负载褪黑素的甲基丙烯酰明胶微球延缓髓核退变

doi:10.12307/2024.213

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (5): 676-681.doi: 10.12307/2024.213

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负载褪黑素的甲基丙烯酰明胶微球延缓髓核退变

李洋锋1，2，田鑫1，2，何帆1，2，杨惠林1，2

1苏州大学附属第一医院骨科，苏州大学苏州医学院，江苏省苏州市 215006；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2022-12-23 接受日期:2023-02-14 出版日期:2024-02-18 发布日期:2023-08-16
通讯作者: 杨惠林，主任医师，博士生导师，教授，苏州大学附属第一医院骨科，苏州大学苏州医学院，江苏省苏州市 215006；苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006
作者简介:李洋锋，男，1997年生，江苏省南通市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事椎间盘退变方面的研究。
基金资助:
卫生厅“科教兴卫”项目-江苏省骨科临床医学中心，项目负责人：杨惠林

Melatonin-loaded gelatin methacryloyl microspheres delay nucleus pulposus degeneration

Li Yangfeng1, 2, Tian Xin1, 2, He Fan1, 2, Yang Huilin1, 2

1Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Medical College of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2022-12-23 Accepted:2023-02-14 Online:2024-02-18 Published:2023-08-16
Contact: Yang Huilin, Chief physician, Doctoral supervisor, Professor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Medical College of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Li Yangfeng, Master candidate, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Medical College of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
“Science, Education and Health” Project of Department of Health - Institute of Orthopedics at Soochow University (to YHL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

褪黑素：为松果体分泌的一种内源性激素，主要控制昼夜节律，也是一种强大的抗氧化剂和自由基清除剂，对维持细胞和基质的内环境稳态至关重要。
甲基丙烯酰明胶微球：将明胶改性后采用微流控等技术制成的微粒状水凝胶，具有良好的生物相容性和降解性，作为各种细胞或生物分子的支架广泛应用于生物组织工程。

背景：髓核退变是椎间盘退变的重要病理环节，褪黑素可通过抗炎抗氧化等途径对细胞产生保护作用，然而褪黑素对髓核作用的研究较少，目前各种生物支架的出现为药物与材料结合的研究提供了新思路。

目的：探究褪黑素是否可以通过减轻氧化应激损伤来改善髓核的代谢状态，以及负载褪黑素的甲基丙烯酰明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)微球在体内对椎间盘退变的影响。
方法：在体外，将褪黑素与成胶前的GelMA微球溶液结合，通过微流控技术将GelMA水凝胶制成微球，与髓核细胞共培养，利用CCK-8法检测细胞增殖活力，扫描电镜下观察微球的表面形态，用紫外分光光度计检测药物释放的速率，随后用白细胞介素1β诱导髓核退变，给予治疗后采用qRT-PCR 检测基质合成基因聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白α1及基质降解基因基质金属蛋白酶13、ADAMTS5的表达水平。在大鼠体内采用针刺方法诱导髓核退变，随后分别注入GelMA和GelMA@MT微球，6周后取标本进行组织染色，显微镜下观察组织形态的变化，对其进行组织学分析及评分。

结果与结论：①电子扫描显微镜下观察制得的GelMA和GelMA@MT微球，褪黑素的结合并没有改变微球的形态与外貌；药物释放实验显示40 d后药物释放达到80%左右；②CCK-8结果显示，GelMA与GelMA@MT微球均无明显细胞毒性，且对髓核细胞增殖起促进作用；③qRT-PCR结果揭示，GelMA@MT微球可使白细胞介素1β环境下聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白α1的表达分别提高42.1%和27.1%，使基质金属蛋白酶13和ADAMTS5的表达分别降低70.7%和109.3%；④白细胞介素1β+GelMA@MT组活性氧水平显著低于白细胞介素1β组和白细胞介素1β+GelMA组；⑤切片组织学染色可见，负载了褪黑素的GelMA微球在体内可显著延缓椎间盘退变；⑥提示将褪黑素与GelMA水凝胶结合制成的GelMA@MT微球在体外显示出良好的细胞相容性，在体内外显著延缓髓核退变。

https://orcid.org/0000-0002-9373-8201(李洋锋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 褪黑素, 髓核, 椎间盘, 微球, GelMA

Abstract: BACKGROUND: Nucleus pulposus degeneration is an important pathological link of intervertebral disc degeneration. Melatonin has a protective effect on cells through anti-inflammatory and antioxidant pathways, but the effect of melatonin on the nucleus pulposus has been less studied. At present, the emergence of various biological scaffolders provides a new idea for the study of drug-material combinations.
OBJECTIVE: To explore whether melatonin can improve the metabolic state of the nucleus pulposus by reducing oxidative stress damage as well as the effect of gelatin methacryloyl (GelMA) microspheres loaded with melatonin on intervertebral disc degeneration in vivo.
METHODS: In vitro, melatonin was combined with GelMA solution, and GelMA hydrogel was prepared into microspheres by microfluidic technology to co-culture with nucleus pulposus cells. The cell proliferation activity was detected by cell counting kit-8 assay, the surface morphology of the microspheres was observed under scanning electron microscopy, and the rate of drug release was detected by ultraviolet spectrophotometer. Then, interleukin-1β was used to induce degeneration of the nucleus pulposus. After treatment, the expression levels of aggrecan, type II collagen α1, matrix metalloproteinase 13 and a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5 (ADAMTS5) in the nucleus pulposus were detected by qRT-PCR. In vivo, nucleus pulposus degeneration was induced by puncture. Subsequently, GelMA and GelMA@MT microspheres were injected. After 6 weeks, the specimens were taken for tissue staining, and the changes in tissue morphology were observed under the microscope for histological analysis and scoring.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) When the GelMA and GelMA@MT microspheres were observed under electron scanning microscope, melatonin binding did not change the morphology and external appearance of the microspheres. Drug release experiments showed that the drug release reached about 80% after 40 days. (2) Cell counting kit-8 assay results showed that both GelMA and GelMA@MT microspheres had no obvious cytotoxicity and promoted the proliferation of nucleus pulposus cells. (3) qRT-PCR results revealed that GelMA@MT microspheres increased the expression of aggrecan and type I collagen α1 in the interleukin 1β environment by 42.1% and 27.1%, respectively, and decreased the expression of matrix metalloproteinase 13 and ADAMTS5 by 70.7% and 109.3%, respectively. (4) The level of reactive oxygen species was significantly lower in the interleukin 1β+GelMA@MT group than in the interleukin 1β and interleukin 1β+GelMA groups. (5) Histological staining of the sections showed that melatonin-loaded GelMA microspheres significantly delayed disc degeneration in vivo. (6) These findings indicate that GelMA@MT microspheres made by combining melatonin with GelMA hydrogel have good cytocompatibility in vitro and significantly delay nucleus pulposus degeneration in vitro and in vivo.

Key words: melatonin, nucleus pulposus, intervertebral disc, microsphere, GelMA

中图分类号:

李洋锋, 田鑫, 何帆, 杨惠林. 负载褪黑素的甲基丙烯酰明胶微球延缓髓核退变[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 676-681.

Li Yangfeng, Tian Xin, He Fan, Yang Huilin. Melatonin-loaded gelatin methacryloyl microspheres delay nucleus pulposus degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(5): 676-681.

图/表（结果） 4

2.1 GelMA和GelMA@MT微球的体外特征为研究GelMA和GelMA@MT微球的生物相容性，分别和髓核细胞共培养，在培养后的第1，3，5天试用CCK-8法检测细胞增殖情况，结果显示这两种微球无明显细胞毒性，且对细胞增殖有明显促进作用，结果见图1A；电子扫描显微镜下观察制得的两种微球，褪黑素的结合并没有改变微球的形态与外貌，见图1B；为测试褪黑素在GelMA@MT微球中的释放情况，每隔一段时间检测释放出的药物浓度，40 d后药物释放达到80%，见图1C。

2.2 GelMA@MT微球可明显改善白细胞介素1β诱导的髓核变性探究GelMA@MT微球对髓核细胞外基质的影响，结果见图2。白细胞介素1β使聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白α1基因表达分别降低了52.3%和38.4%，使基质金属蛋白酶13和ADAMTS5基因表达分别升高了120.3%和83.3%，与GelMA微球共培养后，基质代谢的基因表达并未恢复，而GelMA@MT微球可使白细胞介素1β环境下聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白α1的表达分别提高42.1%和27.1%，使基质金属蛋白酶13和ADAMTS5的表达分别降低70.7%和109.3%。

2.3 GelMA@MT微球可有效清除髓核细胞内的活性氧使用活性氧荧光探针检测不同实验组的细胞内活性氧水平，结果显示，相比对照组，白细胞介素1β组和白细胞介素1β+GelMA组的荧光强度明显增强，活性氧水平升高；而白细胞介素1β+GelMA@MT组的荧光强度与白细胞介素1β组和白细胞介素1β+GelMA组相比均明显降低，活性氧水平降低，表明GelMA@MT可显著清除白细胞介素1β诱导的髓核细胞内活性氧积累，见图3。

2.4 负载褪黑素的GelMA微球可在体内显著改善髓核退变染色结果见图4A，与对照组相比，退变组与GelMA组髓核组织大量丢失，髓核与纤维环界限不清，椎间盘高度下降，而GelMA@MT组髓核细胞和基质仍有较多保留，椎间盘高度无明显下降。图4B示各组的椎间盘组织学评分，评分越高代表退变越严重，可见退变组与GelMA组评分较高，显示椎间盘严重退变；而GelMA@MT组尽管显著高于对照组，但是同时也显著低于退变组和GelMA组，表明GelMA@MT组对髓核退变有治疗效果。

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引言

下腰痛是重大的全球健康问题之一，由此造成的劳动力损失给社会带来了巨大的经济负担[1-2]，而腰椎间盘退变则是导致腰痛的主要原因[3]。针对腰椎间盘突出，目前的治疗主要以缓解症状为主，尚无有效延缓疾病进展的方案，随着对椎间盘研究的进一步深入，认识到椎间盘退变与其内部结构的改变有关，髓核是位于椎间盘中央的高度水化的胶状组织，对于抵抗脊柱的压力负荷至关重要[4]。髓核的功能主要取决于细胞外基质的完整性，在衰老、炎症、损伤、氧化应激等刺激下，髓核合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白多糖等基质的能力下降[5]，降解酶如基质金属蛋白酶13和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5，ADAMTS5)的生成反而增多，髓核因此逐渐脱水、纤维化而丧失功能[6-7]。
由此可见，寻找一种有效的干预或者药物改善髓核的代谢内环境才是治疗的关键。褪黑素是哺乳动物松果体分泌的一种内源性激素，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、维持线粒体稳态等多种作用[8-9]，对阿尔茨海默病、骨关节炎等多种退行性疾病具有延缓作用[10-11]。LI等[12]发现了人髓核中褪黑素膜受体的存在并证明了褪黑素可通过该受体抑制髓核细胞外基质的降解；CHEN等[13]通过对大鼠进行腹腔内注射褪黑素在一定程度上延缓了椎间盘退变。然而，目前关于褪黑素对髓核保护作用的证据仍较少，更近一步的研究十分有必要。
鉴于髓核本身的无血管特性以及退变状态下营养障碍进一步加重的情况，原位给药方能达到理想的治疗效果，然而，药物若直接注入椎间盘内不仅容易随着活动由伤口处丢失，且很难持续发挥作用，因此需要借助一种合适的载体来负载和控释药物。甲基丙烯酰明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)是由天然化合物明胶改造而来，具备良好的生物相容性[14-15]，常常直接或被制作成微球状后作为药物或者细胞在体内的递送工具[16-17]。XU等[18]通过制备一种包载生长因子和脂肪来源干细胞的GelMA微球成功延缓了椎间盘退变。CHEN等[19]将壳聚糖微球包裹的青藤碱与GelMA水凝胶结合有效改善了骨关节炎进展。
此次研究旨在通过构建一种负载褪黑素的GelMA(GelMA@MT)微球，实现褪黑素在体内的有效释放，缓解髓核内高压、低氧、低pH的退变微环境[20]，为髓核退变的治疗提供一种新思路，证明该材料的安全性、有效性，为后续研究载细胞治疗、类器官的构建等治疗方式提供依据。此外，体外实验旨在进一步证明褪黑素对髓核细胞的保护作用，为褪黑素在椎间盘退变方面的研究提供新的依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计动物模型建立和细胞学体外观察，统计差异分析采用单因素方差分析比较。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年9月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6周龄雌性SD大鼠30只，体质量(198.8±8.4) g，购自苏州大学动物中心，动物质量合格证号：SYXK(苏)2017-0043，大鼠饲养于特定的无病原体环境中，22-24 ℃恒温，湿度50%-60%，12 h光照/12 h黑暗交替循环，自由获取所需饮食。所有动物手术和实验程序均在苏州大学伦理委员会的批准下进行(伦理编号：SUDA20221229A03)，同时严格遵守实验室动物护理和使用的指导方针。
1.3.2 实验试剂和仪器胰酶、胎牛血清、PBS、F12培养基(Hyclone，美国)；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、实时PCR系统(Bio-Rad，美国)；酶标仪(Bio-Tek，美国)；正置显微镜、倒置荧光显微镜(Zeiss Axiovert，德国)；精确微量注射泵-LSP01-1A (保定市兰格恒流泵有限公司，中国)；扫描电子显微镜(HitachiS-4800，日本)；磁力搅拌器(司乐仪器有限公司，中国)；离子溅射仪(北京中科科仪，中国)；CO2细胞培养箱、生物超净台(Thermo，美国)；高速离心机 (Eppendorf，德国)；4 ℃冰箱 (无锡松下冷机有限公司，中国)；-80 ℃电冰箱 (青岛海尔股份有限公司，中国)；培养皿、培养孔板(Corning，美国)；活性氧荧光探针、CCK-8试剂盒(碧云天，中国)；切片机(Leica Biosystems，美国)；褪黑素、Ⅱ型胶原酶、TRIzol、苏木精-伊红、藏红花素O(S.O)/快绿(Sigma，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 GelMA及GelMA@MT微球的制备取30 g明胶，加入到200 mL提前加热至60 ℃的PBS中，采用磁力搅拌器使明胶溶解，待明胶溶解后再加入20 mL甲基丙烯酸酐，持续作用2 h，然后用800 mL PBS(40 ℃)将此体系稀释5倍以终止反应。使用12-14 kD的透析袋对其进行持续透析以清除未反应的甲基丙烯酸酐和盐等杂质，透析2周，期间每天更换2次双蒸水，之后再将透析后的溶液冻干1周，得到冻干的GelMA，暂时储存在-80 ℃冰箱中，之后将10%的GelMA溶液与含10%司班80的肉豆蔻酸异丙酯分别作为水相和油相在微量流体注射泵的作用下以20倍的速度差注入微流控芯片，由于油相速度远远高于水相且两相不相溶，水相液体被切割成连续的液滴，在出口处将其与油相溶液一起收集在烧杯中，在紫外光照射下使其光交联成GelMA微球。为制备GelMA@MT微球，将褪黑素溶于无水乙醇中，以1∶10的质量比溶于GelMA溶液中，混合作为水相，油相配比与上述相同，按照上述流程制成GelMA@MT水凝胶微球。将其用体积分数75%的乙醇和纯化水清洗后冷冻干燥以备后续实验使用。
1.4.2 微球表面形态观察先将GelMA及GelMA@MT微球冷冻干燥，再用离子溅射仪对其进行表面喷金，然后使用扫描电子显微镜在15 kV电压下观察并拍照。
1.4.3 药物释放浓度的测定取 GelMA@MT水凝胶微球200 μL注入6孔板内，之后加入1 mL去离子水，放于4 ℃冰箱内保存，选取特定时间收集上清并更换新的去离子水。使用Nanodrop 2000光谱仪(Thermo Fisher Scientific)测定280 nm下的波长。

1.4.4 髓核细胞体外培养对SD大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠实施安乐死。然后在无菌条件下暴露椎间盘，小心取出中央的胶状髓核，暂时置于含5%双抗的无血清培养基中，弃培养基，PBS清洗3遍后用0.4%Ⅱ型胶原酶在37 ℃下消化2 h，离心后将细胞接种在标准培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的F12培养基)中，放置在CO2培养箱(37 ℃，体积分数5%CO2)中培养。原代细胞培养4 d后开始换液，之后每3 d更换一次培养基，当原代细胞生长到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶2比例进行传代。第2代髓核细胞用于后续细胞实验。

1.4.5 细胞增殖实验将髓核细胞以每孔2×104的细胞数量接种于96孔板中，然后将GelMA及GelMA@MT微球注入孔板中与细胞共培养。在处理后的第1，3，5天，将细胞在37 ℃下与10%CCK-8溶液中共孵育1 h，使用酶标仪在450 nm处测量细胞培养物的吸光度(A值)。

1.4.6 qRT-PCR 体外实验共分为4组，分别为对照组、白细胞介素1β组、白细胞介素1β+GelMA组和白细胞介素1β+GelMA@MT组。为探究GelMA@MT微球对髓核细胞外基质的影响，将髓核细胞以每孔1.5×105的数量接种于6孔板中，先采用10 nmol/L的白细胞介素1β与其共培养24 h诱导髓核变性，之后再分别植入200 μL GelMA和200 μL GelMA@MT微球，培养2 d，期间每天更换一次培养基，检测基质合成基因聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白α1及基质降解基因基质金属蛋白酶13和ADAMTS5的表达水平。使用Trizol试剂提取髓核细胞的总RNA，根据反转录试剂盒的说明合成cDNA，之后利用iTaq Universal SYBR Green Supermix 试剂盒进行基因扩增，相关引物见表1。

1.4.7 细胞内活性氧的检测将第2代髓核细胞接种在24孔板中(每孔2×104)，与不同浓度的褪黑素或者白细胞介素1β共培养(具体分组同1.4.6)，每孔加入10 μmol/L的活性氧荧光探针试剂200 μL，在37 ℃黑暗环境下培养30 min，用荧光显微镜观察活性氧的荧光强度。
1.4.8 动物模型建立采用完全随机分组的方法，将20只体质量接近的6周龄雌性SD大鼠随机分成4组，即对照组、退变组、GelMA组、GelMA@MT组，每组5只。通过触诊和X射线拍摄定位C8/9椎间盘，腹腔内注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，碘伏消毒手术区域后，用21G针垂直于尾巴穿刺C8/9 椎间盘，旋转360°，保持30 s，穿刺深度在6 mm左右。对照组不进行手术及其他干预，其余3组均按上述方法穿刺，穿刺后利用微注射器向椎间盘内递送不同药液，退变组给予PBS注射液5 µL，GelMA组注射GelMA微球5 µL，GelMA@MT组注射GelMA@MT微球5 µL。
1.4.9 组织学染色造模6周后大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠实施安乐死，取手术节段的尾椎，在体积分数4%甲醛中固定48 h，10% EDTA中脱钙30 d，脱水，石蜡包埋，使用徕卡切片机以6 μm厚度对石蜡标本进行切片，采用苏木精-伊红、藏红花素O/快绿染色。使用明亮视野显微镜捕获组织图像。
1.5 主要观察指标 ①GelMA和GelMA@MT微球的体外特性；②褪黑素对髓核基质合成代谢的影响；③负载褪黑素的GelMA水凝胶微球对大鼠椎间盘组织学评分的影响，组织学分级基于4类退行性改变(纤维环、纤维环与髓核的分界、髓核细胞、髓核基质)，每类共3分，评分越高代表退变越严重。
1.6 统计学分析为进行统计学分析，所有实验至少进行3次重复，数据以均数±标准误差(S.E.M)表示。两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05则认为组间差异有显著性意义。所有统计分析均采用SPSS 26.0软件进行。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

在健康的髓核中，由于生长因子和细胞因子的复杂调节，细胞外基质的合成和分解速率处于平衡状态。当它的分解代谢超过合成代谢时，髓核退变通常发生[1，5，20]。基质金属蛋白酶和ADAMTs是裂解细胞外基质成分的主要酶，大量证据表明，许多基质金属蛋白酶和ADAMTs成员在退行性椎间盘组织和细胞中高表达，这些酶深度参与了细胞外基质分解和椎间盘退变的进展[20-21]。椎间盘变性的标志之一是蛋白多糖的逐渐丢失，这与氧张力降低、自由基积累、pH值降低以及基质降解酶活性的增加相一致。由于蛋白多糖的丢失，髓核无法维持正常的生理静水压力，从而导致椎间盘脱水。椎间盘的脱水会阻止营养物质和生长因子进入椎间盘细胞，从而进一步损害椎间盘功能[22-23]。髓核变性过程中会产生大量的促炎因子和趋化因子，白细胞介素1β被认为是最重要的细胞因子，它通过刺激多种促炎递质以及活性氧的产生引起细胞损伤和基质降解。研究发现，退变髓核组织中白细胞介素1β表达显著增多，且与髓核退变的程度呈正相关[24]，抑制白细胞介素1β已被证明可以促进细胞外基质修复及阻断椎间盘退变[6]。在此次体外研究中，采用白细胞介素1β诱导髓核退变，研究结果与之前的研究一致，在与白细胞介素1β共培养后，裂解酶基质金属蛋白酶13和ADAMTS5的基因表达明显增高，同时合成细胞外基质的Ⅱ型胶原蛋白α1和多聚蛋白多糖的表达量显著减少，并且细胞内的活性氧水平显著增高，活性氧是细胞代谢的产物，充当细胞信号的同时作为亲电试剂对细胞内脂质、核酸、蛋白质等生物分子具有攻击作用，活性氧的过量产生是体内抗氧化防御功能下降的结果，随着对椎间盘退变深入研究，活性氧被认为是椎间盘退变发病机制中的关键信号分子[25]，及时有效地清除体内过多产生的活性氧有助于缓解髓核退变。
褪黑素是一种强大的抗氧化剂和细胞保护剂。HE等[26]在一项体外研究中发现，褪黑素可以增强抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性来加快活性氧的清除抵抗髓核凋亡。此次研究结果同样也发现了褪黑素的活性氧清除作用，尽管近期有一些研究证明了褪黑素对髓核的保护作用，但是研究的证据仍很局限。此次研究中发现，在分别与白细胞介素1β诱导下的髓核细胞共培养后，GelMA微球不能改变炎症环境下髓核细胞外基质丢失和细胞内活性氧的积累，GelMA@MT微球却显著改善了髓核退变，Ⅱ型胶原和蛋白多糖得以保留，甚至连基质金属蛋白酶13和ADAMTS5等降解酶的产生也被显著抑制，此外，活性氧水平在与
GelMA@MT共培养后也显著降低。这证明GelMA本身并不具备抗炎活性，它虽然可以在一定程度上促进髓核细胞的增殖，然而却不能改变细胞的代谢表型，增殖的分解代谢型髓核细胞甚至可能会产生更多的降解酶加速基质重塑，GelMA@MT的功能借助褪黑素得以实现。褪黑素在GelMA@MT促进髓核细胞基质合成、抑制基质降解和清除活性氧方面起到了核心的生物活性作用。
为在体内环境中也能实现褪黑素强大的生物活性，作者采用了GelMA水凝胶微球作为褪黑素的载体，GelMA是一种功能化修饰后的明胶，具有光交联特性和良好的生物相容性，可模拟细胞外基质，携带细胞或一些生物活性分子产生器官和组织修复功能[15，27-28]，微流控技术可以将水凝胶制作成合适尺寸、大小均一的微球状，极大地拓宽了水凝胶的应用[14，29-30]。JIANG等[31]将富血小板血浆与GelMA水凝胶结合促进了兔关节软骨的再生；XIAO等[32]通过褪黑素在GelMA脂质体中的持续释放改善了骨质疏松骨修复。受先前研究的启发，在此次实验中，为实现褪黑素的体内治疗制备了一种GelMA@MT微球，通过微创注射的方法将其递送到目标椎间盘内，观察组织学形态的变化，研究结果显示，对比退变组，GelMA@MT组椎间盘高度下降、髓核组织丢失、纤维环撕裂、终板钙化等情况都显著好转，而GelMA组与退变组比较无统计学差异。体内研究的数据表明，GelMA本身并不能延缓髓核退变，褪黑素对髓核具有强大的保护作用，当然这离不开GelMA微球的高载药特性和良好的生物相容性，两者相辅相成，在体内有效改善了椎间盘退变。
结论：髓核变性是椎间盘退变的重要特征，此次研究证实，褪黑素在体外通过减少活性氧积累降低炎症环境下髓核细胞的损害，对髓核细胞外基质代谢平衡具有保护作用。此外，负载褪黑素的GelMA微球显著改善了椎间盘退变，这为组织工程在髓核研究中的应用提供了新的思路和方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

负载褪黑素的甲基丙烯酰明胶微球延缓髓核退变

Melatonin-loaded gelatin methacryloyl microspheres delay nucleus pulposus degeneration

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