrogel scaffold (P < 0.05). (2) CCK-8 assay showed that HAMA/WJ hydrogel scaffold could promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells compared with HAMA hydrogel scaffold. Dead/live staining showed that bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the two groups of scaffolds, and the cells on the HAMA/WJ hydrogel scaffolds were evenly distributed and more cells were found. Phalloidine staining showed better adhesion and spread of bone marrow mesenchymal stem cells in HAMA/WJ hydrogel scaffold than in HAMA. (3) Bone marrow mesenchymal stem cells were inoculated into the two groups for chondrogenic induction culture. The results of qRT-PCR showed that the mRNA expressions of agglutinoglycan, SOX9 and type II collagen in the HAMA/WJ hydrogel scaffold group were higher than those in the HAMA hydrogel scaffold group
(P < 0.05, P < 0.01). (4) These findings indicate that the digital light processing 3D bioprinting HAMA/WJ hydrogel scaffold can promote the proliferation, adhesion, and chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: Wharton’s jelly, methylacryloyl hyaluronic acid, hydrogel, scaffold, digital light processing 3D printing, cartilage injury, bone marrow mesenchymal stem cell, tissue engineering

中图分类号:

袁勋, 丁振罡, 付力伟, 吴江, 郑亚哲, 张智超, 田广招, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. 甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架的制备与表征[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3517-3523.

Yuan Xun, Ding Zhengang, Fu Liwei, Wu Jiang, Zheng Yazhe, Zhang Zhichao, Tian Guangzhao, Sui Xiang, Liu Shuyun, Guo Quanyi. Preparation and characterization of methacryloylated hyaluronic acid/acellular Wharton’s jelly composite hydrogel scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(22): 3517-3523.

图/表（结果） 7

2.1 脱细胞前后华通胶的大体观和组织学染色见图1。

图1A为人脐带大体观，图1G为脱细胞并冻干后平衡盐液重悬的脱细胞华通胶溶液，呈白色偏透明胶状。
为了检测华通胶脱细胞情况，使用苏木精-伊红染色和DAPI染色检测脱细胞前后华通胶中的细胞核存在情况，脱细胞前华通胶中存在大量的细胞核结构(图1B，C)，经脱细胞处理后无明显的细胞核结构(图1H，I)，表明脱细胞成功。
为了评估脱细胞后华通胶中成分的保留情况分别进行了番红O、甲苯胺蓝、天狼猩红染色，实验结果表明，脱细胞前华通胶中富含大量的糖胺多糖及胶原成分(图1D-F)，经脱细胞处理后仍保留了大量的糖胺多糖及胶原成分(图1J-L)。
2.2 两组水凝胶支架的大体观及微观结构见图2。

实验成功打印构建了两种生物墨水支架，支架大体为圆形，经纬交叉呈网络状结构，网状结构整齐，加入华通胶后的支架呈黄白色。扫描电镜下可见两组支架呈现三维立体的网状结构，孔与孔之间相互贯通，大孔径基本相似，为500-600 μm大小，加入华通胶后纤维间连接更加均匀，有利于细胞的活动和伸展。
2.3 两组水凝胶支架的溶胀性能图3为两组水凝胶支架的动态溶胀曲线，在前4 h内两组水凝胶支架均能快速吸收水分溶胀增重，6-8 h达到巅峰，10 h后基本达到溶胀平衡，HAMA/WJ水凝胶支架的平衡溶胀比低于HAMA水凝胶支架(P < 0.05)。

2.4 两组含细胞水凝胶支架中的细胞增殖情况如图4所示，随着骨髓间充质干细胞在水凝胶支架中培养时间的延长，细胞的增殖能力逐渐增强，两组培养第1，4天的细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，HAMA/WJ水凝胶支架组培养第7天的细胞增殖吸光度值高于HAMA水凝胶支架组(P < 0.05)。说明两组水凝胶支架的生物相容性良好，同时华通胶的加入使得水凝胶支架具有更强的促进骨髓间充质干细胞生长和增殖作用。

2.5 两组含细胞水凝胶支架的死活染色死活染色显示，两组含细胞水凝胶支架中均可见大量绿色荧光标记的活细胞，较少见红色荧光标志的死细胞，并且HAMA/WJ水凝胶支架中的细胞呈立体分布、细胞数量更多，见图5，说明骨髓间充质干细胞在两种支架上均能良好存活，并且在HAMA/WJ水凝胶支架中细胞增殖更多。

2.6 两组含细胞水凝胶支架中的细胞伸展及形态观察鬼笔环肽染色显示两组水凝胶支架中的骨髓间充质干细胞呈伸展状态，细胞呈梭形形态，并且HAMA/WJ水凝胶支架中的细胞舒展更好，见图6。

2.7 两组含细胞水凝胶支架的体外成软骨分化基因表达检测 qRT-PCR检测结果显示，HAMA/WJ水凝胶支架组聚集蛋白聚糖、SOX9、Ⅱ型胶原mRNA表达量均高于HAMA水凝胶支架组(P < 0.05，P < 0.01)，两组Ⅰ型胶原mRNA表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。

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引言

成人关节软骨在发育过程中逐渐失去血管和神经，因此其损伤的修复极其缓慢而困难，导致关节软骨发生退变，进而恶化为骨关节炎，最终转归为持续的疼痛和严重的残疾，从而无可避免地需进行关节置换[1]。传统干预关节退变的手段如微骨折术、自体软骨细胞移植术等的治疗效果十分有限[2]。近年来，迅速发展的组织工程学技术让软骨修复与再生成为新的可能，然而支架原料的选择以及支架的制备工艺仍是软骨组织工程需要解决的重要矛盾[3]。
组织工程学的最终目标是构建受损组织或器官的生物替代品，这就决定了组织工程学软骨支架的设计与合成需尽可能地模拟体内微环境[4]。在过去的几十年里，水凝胶因其制备的通用性、良好的生物相容性以及与天然细胞外基质的相似性等出众特性可为细胞和组织提供有效力学支持和适宜的生长微环境，作为生物材料被广泛应用于组织工程中[5]。在众多的水凝胶材料中，甲基丙烯酰化透明质酸是在透明质酸分子链上引入甲基丙烯基团制备合成的具有光固化能力的半合成生物材料。透明质酸是存在于关节软骨组织中的多糖[6-7]，可影响细胞的增殖、迁移、附着和分化[8]。透明质酸是软骨组织工程的一个重要组成部分，多项研究表明，透明质酸和甲基丙烯酰化透明质酸可调节体内外各种培养系统中软骨细胞的合成代谢[9]。
脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，大多数脐带在胎儿分娩后被当做医疗废物经由医院统一处理。华通胶占人脐带构成成分的60%-70%，其主要功能是防止脐带血管的压缩、扭转和弯曲，为脐带血管提供缓冲、保护和结构支撑。华通胶的主要成分为透明质酸、黏多糖及胶原等，并且无血管、神经支配和淋巴，在成分组成上和软骨极其相似。产妇分娩前基本都具备完善的建档及产检流程，对于脐带溯源和避免疾病传播都有良好帮助，由于脐带为分娩时的附属产物经告知后多数产妇会同意捐献，伦理矛盾较小[10]。基于以上生物学特征，华通胶被众多研究人员视为是软骨组织工程支架极具潜力的材料来源[11-14]。
近来，3D打印因其对复杂结构的高度精度还原及高精度快速生产逐渐成为组织工程领域中一种极具前途的技术，现行使用最多的3D打印手段以挤出式逐层打印为主，其中就包括熔融沉积制造技术、低温沉积制造。熔融沉积制造技术多用于耐高温的高分子材料或使用有机溶剂去调和生物墨水，这极大限制了打印材料的选择面，并且还将面临使用有机溶剂时出现有毒成分残留的情况[15]。低温沉积制造技术解决了高温对生物材料生物活性因子的破坏和需添加有机溶剂的问题，但却还是存在一些挤出式打印无法解决的问题，如挤出式打印速度慢、打印期间生物材料的生物活性因子可能失去活性和受挤出喷头大小和线性逐层打印的方式影响其微观结构精度欠佳的问题[16]。近来，出现一种新的3D打印技术——数字光处理：首先利用打印机扫描软件扫描打印模型的整体结构，然后进行最小精度可达1 μm的切片，通过投影机播放切片幻灯，每一个切片在生物墨水层很薄的区域产生光聚合反应固化并形成模型的一个薄层，然后成型台移动一层，投影机继续播放下一张幻灯片、继续加工下一层，如此循环，直至模型打印完成，成型精度高、打印速度极快。数字光处理能够以3 μm至1 μm的高精度高效制造水凝胶结构，这解决了打印支架微观结构精度欠佳的问题[17]。数字光处理比挤出式打印方式快几个数量级，并且对于温度没有特殊要求，这对保持生物材料墨水中生物活性因子的活性有着巨大优势。光固化3D打印最为人质疑之处在于生物墨水固化过程中需添加光引发剂和打印过程中光对细胞的影响，既往研究显示随着打印墨水中光交联基团的增多，可减少光引发剂的剂量以减少对细胞的影响；其次，数字光处理打印过程中使用的光为405 nm的纯紫光，属于可见光范围，短时间的照射对于细胞没有明显影响[17-18]。
实验旨在基于数字化光处理3D打印技术制备软骨组织工程甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架(记为HAMA/WJ水凝胶支架)，并研究该支架作为软骨组织工程支架的适用性，观察支架内大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化情况，评价支架的生物相容性和生物学性能，为后续体内修复实验提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察实验，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2022年5月至2023年5月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 人脐带与实验动物正常足月妊娠新生儿脐带由中国人民解放军总医院第一医学中心妇产科提供，已获得产妇及其家属知情同意。出生48 h SD大鼠乳鼠10只，雌雄不拘，体质量12-18 g，购自中人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2019-0010。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验方案已获得中国人民解放军总医院伦理委员会批准。
1.3.2 主要试剂及仪器 BP8601 Pro投影式光固化生物3D打印机(苏州永沁泉智能设备有限公司，中国)； DMEM/F-12培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗(Gibco公司，美国)；0.25%胰蛋白酶(Sigma公司，美国)；甲基丙烯酸酐、透明质酸(上海阿拉丁生物试剂有限公司，中国)；大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒[赛业(广州)生物科技有限公司，中国]；预混实时荧光定量快速 PCR 反应体系(GenStar，加拿大)；Actin微丝红色荧光探针(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)；DAPI染液(Molecular Probes公司，美国)；甲苯胺蓝染色试剂盒(北京瀚海拓新生物技术有限公司，中国)；苏木精-伊红染色液、番红O染色及天狼星红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛(北京化学试剂有限公司，中国)；扫描电子显微镜(Hitachi S-4800 型，日本)；EPOCH TAKE 3酶标仪(BioTek公司，美国)；激光共聚焦显微镜(Nikon公司，日本)；苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)(苏州永沁泉智能设备有限公司，中国)。
1.4 方法
1.4.1 脱细胞华通胶的制备参考团队既往研究的方法[19]，无菌条件下剥离脐带外表的羊膜，再剔除脐带内部2根脐动脉及1根脐静脉获取凝胶样的华通胶。将获得的华通胶中加入1 mol/L NaOH 溶液中，于37 ℃中搅拌脱细胞4 h，加入1 mol/L冰醋酸调节pH 值至7.0，得到脱细胞华通胶溶液备用。将得到的未脱细胞的华通胶与脱细胞华通胶分别进行苏木精-伊红染色和DAPI染色，验证脱细胞方法是否有效，再进行番红O、甲苯胺蓝、天狼猩红染色检测脱细胞前后华通胶的分成改变。
1.4.2 数字光处理3D打印水凝胶支架
生物墨水的制备：①将2 g透明质酸钠溶解于200 mL去离子水中，在4 ℃下搅拌过夜，缓慢加入 5 mL 甲基丙烯酸酐，加入0.5 mo/L NaOH溶液使溶液pH值保持在8.0-9.0之间；将混合溶液在4 ℃下磁力搅拌过夜，用乙醇(10体积当量)沉淀，然后用蒸馏水透析3 d(截留分子质量6-8 kD)。将透析完成后的样品放入冻干机-70 ℃冷冻干燥24 h，得到甲基丙烯酰化透明质酸海绵，置于-20 ℃储存备用。②将脱细胞人脐带华通胶加入平皿中，于-20 ℃预冻30 min后放入冷冻干燥机中-70 ℃冻干24 h，得到冷冻干燥后的脱细胞华通胶海绵，将其用研钵磨成粉末。取5 g脱细胞华通胶海绵粉末，将其溶解于100 mL平衡盐溶液中制作脱细胞华通胶溶液。③取10 g甲基丙烯酰化透明质酸海绵加入100 mL平衡盐溶液中，50 ℃下水浴至完全溶解，滤过除菌之后得到甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶前驱液。④将甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶前驱液与脱细胞华通胶溶液以体积比例1∶1混合，加入滤过除菌的光引发剂LAP(终质量浓度为0.25 g/L)，得到甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶生物墨水。
数字光处理 3D打印水凝胶支架：参考课题组先前对软骨组织工程支架的设计方案并加入对兔膝关节软骨组织学、力学综合分析后[20]，得到支架参数为直径3 mm、高度1.5 mm、支架上大孔直径500 μm、大孔与大孔之间的距离为 450 μm。通过CAD软件设计所需要的形状，再使用Magics设计支架内部结构，利用3D-Bioplotter 软件调用上述保存的数据文件转存形成打印使用的STL文件。采用数字光处理技术对支架进行3D打印，将甲基丙烯酰化透明质酸前驱液和甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶生物墨水分别加入3D打印机料杯中，设置光强度10 mW/cm²、曝光时间 10 s、基层数5基层曝光12 s，于室温下分别成功打印甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶支架(记为HAMA水凝胶支架)和甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架(记为HAMA/WJ水凝胶支架)，4 ℃密封冷藏备用。
1.4.3 水凝胶支架的理化性质评估
大体观和微观结构：取HAMA及HAMA/WJ水凝胶支架，观察并拍摄支架大体观，再将两种支架冻干后真空喷金处理，通过扫描电镜观察支架的微观结构并拍摄照片。
溶胀性能测试：将HAMA/WJ与HAMA水凝胶支架冷冻干燥后称质量(记为m0)，之后将两种冻干水凝胶支架置于平衡盐溶液中(温度保持在37 ℃)，在 1，2，4，6，10，24 h 分别取出水凝胶支架，用滤纸擦试水凝胶支架表面水分后再次记录质量(记为mt)，计算水凝胶支架的溶胀比：λ=(mt-m0)/m0。每组水凝胶支架进行3样本重复。
1.4.4 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞[21-22]。取SD大鼠乳鼠10只，麻醉后无菌条件下截取股骨与胫骨，剥除肌肉组织后置于含有双抗的PBS(pH=7.4)中，然后剪成1.0-2.0 mm3 碎块，移入25 cm2培养瓶中，加入含胎牛血清体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，隔日进行培养基更换。显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长至培养瓶80%左右时使用胰酶进行消化并传代，培养至P3代备用。
1.4.5 水凝胶支架的生物相容性采用甲基丙烯酰化透明质酸前驱液与甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶前驱液分别重悬P3代骨髓间充质干细胞，前驱液体积为10 mL，重悬后细胞浓度为2×109 L-1，然后采用数字光处理3D打印两组含细胞的水凝胶支架，方法同1.4.2。将两组含细胞的水凝胶支架放入24孔板内，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基培养，每隔2 d换液1次。
水凝胶支架中细胞增殖检测：培养1，4，7 d后分别取出含细胞的水凝胶支架，用PBS(pH=7.4)轻轻漂洗，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中加入体积分数10%CCK-8试剂孵育支架2 h，吸取上清液转入96孔板，在450 nm处测定吸光度值。每组重复检测3个样本，结果取平均值。
水凝胶支架中细胞活性检测：培养7 d后取出含细胞的水凝胶支架，对两组支架进行死活染色，用无菌PBS轻柔清洗支架3次，吸净PBS，使用TCS-SP8共聚焦显微镜观察支架中的细胞活性并拍照。
水凝胶支架中细胞伸展和形态观察：培养7 d后取出含细胞的水凝胶支架，用PBS(pH=7.4)清洗 2次，置于40 g/L多聚甲醛中固定10 min，用PBS清洗3遍，使用鬼笔环肽染色工作液避光染色0.5 h，用PBS洗涤3遍，加入DAPI染液避光染色0.5 h，用PBS清洗3遍，使用TCS-SP8共聚焦显微镜观察细胞骨架并拍照。

1.4.6 水凝胶支架体外成软骨分化基因表达检测按照1.4.5中的方法制备两组含细胞的水凝胶支架，加入成软骨诱导液培养14 d，采用 Trizol法提取总 RNA，使用反转录试剂Prime-Script TM RT Reagent Kit 将RNA 反转录为cDNA；使用 SYBR PreMix EXTAQ 进行 qRT-PCR反应，利用2-ΔΔCt方法检测细胞内聚集蛋白聚糖、SOX9、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原的mRNA表达，以 GAPDH 作为内参基因。实验中使用的引物序列见表1。

1.5 主要观察指标两组水凝胶支架的理化性质、生物相容性与体外对骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 9.3统计软件进行分析。所有结果均采用一式3份，所得数据均以x±s表示。统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过中国人民解放军总医院统计学专家审核。

讨论

过去几年中，软骨组织工程修复再生技术让众多软骨损伤患者和临床医生看到了新希望[14，21，23]。在软骨组织工程3大要素中排在第一位的就是支架，其在组织工程软骨修复再生治疗过程中起到了不可取代的作用[8，24-27]。支架的使用效果基本由支架材料及制造工艺决定，常用的支架原材料可分为合成材料、生物材料。常见的人工合成材料如氧化硅生物玻璃、羟基磷灰石、聚乳酸、聚羟基丁酸酯等，具有出色的机械强度、结构调节性等，但其生物相容性较差、细胞黏附效果弱，一直饱受研究者诟病。常见的天然生物材料有明胶、葡聚糖、壳聚糖等，其生物相容性十分出色且利于细胞黏附[28-31]，但促细胞成软骨分化作用较差[32-34]。
甲基丙烯酰化透明质酸由透明质酸经化学基团修饰制成，通过甲基基团修饰使得透明质酸拥有光固化特性，同时对透明质酸本身良好的生物相容性并没有明显影响[35-36]。透明质酸为关节软骨组成成分中含量较多的成分，其本身有利于软骨细胞及干细胞的生长。华通胶来源于人脐带，其成分组成与关节软骨极其相似，都有大量胶原蛋白及黏多糖等成分，同时华通胶富含各类生长因子如转化生长因子β、胰岛素生长因子等，对干细胞的成软骨分化具有促进作用[37]。
传统支架制备方法无法精确制造复杂的微观结构，而快速发展的3D打印技术使得制备复杂结构的支架得以实现。近来有研究显示，通过3D打印支架三维培养细胞能够正向影响细胞的生物学行为，促进细胞之间的交流与分泌[38]。临床工作中软骨损伤的范围因人而异，3D打印可以对患者进行个性化设计，从而达到精准治疗[39]。传统的熔融沉积打印技术存在对打印温度要求较高、打印墨水类型较少且生物活性较差等问题，低温沉积3D打印技术虽避免了高温对材料生物活性的破坏，但由于挤出式打印速度过慢的原因，仍难以避免打印时间过长造成的材料生物活性降低[40]。数字光处理3D打印技术在打印温度要求、打印精度和打印速度上都明显优于熔融沉积打印技术和低温沉积打印技术，是制造理想组织工程学支架的上佳选择[41]。此次实验先通过苏木精-伊红及DAPI染色验证了华通胶基本实现脱细胞，同时通过番红O、天狼猩红及甲苯胺蓝染色验证了华通胶中的蛋白聚糖、透明质酸、胶原等成分在脱细胞后得到了充分保留。在扫描电镜下观察到HAMA/WJ水凝胶支架在细微结构上与HAMA水凝胶支架相比更有利于细胞的黏附和迁移。实验进一步评估了两种水凝胶支架的生物相容性，CCK-8检测及死活染色实验结果提示两种支架均无毒且具有良好的生物相容性，并且HAMA/WJ水凝胶支架中的细胞更具增殖活性；细胞骨架染色结果显示HAMA/WJ水凝胶支架中的细胞黏附和伸展更好，这对保持干细胞形态和活性有很大的帮助。
qRT-PCR检测结果说明，HAMA/WJ水凝胶支架能够促进骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化，促进其合成和分泌软骨细胞外基质成分。既往研究中多数直接使用华通胶作用于软骨或将其灌注于预先制作完毕的支架网格中，也有研究使用低温沉积3D打印华通胶支架，但尚无使用数字光处理技术进行3D打印华通胶支架的研究。此次实验利用数字光处理技术使得支架的制备实现速度快、活性高的特点，相较既往研究中具有一定的优势。
综上所述，数字光处理3D打印HAMA/WJ水凝胶支架无毒且具有良好的生物相容性，3D结构有利于细胞伸展，华通胶材料所含的生物活性成分还具有一定促进骨髓间充质干细胞成软骨分化及胶原成分合成分泌的作用。因此，HAMA/WJ水凝胶支架作为一种新型的软骨组织工程支架有很好的临床应用潜力，但仍需进一步探究其体内对软骨损伤的修复效果，完善软骨再生修复的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞华通胶水凝胶支架的制备与表征

Preparation and characterization of methacryloylated hyaluronic acid/acellular Wharton’s jelly composite hydrogel scaffold

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