1.1 设计 材料制备与动物实验,采用单因素方差分析进行组间比较。
1.2 时间及地点 实验于2019年10月至2021年6月在中南大学湘雅医院骨科实验室及中南大学湘雅医学院动物实验学部完成。
1.3 材料
1.3.1 实验原材料 聚乳酸、聚乙烯醇、羟基磷灰石、壳聚糖、明胶、Ⅰ型胶原、京尼平(Sigma公司)。
1.3.2 实验设备 熔融沉积成型技术打印机(JOYE-2020M,湖南嘉一公司);万能力学试验机(DDL100型,长春机械科学研究院);磁力搅拌器(常州金坛宏华仪器厂);真空冷冻干燥机(北京博医康公司);环境电子扫描显微镜(FEI公司);倒置显微镜(Leica公司);病理切片机(金华益迪医疗设备公司);生物组织包埋机(常州中威电子仪器公司);Micro-CT(Skyscan公司)。
1.3.3 实验试剂 苏木精、伊红(湖南比克曼公司);石蜡、中性树胶(Sigma公司);二甲苯、无水乙醇(上海生工公司);Masson三色试剂盒(上海博谷公司)。
1.3.4 实验动物 2月龄SD大鼠40只,体质量250-300 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0011。5月龄新西兰兔15只,雌性,体质量2.5-3.0 kg,购自湖南太平生物科技有限公司,许可证号:SCXK(湘)2020-0005,在湘雅医学院实验动物学部屏障设施内分笼饲养。动物实验获得了中南大学湘雅医学院伦理委员会批准(批准号:2021sydw0009)。
1.4 实验方法
1.4.1 羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶的制备 首先,采用计算机辅助技术构建多孔结构的3D模型(6 mm×6 mm的圆柱体,孔隙率≥70%)。然后采用3D打印的熔融沉积技术,用聚乳酸制备多孔支架模具,按其孔径大小分为1.2,1.4,1.6,1.8 mm 4组(图1及图2a)。再采用机械共混-冻融法制备羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶[9],即将质量分数15%的聚乙烯醇及质量分数5%的羟基磷灰石粉末溶于双蒸水并在磁力搅拌器上水浴加热(90 ℃)后搅拌形成乳白色混合液,然后将其灌注入上述支架模具内进行5次冷冻-解冻循环(每次-20 ℃冷冻10 h,再于室温下解冻2 h),再用二氯甲烷溶解聚乳酸支架即可得到羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶(图2b、c)。最后,再将壳聚糖(20 g/L壳聚糖溶于10 g/L乙酸)和明胶(60 g/L明胶溶于超纯水)以2∶3的比例混合并加入体积分数10%的Ⅰ型胶原(5 mg/mL)及5 g/L的交联剂京尼平形成混合液,将其灌入羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶的孔隙中,经过交联(37 ℃恒温箱中12 h)、清洗(体积分数75%乙醇、双蒸水)、冷冻干燥即可制成羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶材料(图2d)。骨软骨修复实验前用60Co(25 kGy,24 h)辐射灭菌,并可强化交联以增加复合水凝胶的稳定性[18]。
因复合水凝胶在干燥后及应力状态下内部微孔结构容易断裂,故含水率、孔隙率及压缩应力检测均应用羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶进行测试。根据复合水凝胶材料的体外表征及力学检测结果,综合选取最优的一组用于股骨滑车骨软骨缺损修复实验。
1.4.2 羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶的含水率及孔隙率测试
含水率测定:采用电子精密天平称质量法,先将试样在38 ℃恒温箱中干燥48 h后称质量,记为m1;再将试样浸入双蒸水中24 h后称质量,记为m2,其含水率=(m2−m1)/m2×100%。每组取3个样品(3次/样),结果以x±s表示。
孔隙率测定:采用排水法,先将试样浸泡在含双蒸水(体积为V1)的量筒中,5 min后行短暂的抽空-加压循环,使水完全进入支架孔隙,此时量筒中的总体积为V2,然后取出试样测量残余水的体积为V3(图3),其孔隙率ε=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。每组取3个样品(3次/样),结果以x±s表示。
1.4.3 羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶的力学测试 应用DDL100型万能力学试验机进行压缩力学性能测试,将圆柱体试样(6 mm×6 mm)置于试验台上加压,应力-应变速率为 5 mm/min,检测指标为应力-应变曲线,每组检测3个样品(3次/样),结果以x±s表示,因水凝胶为黏弹性材料,难以压碎,故当压缩应变达到70%时停止压缩(图4)。
1.4.4 羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶的扫描电镜观察 采用扫描电镜观察复合水凝胶的孔隙结构,将材料纵向剖开后于干燥器内干燥,检测前喷金,然后在低真空模式(100 Pa)、加速高压(15 kV)及束斑条件下分组观察。每组检测3个样品(3张照片/样)。
1.4.5 羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶与胶原-壳聚糖-明胶材料植入大鼠皮下的比较 将40只SD大鼠采用随机数字表法分为羟基磷灰石-聚乙烯醇水凝胶组与胶原-壳聚糖-明胶复合材料组,每组20只。腹腔注射1%戊巴比妥钠
(40 mg/kg)麻醉大鼠,背部剃毛,然后用络合碘消毒、铺巾,于脊柱旁1.5 cm处制作长约1 cm的切口,全层切开皮肤皮下,将上述对应的材料植入大鼠背部浅深筋膜之间,消毒伤口,用3-0丝线缝合。术后3,7,14,28 d,每组随机处死5只大鼠,将材料及其周围包裹的皮肤及软组织一并切取,然后行苏木精-伊红及Masson三色染色观察材料周围的细胞黏附增殖情况。
苏木精-伊红染色:将组织经40 g/L多聚甲醛固定24 h
后行石蜡包埋切片,然后在 60 ℃下烤片 1.0-2.0 h;染色时先将切片脱蜡至水,即将切片置于二甲苯中10 min,2次,然后依次于体积分数100%,95%,85%和75%乙醇中脱水;再将切片依次置于苏木精及伊红中浸染,各5 min,每次染色后均用双蒸水冲洗;之后用梯度乙醇(体积分数95%-100%)贯序脱水,每级5 min;最后将切片置于二甲苯中透明(10 min),再添加中性树脂后封固观察。
Masson三色染色:切片的脱蜡至水同苏木精-伊红染色,然后用Masson试剂盒内的Weigert氏铁苏木精浸染
15 min,流水冲洗后用丽春红酸性品红液染色5-10 min,并用1%磷钼酸溶液分化3-5 min,再于苯胺蓝液中复染
5 min,并用1%的冰醋酸分化1 min,最后于梯度乙醇中脱水,用二甲苯透明,添加中性树脂后封固观察。
1.4.6 羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶的骨软骨修复实验 取新西兰兔15只,采用盐酸赛拉嗪肌肉注射麻醉(4 mg/kg),双膝剃毛后消毒铺单,取膝关节前方切口,沿股直肌-髌骨-髌腱内缘切开,向外脱位髌骨,暴露股骨滑车,用骨钻制做骨软骨缺损模型(直径5 mm、深6 mm),左侧植入人工软骨材料(实验组),右侧造模后未行处理作为对照组(图5)。术后4,8,12周,随机取5只兔,取双侧股骨髁,8周的标本行Micro-CT观察软骨下骨的修复情况,所有标本经脱钙后行组织学检测(苏木精-伊红及甲苯胺蓝染色)。
组织学检测:苏木精-伊红染色步骤同前文。甲苯胺蓝染色步骤为:将切片脱蜡至水,然后用双蒸水浸洗3次,再用0.1%的甲苯胺蓝液浸染10 min,流水冲洗多余染液后用1%的冰醋酸分化1 min,然后用梯度乙醇脱水,最后用二甲苯透明、中性树胶固定。
1.5 主要观察指标 羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶的物理性能、组织相容性及修复兔故软骨缺损的效果。
1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析进行组间比较,检验水准α=0.05,P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过新疆医科大学统计教研室生物统计学专家审核。