补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响

doi:10.12307/2024.304

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2542-2549.doi: 10.12307/2024.304

• 肌肉肌腱韧带组织构建 tissue construction of the muscle, tendon and ligament • 上一篇下一篇

补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响

赵莎莎1，贺庆2，李佳2，吴迎1

1北京体育大学运动人体科学学院，北京市 100084；2艾兰得健康控股有限公司，上海市 200120

收稿日期:2023-03-08 接受日期:2023-04-20 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-29
通讯作者: 吴迎，硕士生导师，副教授，北京体育大学运动人体科学学院，北京市 100084
作者简介:赵莎莎，女，1998年生，河南省新乡市人，汉族，北京体育大学在读硕士，主要从事运动与营养相关研究。
基金资助:
中央高校基本科研业务专项资金资助项目(2020054)，项目负责人：吴迎；横向联合项目(20210056)，项目负责人：吴迎

Effects of recombinant human collagen supplementation on extracellular matrix remodeling in mouse skeletal muscle after eccentric exercise

Zhao Shasha1, He Qing2, Li Jia2, Wu Ying1

1College of Sports Science, Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 2Aland Health Holding Ltd., Shanghai 200120, China

Received:2023-03-08 Accepted:2023-04-20 Online:2024-06-08 Published:2023-07-29
Contact: Wu Ying, Chief physician, Master’s supervisor, Associate professor, College of Sports Science, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
About author:Zhao Shasha, Master candidate, College of Sports Science, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
Supported by:
the Fundamental Research Fund for the Central Universities, No. 2020054 (to WY); Horizontal Joint Project, No. 20210056 (to WY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

胶原蛋白：为三螺旋结构，是含量最为丰富的胞外基质成分，属于不完全蛋白质。目前市售胶原蛋白主要为动物来源，存在提取工艺复杂、活性表达较低及存在污染风险等问题，而利用生物工程技术生产的重组人源胶原蛋白具有分子质量确定、可加工性强、水溶性强、排异反应低、无病毒隐患等优势。
细胞外基质：由细胞合成并分泌到胞外的物质，是一种普遍存在于组织器官中的非细胞成分。骨骼肌细胞外基质所构成的膜性网状结构具有支持、连接、营养、保护和修复肌组织的作用，对肌纤维、肌束和肌肉整体活动也起着重要的调节作用。

背景：胶原蛋白是含量最为丰富的胞外基质成分，与骨骼肌细胞外基质的结构、功能密切相关，但补充由生物工程技术生产的重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen，rhC)对骨骼肌细胞外基质的影响及机制尚不清楚。

目的：探讨补充rhC对离心运动后骨骼肌细胞外基质重塑的影响及作用机制。
方法：将104只8周龄健康雄性C57小鼠随机分为对照组(生理盐水)、rhC低剂量组(0.2 g/kg)、中剂量组(1.0 g/kg)和高剂量组(2.0 g/kg)，连续7 d灌胃干预后每组选取2只小鼠，解剖各脏器进行苏木精-伊红染色判断炎性浸润情况，其余小鼠于第8天进行离心运动，分别在离心运动后即刻(0)，24，48，96 h观察细胞外基质结构变化，检测小鼠抓握力、血清肌酸激酶活性、骨骼肌组织基质金属蛋白酶2，9，14和基质金属蛋白酶抑制剂2的蛋白水平。

结果与结论：①苏木精-伊红染色观察短期补充rhC对心脏、肝脏、脾、肾无显著影响；②一次性离心运动后，rhC中、高剂量组小鼠抓握力恢复率显著升高(P < 0.01)；③各组肌酸激酶变化趋势一致，组间无显著性差异；④rhC低剂量组细胞外基质恢复进程快于对照组，rhC中、高剂量组肌束膜较为完整；⑤rhC高剂量组基质金属蛋白酶9蛋白水平显著降低(P < 0.05)；⑥rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶14蛋白水平显著降低(P < 0.05)；⑦rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶2蛋白水平显著降低(P < 0.05)；⑧rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白水平显著升高(P < 0.05)；⑨rhC各剂量组基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶抑制剂2比值显著降低(P < 0.05)。该研究发现连续7 d预补充1.0，2.0 g/kg rhC可通过调节基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂来抑制运动后骨骼肌细胞外基质降解，从而促进小鼠骨骼肌力量恢复。

https://orcid.org/0000-0002-0276-2311(赵莎莎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 重组人源胶原蛋白, 离心运动, 骨骼肌细胞外基质, 基质金属蛋白酶, 基质金属蛋白酶抑制剂

Abstract: BACKGROUND: Collagen is the most abundant extracellular matrix component, which is closely related to the structure and function of the extracellular matrix of skeletal muscle, but the effect and mechanism of recombinant human collagen (rhC) produced by bioengineering technology on the extracellular matrix of skeletal muscle are unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of rhC supplementation on the remodeling of skeletal muscle extracellular matrix after eccentric exercise, thereby revealing the possible mechanism by which rhC improves the injury of skeletal muscle extracellular matrix and promote the recovery after exercise.
METHODS: A total of 104 healthy male C57 mice aged 8 weeks old were randomly divided into control group (normal saline), low-dose rhC group (0.2 g/kg), medium-dose rhC group (1.0 g/kg), and high-dose rhC group (2.0 g/kg). Two mice in each group were selected after continuous 7 days of intragastric intervention, and organs were dissected for hematoxylin-eosin staining to determine inflammatory infiltrates. On the 8th day, the remaining mice were subjected to eccentric exercise. The structural changes of the skeletal muscle extracellular matrix were observed under scanning electron microscopy immediately (0), 24, 48, and 96 hours after eccentric exercise. Meanwhile, grip strength, creatine kinase activity, and protein levels of matrix metalloproteinases 2, 9, 14 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in skeletal muscle were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results indicated that short-term rhC supplementation showed no significant effects on the morphology of the heart, liver, spleen and kidney. After one-time eccentric exercise, the recovery rate of grip strength in the medium- and high-dose rhC groups was significantly increased (P < 0.01). The trend of creatine kinase changes was consistent in all groups and there was no significant difference between groups. The recovery process of the extracellular matrix in the low-dose rhC group was faster than that in the control group, and the muscle tract membrane in the medium- and high-dose rhC groups was more complete. The protein level of matrix metalloproteinase 9 in the high-dose rhC group was significantly decreased (P < 0.05). The protein levels of matrix metalloproteinase 14 in the medium- and high-dose rhC groups were significantly decreased (P < 0.05). The protein levels of matrix metalloproteinase 2 in the medium- and high-dose rhC groups were significantly decreased (P < 0.05). Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 protein levels in the medium- and high-dose rhC groups were significantly increased (P < 0.05). The ratio of matrix metalloproteinase 2 to tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in each rhC group was significantly decreased (P < 0.05). To conclude, pre-supplementation of 1.0 and 2.0 g/kg rhC for 7 days can inhibit extracellular matrix degradation in skeletal muscle after exercise by modulating matrix metalloproteinases and matrix metalloproteinase inhibitors, thereby promoting recovery of skeletal muscle strength in mice.

Key words: recombinant human collagen, eccentric exercise, skeletal muscle extracellular matrix, matrix metalloproteinase, tissue inhibitor of metalloproteinases

中图分类号:

赵莎莎, 贺庆, 李佳, 吴迎. 补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2542-2549.

Zhao Shasha, He Qing, Li Jia, Wu Ying. Effects of recombinant human collagen supplementation on extracellular matrix remodeling in mouse skeletal muscle after eccentric exercise[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2542-2549.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验选用雄性C57小鼠104只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 短期补充重组胶原蛋白对各组织形态的影响持续灌胃7 d后将小鼠解剖，取出各脏器，大体观察脏器外观是否有形态和颜色上的变化，并进行病理切片(苏木精-伊红染色)观察是否有明显病变。如图2所示：rhC低、中、高剂量组小鼠各脏器与对照组相比未见明显差异。各组均无炎性浸润；心肌结构正常，横纹清晰；肝脏结构完整，肝小叶肝窦清晰；脾小体结构清晰，脾脏结构正常；肾小球囊腔清晰可见，肾小球、肾小管均未见异常。

2.3 离心运动后各组小鼠抓握力恢复率如图3所示，抓握力恢复率分别受时间和浓度影响，各组小鼠抓握力恢复率于0，24，48 h逐渐升高，96 h恢复至基线水平；在运动后即刻，24，48 h时，rhC中、高剂量组抓握力恢复率显著高于对照组、rhC低剂量组(P < 0.01)；在运动后96 h时，各组之间相比均无显著性差异(P > 0.05)。

2.4 离心运动后各组小鼠血清肌酸激酶活性如表2所示，肌酸激酶活性仅受时间影响，各浓度rhC组肌酸激酶活性在运动后即刻较高，运动后24 h和48 h有所回落，96 h至最低水平；各时间点不同浓度rhC组之间并无显著性差异(P > 0.05)。正常情况下，机体血清中肌酸激酶活性较低，但大强度或长时间运动诱导骨骼肌细胞膜损伤，肌细胞膜通透性增加，骨骼肌释放到血液中的肌酸激酶增加，因此，血清肌酸激酶水平与骨骼肌质膜损伤程度密切相关[21]。

2.5 离心运动后各组小鼠IMCT网状结构通过扫描电镜在低倍视野下(×200)观察骨骼肌细胞外基质成分胶原纤维的形态。如图4所示，运动后即刻，24 h，对照组肌内膜和肌束膜的结构完整性被严重破坏，其厚度变小、胶原纤维丝纹理凌乱；运动后48 h，肌束膜呈现轻度缺失；运动后96 h，结缔组织结构较为完整。运动后即刻，rhC低剂量组肌内膜和肌束膜的结构破坏程度较深；运动后24，48 h，肌内膜结构尚为完整，肌束膜排列稀疏并呈现轻度缺失；运动后96 h，肌内膜和肌束膜结构则相对完整。运动后不同时间点rhC中、高剂量组肌内膜和肌束膜结构完整，胶原纤维排列整齐，且出现粗大胶原纤维索。rhC低剂量组恢复速度快于对照组，且rhC中、高剂量组肌束膜完整性明显高于对照组、rhC低剂量组。

2.6 离心运动后各组MMPs/TIMPs蛋白表达通过Western blot检测MMPs及其抑制剂TIMPs的蛋白表达以探索短期补充rhC对维持受损骨骼肌IMCT网状结构完整性的可能性机制。
2.6.1 MMP-9，14蛋白表达
(1) 如图5所示，MMP-9蛋白表达仅受浓度影响，从时程上分析，各组蛋白表达于不同时间点并无显著差异；按不同浓度分析，运动后即刻rhC高剂量组显著低于对照组、rhC低、中剂量组(P < 0.05)，运动后24 h rhC高剂量组显著低于rhC低剂量组(P < 0.05)，运动后48 h rhC高剂量组显著低于对照组、rhC低剂量组(P < 0.01，P < 0.05)，运动后96 h rhC中剂量组显著低于rhC低剂量组(P < 0.05)，运动后96 h rhC高剂量组显著低于对照组、rhC低剂量组(P < 0.05)。

(2)如图5所示，MMP-14蛋白表达仅受浓度影响，从时程上分析，各组蛋白表达于不同时间点并无显著差异；按不同浓度分析，运动后即刻rhC高剂量组显著低于对照组、rhC低、中剂量组(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.05)，运动后24 h rhC高剂量组显著低于对照组、rhC低剂量组(P < 0.01)，运动后48 h rhC中剂量组显著低于对照组(P < 0.05)，运动后48 h rhC高剂量组显著低于对照组、rhC低剂量组(P < 0.01)，运动后96 h rhC中、高剂量组显著低于对照组、rhC低剂量组(P < 0.05)。
2.6.2 MMP-2、TIMP-2与MMP-2/TIMP-2蛋白表达
(1)MMP-2蛋白表达：如图6所示，MMP-2蛋白表达分别受时间和浓度影响，从时程上分析，各组运动后即刻MMP-2蛋白表达较高，且与运动后即刻相比，对照组运动后96 h显著性降低(P < 0.01)，rhC低、中、高剂量组运动后24 h显著性降低(P < 0.05)；按rhC浓度分析，运动后即刻rhC中、高剂量组显著低于对照组(P < 0.05，P < 0.01)，运动后24 h rhC中、高剂量组显著低于对照组(P < 0.05，P < 0.01)，运动后48 h rhC低、中、高剂量组显著低于对照组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01)，运动后96 h rhC高剂量组显著低于对照组、rhC低剂量组(P < 0.05，P < 0.01)。

(2)TIMP-2蛋白表达：如图6所示，TIMP-2蛋白表达分别受时间和浓度影响，从时程上分析，对照组、rhC低剂量组运动后即刻、24 h TIMP-2蛋白表达较低，对照组运动后48，96 h显著高于运动后即刻(P < 0.05，P < 0.01)，rhC低剂量组运动后96 h显著高于运动后即刻(P < 0.01)，rhC中、高剂量组运动后维持稳定高值且各时间点并无显著性差异(P > 0.05)；按rhC浓度分析，运动后即刻rhC低、中、高剂量组显著高于对照组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01)，运动后即刻rhC中、高剂量组显著高于rhC低剂量组(P < 0.01)；运动后24 h rhC中、高剂量组显著高于对照组、rhC低剂量组(P < 0.05)，对照组与rhC低剂量组之间无显著性差异(P > 0.05)；运动后48 h rhC中、高剂量组显著高于对照组、rhC低剂量组(P < 0.05)，rhC中剂量组显著高于rhC高剂量组(P < 0.05)；运动后96 h rhC中、高剂量组显著高于对照组(P < 0.01，P < 0.05)。
(3)MMP-2/TIMP-2：如图6所示，MMP-2/TIMP-2蛋白表达分别受时间和浓度影响，从时程上分析，各浓度组于运动后24，48，96 h的MMP-2/TIMP-2蛋白比值显著低于运动后即刻(P < 0.01)；按rhC浓度分析，在运动后0，24，48 h，rhC低、中、高剂量组显著低于对照组(P < 0.01)，rhC中、高剂量组也显著低于rhC低剂量组(P < 0.05)，且运动后96 h rhC中、高剂量组显著低于对照组、rhC低剂量组(P < 0.01)。

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引言

细胞外基质作为骨骼肌发挥功能的重要组成部分，其在保护肌纤维、肌内毛细血管和神经等方面发挥了关键的“支架”作用[1-2]。细胞外基质所构成的膜性网状结构具有支持、连接、营养、保护和修复肌组织的作用，对肌纤维、肌束和肌肉整体的活动也起着重要的调节作用。高强度或不习惯的运动常诱导骨骼肌损伤发生，并伴随着炎症反应和细胞外基质降解[2-3]，细胞外基质的结构变化不仅影响骨骼肌正常收缩的力学传递，还可引起保护骨骼肌的横向张力缺失[4-5]。包被肌纤维的薄层结缔组织膜作为肌内结缔组织(intramuscular connective tissue，IMCT)网状结构的主要构成，可通过调节细胞外基质重塑维持骨骼肌整体功能及结构完整，是运动后骨骼肌重塑的重要体现[6]。
正常情况下，骨骼肌细胞外基质的生成和降解处于动态平衡中，高强度运动或不习惯的运动可使与细胞外基质重塑相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其抑制剂表达失调[3]。其中，MMP-2，9，14可对骨骼肌组织胶原成分进行调控，经前体活化后发挥降解细胞外基质的作用。此外，基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)通过高效的亲和力与 MMPs 催化位点以 1∶1的比例结合形成抑制复合物，封闭MMPs催化域，对MMPs起到抑制的作用[7]。研究表明，大强度运动可引起MMPs及MMPs/TIMPs显著增加，诱导细胞外基质生成和降解失衡，从而影响骨骼肌正常的力学功能[8-14]。因此，MMPs及MMPs/TIMPs是衡量运动性骨骼肌损伤后重塑进程的重要靶标。
补充胶原蛋白可调节细胞外基质平衡，增强伤口愈合潜力[15-16]，改善病理骨骼肌功能[17-19]，但对运动诱导的生理性骨骼肌损伤的作用及机制尚未明确。一方面，加速运动后骨骼肌重塑不仅可缓解机体延迟性肌肉酸痛，还可提升其功能恢复效率；另一方面，目前市售胶原蛋白主要为动物来源，存在提取工艺复杂、活性表达较低及存在污染风险等问题，亟待解决。基于此，该研究采用离心运动模型，通过补充不同剂量重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen，rhC)，观察其对运动后骨骼肌细胞外基质重塑的影响，研究rhC能否促进运动后IMCT恢复，并进一步探讨其有效剂量及可能机制，为防治运动性骨骼肌损伤提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年6月至2022年6月在北京体育大学运动生理学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄健康雄性C57B/6J小鼠128只，体质量为20-25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，使用许可证号：SCXK(京)2021-0006。小鼠在自然光照、环境温度21-23 ℃、湿度40%-60%的动物房内饲养，自由进水进食。
实验方案经北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准，审批号为2021057A。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

1.3.2 材料 rhC由艾兰得健康控股有限公司提供(供应商：江苏江山聚源生物技术有限公司，批号：PA2090S001)，rhC成分见表 1。

1.3.3 试剂 40 g/L多聚甲醛溶液、苏木精-伊红染色液(索莱宝科技公司，中国)；无水乙醇、二甲苯、中性树脂(国药集团，中国)；肌酸激酶试剂盒(南京建成生物工程公司，中国)；RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技术，中国)；蛋白酶抑制剂(Roche，瑞士)；牛血清白蛋白(Sigma，美国)；BCA蛋白定量试剂盒、上样缓冲液、还原剂、电泳预制胶和电泳缓冲液、ECL发光液(Thermo Scientific，美国)；PVDF膜(Millipore，美国)；Marker、GAPDH、MMP-2、MMP-9、MMP-14一抗(Proteintech，中国)；TIMP-2一抗(Immunoway，美国)；二抗(Abcam，英国)；甲醇(国药集团，中国)。
1.3.4 仪器与设备脱水机(DIAPATH，德国，型号：Donatello)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，中国，型号：JB-P5)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，中国，型号：RM2016)；冻台(武汉俊杰电子有限公司，中国，型号：JB-L5)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，中国，型号：KD-P)；染色机(DIAPATH，德国，型号：Giotto)；正置光学显微镜(尼康，日本，型号：Nikon Eclipse E100)；成像系统(尼康，日本，型号：NIKON DS-U3)；小动物跑台(淮北正华生物仪器设备有限公司，中国)；ZS-ZL大小鼠抓力测试仪(北京众实迪创科技发展有限责任公司，中国)；高速低温冷冻离心机(Eppendorf，德国，型号：5424R)；多功能酶标仪(EnVision，英国，型号：11028500)；组织匀浆机(Fluko，中国)；小型垂直电泳槽(Thermo Scientific，美国)；蛋白转印槽(Bio-rad，美国)；扫描电子显微镜(Zeiss，德国)。
1.4 实验方法

1.4.1 动物实验设计研究技术路线图如图1所示，选取8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠104只，待小鼠适应动物房环境后，将其随机分为对照组(生理盐水)、rhC低剂量组(0.2 g/kg rhC)、rhC中剂量组(1.0 g/kg rhC)、rhC高剂量组(2.0 g/kg rhC)，每组26只，连续7 d灌胃，对照组给予生理盐水，rhC组用生理盐水按上述剂量配制rhC溶液，灌胃体积为0.2 mL，1次/d，持续7 d。干预后每组选取2只小鼠，解剖各脏器(心脏、肝脏、脾、肾)进行苏木精-伊红染色，其余小鼠于第8天进行离心运动建模，分别在离心运动后即刻(0)，24，48，96 h进行取材，每个时间点6只。

运动方案：采用动物跑台进行运动干预，使用一次性离心运动损伤造模方案[20]。适应性训练：适应性运动3 d，跑台坡度0°，起始时间10 min，1次/d，以后每天递增5 min，跑速10 m/min，共进行3 d。离心运动方案：休息2 d后，15°下坡跑，初始速度5 m/min，1 m/5 min 递增，至17 m/min，训练时间60 min。该一次离心运动方案为既定方案、定量负荷、中等强度。离心运动干预前测得各组抓握力基线值，待小鼠恢复3 d后进行损伤造模，并于正式运动后即刻(0)，24，48，96 h连续检测抓握力观察其恢复情况。
1.4.2 样本采集和处理 ①灌胃7 d后，各组选取2只小鼠，用镊子摘取眼球进行内眦取血，取血后脱颈处死小鼠，迅速取出心脏、肝脏、脾、肾，放入提前预冷的生理盐水中进行冲洗，用滤纸吸干组织表面液体，将其放入 40 g/L多聚甲醛中固定48 h，经组织脱水、石蜡包埋制成 10 μm 切片，再经组织脱蜡，最后苏木精-伊红染色观察炎性浸润及各组织形态。②在运动后相应时间点进行内眦取血，血液于1.5 mL EP管中静置沉淀2 h以上，随后置于低温离心机中，3 000 r/min离心10 min，离心结束后用200 μL移液枪吸取淡黄色上清液分装于 200 μL EP管内，用于后期检测肌酸激酶活性。取血后脱颈处死小鼠，处死后速取后肢双侧股四头肌，剔除肌腱及筋膜组织，左侧股四头肌锡纸包裹用于后期Western blot检测，右侧股四头肌置于1.5 mL EP管中用于形态学观察。采集的样品均迅速投入液氮，随后保存于-80 ℃冰箱，待测。
1.5 主要观察指标
1.5.1 苏木精-伊红染色观察炎性浸润及各组织形态 ①石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-体积分数75%乙醇5 min，自来水洗；②苏木精染色：切片入苏木精染液染3-5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；③伊红染色：切片依次入体积分数85%，95%的梯度乙醇脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min；④脱水封固：切片依次放入无水乙醇Ⅰ5 min -无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ 5 min-二甲苯Ⅰ5 min- 二甲苯Ⅱ 5 min透明，中性树胶封固； ⑤显微镜观察，图像采集分析。
1.5.2 抓握力测试使用ZS-ZL大小鼠抓力测试仪采集小鼠四肢抓力。组装校准好仪器，置于水平平台，提起小鼠尾部，将小鼠四肢放置在抓力仪感应横杆上，待小鼠四肢抓紧横杆后，水平向后拖拽其尾部，至其四肢松开。抓力仪自动记录抓杆过程中小鼠的抓力曲线，每次测试结束后读取稳定峰值。重复测量3次，取最大值记为小鼠四肢抓力，单位为“g”。抓握力恢复率为运动后各时间点所测值与基线抓握力的比值。
1.5.3 血清肌酸激酶活性首先，按照试剂盒说明配置溶液；其次，取小鼠血清置于检测体系中混匀，45 ℃水浴15 min；最后，使用酶标仪测定各样本的吸光度值，将其代入公式计算肌酸激酶活性。
1.5.4 扫描电镜观察IMCT网状结构取右侧股四头肌在研钵内进行液氮脆断，将其置于3%戊二醛中前固定，0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，之后用1%锇酸后固定，再用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，乙醇系列脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，离子溅射后，用扫描电子显微镜观察骨骼肌横断面IMCT网状结构。
1.5.5 Western blot检测骨骼肌MMPs/TIMPs蛋白水平常规提取并测定骨骼肌组织蛋白浓度后，调整样品体积为10 μL/孔，蛋白浓度为10 μg/孔。配制好样品后于70 ℃煮样10 min，冷却至常温后用NuPAGE Novex 4%-12% Bis-Tris凝胶电泳分离蛋白，电泳时间为60 min。电泳结束后将蛋白采用湿转法转至PVDF膜上(恒流300 mA，90 min)，BSA封闭2 h，加入5% BSA稀释的内参(GAPDH，1∶20 000)、一抗(MMP-2，1∶1 000；MMP-9，1∶1 000；MMP-14，1∶500；TIMP-2，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，二抗(1∶3 000)孵育1 h，TBST洗涤3次，加化学发光液曝光显像，采用Image J软件分析条带灰度值。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。所有统计数据结果以x±s表示。小鼠抓握力恢复率、肌酸激酶活性及MMPs/TIMPs蛋白水平采用双因素方差分析检验交互作用，同一时间点或同一浓度下的比较使用单因素方差分析，并采用LSD方法进行比较。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。文章统计学方法已经通过北京体育大学运动人体科学学院统计学专家审核。

讨论

补充胶原蛋白能否促进运动性骨骼肌损伤恢复尚存争议。LOPEZ等[22]认为长期补充胶原蛋白有助于改善肌肉酸痛，提高运动表现，而CLIFFORD等[23]发现补充胶原蛋白对预防肌肉损伤和促进力量恢复并无明显作用。WATANABE- KAMIYAMA等[24]通过14C标记，证明小鼠在摄入胶原蛋白后3 h，血浆中的胶原蛋白水解产物浓度达到峰值；2-6 h后，被标记的甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(Gly-Pro-Hyp)三肽分布至全身各主要器官。IWAI等[25]研究了来自猪皮、鸡爪和软骨胶原蛋白肽在人体中的吸收特点，发现1-2 h后人体内的胶原蛋白肽浓度达到峰值，4 h后人体内的胶原蛋白肽浓度为峰值的一半，并指出胶原蛋白主要以生物活性多肽的形式吸收，而不是单纯的游离氨基酸。前期实验证实，口服胶原蛋白一定时间后，血浆中不仅出现了羟脯氨酸等游离氨基酸，还出现了胶原蛋白特征性的脯氨酸-羟脯氨酸(Pro-Hyp)、羟脯氨酸-甘氨酸(Hyp-Gly)、甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(Gly-Pro-Hyp)肽段[26]。此外，动物和人体研究均证明，口服胶原蛋白12 h后，95%以上的胶原蛋白已被吸收利用，表明胶原蛋白具有较好的消化吸收特性[27]。胶原蛋白被吸收后不仅起到直接的补充作用，而且可显著促进胶原蛋白的合成率，该特点显著提升了其效能[28]。该研究发现，胶原蛋白预补充可有效防止运动后细胞外基质降解，维持其力学传递，从而促进运动后IMCT损伤恢复。目前市售胶原蛋白主要从鱼皮、鱼鳞、牛皮、牛骨中提取，此类动物源胶原蛋白虽来源广泛、制造成本低，但食补收效甚低，外用也很难被吸收[29]。rhC具有分子质量确定、可加工性强、水溶性强、排异反应低、无病毒隐患等优势[29-30]。该实验从骨骼肌功能和形态两方面证实，短期补充中、高剂量rhC可有效维持运动后IMCT网状结构的完整，显著提高定量离心运动后早期小鼠抓握力水平。依据现有结果作者大胆推测，补充rhC可能增强小鼠力竭运动表现，仍需后续实验进一步证实。
该研究的目的是想将rhC应用到训练实践中促进运动员功能恢复以及预防损伤，充分挖掘其运动营养补剂的功能，所以对该补剂进行安全性评价就显得至为重要。运动营养补剂多是一种特异性的营养素，是为了满足人们长期从事体力活动的需要、提高运动表现及促进功能快速恢复而开发的运动营养类产品。目前市面上的运动营养补剂种类繁多，有力量爆发类补剂、有氧耐力类补剂、恢复并消除疲劳类补剂等，它们能够有效保障运动员的训练状态，加快机体的恢复进程。补剂的不合理使用不仅达不到预期效果，甚至还会危及身体健康。如咖啡因刺激使机体保持专注与兴奋，能够增强耐力与爆发力，但服用咖啡因的时间不恰当会影响运动员的正常休息；训练时使用乳清蛋白可显著增加肌肉的质量与力量，但对乳糖不耐受人群而言会引起一系列胃肠道不良反应(腹胀、排气、胃痉挛和腹泻)；肌酸产品常被用于爆发式高强度运动中促进肌肉的生长以及提高肌肉力量，但长期服用肌酸影响肝脏、肾脏的功能等[31]。因此，对补剂进行安全性评价至为关键。小鼠经过连续7 d灌胃不同剂量rhC溶液后，通过苏木精-伊红染色法观察短期补充该产品对各组织形态的影响，分析切片结果得出： rhC低、中、高剂量组小鼠各脏器与对照组相比未见明显差异，各组均无炎性浸润，心肌结构正常、横纹清晰，肝脏结构完整、肝小叶肝窦清晰，脾小体结构清晰、脾脏结构正常，肾小球囊腔清晰可见，肾小球、肾小管均未见异常。小鼠各脏器组织切片均无异样，这说明短时间内连续服用rhC对小鼠各脏器无形态学影响，这进一步说明了rhC的安全性。
骨骼肌细胞外基质不仅在力的传递和维持中发挥着关键作用，且在保护肌纤维及促进其修复中具有重要意义[6，32-33]。大量研究认为，运动性骨骼肌损伤诱导的细胞外基质降解会阻碍力的传递[3，6，33]。PASSERIEUX等[34]深入研究了骨骼肌细胞外基质的结构和功能，发现骨骼肌以肌束膜为重要“桥梁”，一方面通过主干侧支肌束膜衔接盘与肌内膜、肌膜相衔接，另一方面通过肌束膜主干两端蜂窝管(管状结构)与肌腱相连，把骨骼肌组织连结为一个张力整体。大量证据表明，由肋状体-肌内膜-肌束膜-肌外膜-肌腱构成的横向张力传递通路在维持骨骼肌功能稳态方面发挥重要作用[35]。当肌节受损时，相邻未损伤肌节产生的张力可通过肋状体横向传递至细胞外基质，最终传递至肌腱，避免已损伤肌节过度牵拉，从而起到保护肌纤维的作用[4]。一定强度的离心运动是诱导骨骼肌损伤的常用模型，可引起骨骼肌力量显著下降[36]。该研究发现，运动后即刻对照组与rhC低剂量组的细胞外基质结构破坏明显，运动后24 h对照组仍处于结构紊乱期，而rhC低剂量组已出现良好的恢复效应，表明rhC低剂量组的细胞外基质恢复速度快于对照组；运动后即刻，rhC中、高剂量组肌束膜完整性明显高于对照组、rhC低剂量组，表明短期补充低剂量rhC可促进细胞外基质恢复，中、高剂量rhC可在一定程度上预防骨骼肌细胞外基质受损。一次性离心运动诱导对照组、rhC低剂量组IMCT网状结构完整性破坏及收缩力显著下降，而rhC中、高剂量组小鼠抓握力恢复率显著升高且IMCT网状结构较为完整，这表明补充中、高剂量rhC的小鼠骨骼肌力学表现受损程度较低，补充rhC可对定量负荷运动后骨骼肌的力学功能起到保护作用，预补充rhC可预防骨骼肌细胞外基质损伤并提高恢复期的运动表现。该实验采用的是中高强度的定量离心造模方案，提示预补充rhC可能有助于长时间高强度运动中运动表现的维持。离心运动后血清肌酸激酶变化的时程特点显著，但各时间点不同剂量rhC干预对肌酸激酶并无影响，表明rhC预补充7 d对运动后骨骼肌质膜损伤修复并无明显作用，该结果表明补充rhC主要通过改善细胞外基质来促进骨骼肌功能恢复，而不是以骨骼肌质膜的修复为“突破口”实现的。
MMP-2，9，14的主要作用底物是骨骼肌细胞外基质的关键成分，因此其在骨骼肌中表现出较强的生物活性。TIMPs对MMPs有拮抗作用，故常用MMPs/TIMPs的比值来衡量细胞外基质重构[37]。离心运动后各组MMPs/TIMPs蛋白表达结果显示，MMP-9，14蛋白表达受浓度影响，rhC高剂量组MMP-9蛋白表达显著低于对照组、rhC低剂量组，rhC中、高剂量组MMP-14蛋白表达显著低于对照组、rhC低剂量组，表明补充rhC可明显下调MMP-9，14蛋白水平；MMP-2、TIMP-2蛋白表达分别受时间和浓度影响，rhC中、高剂量组MMP-2蛋白表达显著低于对照组、rhC低剂量组，而rhC中、高剂量组TIMP-2蛋白表达显著高于对照组、rhC低剂量组；各浓度组于运动后24，48，96 h的MMP-2/TIMP-2比值显著低于运动后即刻，rhC各补充组MMP-2/TIMP-2比值显著低于对照组，表明该比值分别受时间和浓度影响，补充rhC可显著下调该比值。急性运动造成MMPs过表达，刺激机体内细胞外基质的过度降解[3，38]，故调节MMPs和TIMPs之间的平衡，能够积极改善损伤后细胞外基质重塑。RULLMAN等[38]认为急性大负荷递增运动不仅增加了运动后即刻、120 min后MMP-9 mRNA的表达，而且还增强了MMP-9的活性。HJORTH等[39]报道运动将上调MMP-14的基因表达，并影响胶原蛋白的合成。KOSKINEN等[11]研究表明，人体经下坡跑运动诱导骨骼肌损伤后，可观察到血清中MMP-2/TIMP-2急剧升高。IWANAGA等[40]证实高血压大鼠从心肌肥厚向心力衰竭转化过程中MMP-2被过度激活，其活性远远高于TIMP-2，最终导致了左心室细胞外基质的病理性降解。LANG等[41]发现MMP-2的高表达可加剧心肌缺血再灌注损伤，而升高的TIMP-2可通过抑制MMP-2以减轻损伤，提示下调MMPs/TIMPs具有特殊的保护效应。骨骼肌细胞外基质的重塑是运动后骨骼肌功能恢复的重要体现，该实验发现短期补充中、高剂量的rhC可使MMP-2，9，14水解活性下降，TIMP-2抑制作用增强，促进细胞外基质重塑，为改善运动性骨骼肌细胞外基质损伤，促进运动后恢复提供了新思路。
结论：短时间内连续服用rhC对小鼠各脏器形态学无影响；连续7 d预补充1.0，2.0 g/kg rhC可有效预防离心运动后骨骼肌细胞外基质损伤、维持IMCT网状结构的完整性，其可通过下调MMP-2，9，14和上调TIMP-2抑制运动后骨骼肌细胞外基质降解，从而调节小鼠骨骼肌力量恢复。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响

Effects of recombinant human collagen supplementation on extracellular matrix remodeling in mouse skeletal muscle after eccentric exercise

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