缓释万古霉素三维支架修复兔感染性骨软骨缺损

doi:10.12307/2024.488

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (22): 3509-3516.doi: 10.12307/2024.488

• 组织工程软骨材料 tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

缓释万古霉素三维支架修复兔感染性骨软骨缺损

李兴屿1，周杰1，李沙沙1，张天喜1，郭国宁1，喻安永1，邓江2，叶鹏1

1遵义医科大学附属医院急诊科(急救创伤病区)，贵州省遵义市 563003；2遵义市第一人民医院骨科，贵州省遵义市 563003

收稿日期:2023-04-04 接受日期:2023-09-28 出版日期:2024-08-08 发布日期:2024-01-20
通讯作者: 叶鹏，博士，副主任医师，遵义医科大学附属医院急诊科(急救创伤病区)，贵州省遵义市 563003
作者简介:李兴屿，男，1996年生，贵州省遵义市人，汉族，硕士，主要从事急诊骨关节创伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(H0606)地区科学基金，项目名称：SF/CS/nHA仿生支架结合骨软骨镶嵌移植术和PRP对大面积骨软骨缺损修复的研究，项目负责人：邓江；贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2021]074号)，项目名称：基于HIF-1a信号通路NGF-BMSC/ColⅡ/ColⅠ-SF-CS-nHA种植体软骨缺损修复作用机制研究，项目负责人：叶鹏；贵州省科技计划项目(黔科合成果-LC[2022]034)，项目名称：Minics虚拟复位联合3D打印技术在胫骨平台shakcz III-VI型骨折中的临床应用研究，项目负责人：郭国宁；遵医附院优秀青年人才培养计划项目(RC220220911)，项目负责人：叶鹏

Repair of infected osteochondral defect with sustained release vancomycin three-dimensional scaffold in rabbits

Li Xingyu1, Zhou Jie1, Li Shasha1, Zhang Tianxi1, Guo Guoning1, Yu Anyong1, Deng Jiang2, Ye Peng1

1Emergency Department of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University (First Aid Trauma Ward), Zunyi 563003, Guizhou Province, China; 2Department of Orthopedics, Zunyi First People’s Hospital, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Received:2023-04-04 Accepted:2023-09-28 Online:2024-08-08 Published:2024-01-20
Contact: Ye Peng, MD, Associate chief physician, Emergency Department of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University (First Aid Trauma Ward), Zunyi 563003, Guizhou Province, China
About author:Li Xingyu, Master, Emergency Department of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University (First Aid Trauma Ward), Zunyi 563003, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (Regional Science Foundation), No. H0606 (to DJ); Guizhou Science and Technology Plan Project, No. [2021]074 (to YP); Guizhou Science and Technology Plan Project, No. [2022]034 (to GGN); Outstanding Young Talents Training Program of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, No. RC220220911 (to YP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

抗感染支架：骨组织抗感染支架材料是一种用于帮助修复骨组织感染的材料，它由多孔材料制成，具有良好的生物相容性，可以促进骨组织的生长和愈合，这种材料还具有抗菌性能，可以有效抑制细菌生长和繁殖。
骨软骨单元：由关节软骨成分和较深的软骨下骨成分组成，软骨主要由密集的细胞外基质和少量的软骨细胞组成，软骨下骨是骨软骨单位最深的组织，主要由羟基磷灰石和Ⅰ型胶原组成，因此软骨下骨有较强的硬度和刚度。

背景：大量研究证实组织工程支架几乎可完全修复骨软骨缺损，但当骨软骨缺损合并感染时，即使前期经过彻底的清创，单纯骨软骨组织工程支架的修复效果往往不理想。

目的：制备盐酸万古霉素缓释微球丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架，观察其对兔股骨远端感染性骨软骨缺损的修复效果。
方法：①采用乳化溶剂挥发法制备盐酸万古霉素缓释微球；将不同质量(7.5，10，12.5 mg)的缓释微球分别与丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石溶液混合，利用化学交联法制备盐酸万古霉素缓释微球丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架，表征支架的孔隙率、吸水膨胀率、热水溶失率及体外药物缓释等。②将45只新西兰大白兔随机分为空白组、对照组、实验组，每组15只，均建立右后肢股骨远端骨软骨缺损并感染模型，空白组不作任何处理，对照组缺损处植入丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石支架，实验组缺损处植入盐酸万古霉素缓释微球(10 mg)丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架。术后1周，检测血液样本C-反应蛋白、白细胞水平；术后4，8，12周取术区组织，分别进行大体观察与病理学观察。

结果与结论：①随着缓释微球含量的增加，支架的孔隙率降低，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；3组支架的孔径大小、吸水膨胀率、热水溶失率比较差异均无显著性意义(P > 0.05)；3组支架体外均可持续释放盐酸万古霉素达30 d以上。②实验组兔血液样本C-反应蛋白、白细胞水平均低于空白组、对照组(P < 0.05)；实验组兔术后各时间点的大体软骨修复情况明显好于空白组、对照组；苏木精-伊红、Masson、阿利新蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色显示，实验组兔术后各时间点的骨软骨修复效果明显优于空白组、对照组。③结果表明，盐酸万古霉素缓释微球丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架能有效促进开放性骨软骨缺损的修复。

https://orcid.org/0009-0004-1957-2647(李兴屿)；https://orcid.org/0000-0002-4476-7604(叶鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 载药微球, 万古霉素, 骨软骨缺损, 组织工程, 丝素蛋白, 壳聚糖, 纳米羟基磷灰石, 支架

Abstract: BACKGROUND: A large number of studies have confirmed that tissue engineering scaffolds can almost completely repair osteochondral defects. However, when osteochondral defects are complicated with infection, even after thorough debridement in the early stage, the repair effect of simple osteochondral tissue engineering scaffolds is often unsatisfactory.
OBJECTIVE: To prepare fibroin/chitosan/nano-hydroxyapatite scaffold loaded with vancomycin hydrochloride sustained release microspheres, and to investigate the repair effect on infected osteochondral defect in distal femur of rabbit.
METHODS: (1) Vancomycin hydrochloride sustained release microspheres were prepared by emulsified solvent evaporation method. The sustained-release microspheres of different weights (7.5, 10, and 12.5 mg) were mixed with fibroin protein-chitosan nanohydroxyapatite solution, and the scaffolds of fibroin protein/chitosan/nano-hydroxyapatite were prepared by chemical crosslinking method. The porosity, water absorption and expansion rate, hot water loss rate of the scaffolds, and drug sustained-release in vitro were characterized. (2) Forty-five New Zealand white rabbits were randomly divided into blank group, control group, and experimental group, with 15 rabbits in each group. The osteochondral defect and infection model of the distal femur of the right hind limb was established in both groups. The blank group was not treated, and the control group was implanted with fibroin protein-chitosan-nano-hydroxyapatite scaffold. Vancomycin hydrochloride sustained-release microspheres (10 mg) of fibroin/chitosan/nano-hydroxyapatite scaffold were implanted in the defect of the experimental group. The levels of C-reactive protein and leukocytes in blood samples were detected 1 week after operation. At 4, 8 and 12 weeks after operation, the tissue of the operative area was taken for gross observation and pathological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of sustained-release microspheres content, the porosity of scaffolds decreased, and there was significant difference among groups (P < 0.05). There were no significant differences in the pore size, water absorption expansion rate and hot water loss rate among the three groups (P > 0.05). Vancomycin hydrochloride was released sustainably in vitro for more than 30 days in all three groups of scaffolds. (2) The levels of C-reactive protein and leukocytes in blood samples of the experimental group were lower than those of the blank group and control group (P < 0.05). The repair of gross cartilage in the experimental group was significantly better than that in the blank group and the control group. Hematoxylin-eosin, Masson, Alcian blue and type II collagen immunohistochemical stainings showed that the osteochondral repair effect of the experimental group was significantly better than that of the blank group and the control group at each time point. (3) The results showed that fibroin/chitosan/nano-hydroxyapatite scaffolds loaded with vancomycin hydrochloride sustained-release microspheres could effectively promote the repair of open osteochondral defects.

Key words: drug-loaded microsphere, vancomycin, osteochondral defect, tissue engineering, fibroin, chitosan, nano-hydroxyapatite, scaffold

中图分类号:

李兴屿, 周杰, 李沙沙, 张天喜, 郭国宁, 喻安永, 邓江, 叶鹏. 缓释万古霉素三维支架修复兔感染性骨软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3509-3516.

Li Xingyu, Zhou Jie, Li Shasha, Zhang Tianxi, Guo Guoning, Yu Anyong, Deng Jiang, Ye Peng. Repair of infected osteochondral defect with sustained release vancomycin three-dimensional scaffold in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(22): 3509-3516.

图/表（结果） 17

2.1 VANCO缓释微球表征结果大体可见VANCO缓释微球呈白色粉末，扫描电镜下为类圆形，分散均匀(图2A)，微球粒径平均为(21.45±6.09) μm，载药率为(23.86±1.35)%，包封率为 (46.21±11.78)%。
体外浸泡于PBS中第1天，微球释放VANCO的量为(11.62±1.85)%，第8天为(58.29±3.39)%，1周内药物释放速度较快，后期释放速度逐渐变缓(图2B)。

2.2 载VANCO缓释微球支架物理性能表征结果
2.2.1 支架大体形态 VANCO缓释微球丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石支架呈白色，形似子弹，无异味，质量轻，支架高约7 mm，直径4.0-5.0 mm，具有较好的弹性和韧性见图3。

2.2.2 支架的孔隙率、吸水膨胀率及热水溶失率支架1-3的孔隙率分别为(87.79±1.03)%，(84.37±3.92)%，(82.14±1.36)%，3组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)(图4A)。以上支架孔隙率均可满足实验细胞生长的空间需求。
支架1-3的吸水膨胀率分别为(2 267±38)%，(2 292±57)%，(2 302±14)%，3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)(图4B)。以上各组支架吸水膨胀率均达到骨软骨组织工程支架要求。

支架1-3的热水溶失率分别为(16.86±0.89)%，(17.11±0.69)%，(16.24±0.96)%，3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)(图5A)。线性回归分析结果显示，支架1-3的R2分别是0.991 0，0.964 1，0.986 3，根据回归曲线计算支架1-3完全被溶蚀的时间分别是56.15，59.47，65.21周(图5B-D)，各组支架热水溶失率结均达到实验支架要求标准。

2.2.3 支架形态及孔径大小扫描电镜下见支架内部形态不规则，呈蜂窝状，多边、类圆形，孔壁凹凸可见，孔与孔相互连通，内部可见VANCO缓释微球和纳米羟基磷灰石沉着(图6)。支架1-3的平均孔径分别为(233.8±15.0)，(215.3±8.3)，(196.0±8.2) μm，3组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)，见图7。各组支架孔径大小均达到实验要求(100-300 μm)。

2.2.4 支架的能谱分析及离子分布载盐酸万古霉素缓释微球支架的组成成分中以 Ca、O和 P元素为主体(图8)，研究表明，在该支架表面存在羟基磷灰石沉淀，可以为骨组织的矿化形成提供原料，同时还具备了很好的生物活性，均符合骨软骨组织工程支架要求。

2.2.5 支架中VANCO累积缓释率根据各组支架缓释曲线可知VANCO持续释放超过30 d，所有支架8 d内ANCO释放百分比大于50%，随着缓释微球质量的增加，VANCO释放曲线更平稳、持续时间更久(图9)。

尽管增加载药微球的量可以提高支架的药物释放效率，但是太多的载药微球也会导致支架的孔隙率和孔径减小，只有加入适当的载药微球才能为细胞的生长、增殖、分化等提供更好的空间和环境。综合以上结果，在支架中加入10 mg VANCO缓释微球最符合细胞生长需求，故选择支架2完成动物实验部分。
2.3 兔软骨缺损修复效果
2.3.1 实验动物数量分析 45只兔全部进入结果分析。
2.3.2 术后兔一般情况 3组兔术后第1-3天精神饮食差，饮食自如。在术后1个月内，空白组有12只兔术区肿胀，红肿面积大，周围组织坏死，见窦道形成，并伴随大量脓液的排出周围形成窦道并流脓；对照组有10只兔术区红肿明显，周围形成窦道并流脓；实验组有2只兔膝关节周围形成窦道并流脓。1个月以后，空白组、对照组兔术后术区及关节处肿胀明显，关节畸形，步态不稳，活动明显受限，切开肿大的关节见机化包裹，暴露关节腔见黄色脓性关节液，部分兔在远离术区的颈背部可见皮下脓肿；实验组兔术后关节活动及饮食自如，部分兔关节活动稍受限，暴露关节腔见关节液透明。见图10。

2.3.3 各组兔血清炎性指标检测空白组、对照组、实验组兔血清白细胞水平分别为(14.02±1.78)×109 L-1，(13.33±2.42)×109 L-1，(9.98±1.78)×109 L-1，实验组白细胞水平低于空白组、对照组(P < 0.05，P < 0.01)，见图11A。空白组、对照组、实验组兔血清C-反应蛋白质量浓度分别为(610.7±73.01)，(566.20±84.31)，(354.20±50.17) ng/mL，实验组C-反应蛋白质量浓度低于空白组、对照组(P < 0.05，P < 0.01)，见图11B。

2.3.4 各组兔关节软骨大体观察及ICRS软骨修复评分空白组、对照组术区均有明显粘连，其中一些液体为黄色，轻微红肿；实验组2只兔术区有轻微粘连，其余兔关节和关节囊均无异常，无明显的滑膜炎和骨赘。空白组术后4-12周缺损部位没有愈合，缺损部位和正常软骨之间的界限清楚。对照组术后4周缺损区无明显修复，8周后术区已被局部软组织覆盖，并出现了局部凹陷；术后12周，术区周边被透明软骨和纤维组织包裹，但中心凹痕依然清晰可见且边缘清晰。实验组术后4周修复区域仍呈明显的凹形，并有一层新的纤维层包裹在其表面；术后8周，术区内充盈纤维及透明软骨；第12周，术区被新的软骨细胞替代，表面平整、光滑，缺损处与关节面边界模糊。各组兔关节软骨大体观察见图12。

随着术后时间的延长，各组兔软骨修复ICRS评分增加，相同时间点下，实验组ICRS评分高于空白组、对照组(P < 0.01)，对照组ICRS评分高于空白组(P < 0.01)，见图13。

2.3.5 各组兔骨软骨修复组织学观察及Wakitani病理评分
Masson染色：空白组至术后12周缺损区仍然没有明显的软骨化现象；对照组至术后12周时缺损区已由新的组织逐步充满，但软骨修复效果差，表面欠光滑，缺损区组织与周围软骨分界明显；实验组术后4-12周时缺损区被新的组织填满，表面平滑，颜色从浅染到暗蓝色，术后12周缺损区已经完全被修复，表面可见清晰的骨-软骨层界限，见图14。

阿利新蓝染色：空白组至术后12周缺损区仍可见明显软骨缺失，阿利新蓝染色阴性；对照组术后4-12周缺损区逐渐被新生组织填充，12周时可见关节面光滑，缺损区与周围软骨分界明显，阿利新蓝染色较淡；实验组术后4-12周缺损区被新生组织填充，表面光滑，阿利新蓝染色由淡染逐渐变为深染色，骨软骨层可见明显分界，见图15。

苏木精-伊红染色：空白组与对照组术后各时间点可见大量炎性细胞浸润，实验组可见相对较少的炎性细胞浸润。空白组术后4-12周缺损区均未见明显组织再生；对照组术后4周缺损区支架表面未见明显纤维组织，术后8周缺损区软骨层纤维组织增生，软骨下骨层出现部分骨小梁结构，分界不清，至12周缺损区修复组织见少量纤维软骨，软骨下骨未完全重建，骨软骨层分界不清晰；实验组术后4周缺损区可见纤维软骨修复，8周缺损区透明软骨增生明显且可见较多骨小梁结构，至12周软骨层与软骨下骨层修复比较完整、分界明显，可见潮线，见图16。

免疫组化染色：空白组至术后12周仍未见明显Ⅱ型胶原蛋白表达；对照组至术后12周修复组织中可见Ⅱ型胶原蛋白少量表达；实验组术后4周修复区见有少量Ⅱ型胶原蛋白均有表达，术后8，12周修复组织中Ⅱ型胶原蛋白表达增加，骨软骨分界明显，见图17。

Wakitani评分：随着术后时间的延长，对照组、实验组Wakitani评分降低，相同时间点下，实验组Wakitani评分低于空白组、对照组(P < 0.01，P < 0.001，P < 0.000 1)，见图18。

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引言

骨软骨覆盖长骨两端，能减少骨摩擦，在关节活动中起重要作用。骨软骨缺乏血管、神经和淋巴分布，因此营养的获取主要来源于软骨下骨少量的血液和关节腔内关节液[1]。也正是因为其独特的解剖结构，软骨损伤后很难实现自身完全修复[2-3]。开放性骨关节骨折累及关节面常合并有局部的骨软骨缺损[4-5]，外科手术是开放性关节骨软骨损伤的主要治疗方式，主要有同种异体骨软骨移植术[6-7]、自体骨软骨镶嵌成形术、自体软骨细胞植入术和微骨折术等[8-10]，均可取得一定的效果，但也存在不足。自体骨软骨镶嵌成形术被认为是目前最好的治疗方法，但存在需要二次手术及供体不足等缺点；同种异体骨软骨移植术存在需二次手术、免疫排斥等缺点。对合并感染的骨软骨缺损，任何手术方式的治疗效果都不理想。因此，探索一种既具备抗感染能力又能一期修复骨软骨缺损的治疗方法来缩短病程及改善预后，具有重要意义。
随着组织工程技术的兴起，组织工程支架逐渐成为骨软骨缺损治疗的新方向。组织工程支架作为载体不仅能为细胞增殖分化提供一定的空间，还能刺激成骨细胞，促进骨软骨细胞的形成，目前已被广泛应用于皮肤[11]、骨软骨[12-13]、血管等领域[14]。大量研究证实组织工程支架几乎可完全修复骨软骨缺损[15-17]，但当骨软骨缺损合并感染时，即使前期经过彻底的清创，单纯骨软骨组织工程支架的修复效果复往往不理想。开放性骨关节损伤常并发化脓性感染，感染的主要病原体是金黄色葡萄球菌，其次是假单胞菌、大肠埃希菌等，手术彻底清创加上持续全身应用抗生素是治疗感染性骨软骨缺损的主流和有效方式。盐酸万古霉素(vancomycin hydrochloride，VANCO)是一种糖肽类抗生素不易产生细菌耐药性，可作为治疗金黄色葡萄球菌感染时的首选药物[18]，美国传染病学会甚至将VANCO推荐用于全关节置换术前外科预防[19]，但VANCO在体内的半衰期短，不能达到长时间抗菌效果。有研究表明，化脓性感染的抗生素治疗常需要维持高血药浓度至少3个月[20]，这必然需要长期住院，并且有高复发风险。相对于静脉用药，开放性骨折局部应用抗生素已取得了一定成功[21-22]，但仍需要重复给药，同样给患者带来很多不适感。为解决此问题，抗生素缓释微球支架逐渐成为研究的热点。研究者提出制备VANCO缓释微球支架来缓慢释放VANCO，以提高药物利用率、有效阻止细菌感染、缩短患者住院时间[23-24]，以及避免高剂量抗生素引发的肾毒性。
在前期成功构建的三维组织工程支架基础之上，此次实验采用冷冻干燥法、化学交联法制备VANCO缓释微球支架，观察该支架对感染兔骨软骨缺损的修复效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计 VANCO缓释微球支架的抗菌性能、骨软骨修复性能，两组间独立样本比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年9月至2023年2月在遵义市骨科研究所、遵义医科大学中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物二三月龄新西兰大白兔45只，雄性，体质量(2.44±0.18) kg，由贵州亿科达生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(黔)2021-0001。动物饲养室保持恒温(温度20-25 ℃，相对湿度20%-25%)。实验方案已通过遵义医科大学实验动物伦理委员会审核[编号：KLLY-2020-225]。
1.3.2 主要材料壳聚糖、纳米羟基磷灰石、丝素蛋白、氢氧化钠(上海aladdin公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺(Sigma-Aldrich)；乙酸乙酯(安徽biosharp公司)；乙二胺四乙酸(南昌雨露公司)；抗Ⅱ型胶原蛋白单克隆抗体(美国Genx Tex公司)；VANCO (希腊VIANEX S.A.公司)；金黄色葡萄球菌(BNCC186335，商城北纳创联生物技术有限公司)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(重庆渝偲医药科技有限公司)。
1.3.3 主要仪器铸模槽(安徽biosharp公司)；移液器(2.5/10/20/100/200/1 000 µL，德国Eppendorf公司)；紫外分光光度仪(北京五洲东方科技公司)；发射扫描电子显微镜冷场扫描电镜(日立高新技术公司)；冷场扫描电镜能谱仪(日本HORIBA公司)；真空冷冻干燥机(SCIENTZ18ND，中国宁波新芝公司)。
1.4 方法
1.4.1 VANCO浓度-吸光度标准曲线的建立精密称取50 mg VANCO置于50 mL容量瓶中，加入50 mL PBS(0.01 mol/L)配置质量浓度1 mg/mL的VANCO溶液。分别取0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12 mL的VANCO溶液至不同的50 mL容量瓶中，加入0.01 mol/L的PBS并定容至50 mL，分别得到10，20，30，40，50，60，80，120，160，240 μg/mL的VANCO标准溶液。以0.01 mol/L的PBS作为空白对照进行校准。使用紫外分光光度计在280 nm处测定吸光度值。以吸光度值和VANCO质量浓度得到标准曲线方程：y=0.004 183x+0.000 866，R2=0.999。
1.4.2 VANCO缓释微球的制备采用水-油-水(W-O-W)乳化溶剂挥发法制备VANCO缓释微球。将900 mg聚乳酸-羟基乙酸(聚乳酸-羟基乙酸∶ 聚乳酸=3∶1)和75 mg VANCO 依次加入8 mL二氯甲烷中，分别用超声波处理30 s；再将所得混合物匀速缓慢滴入3%聚乙烯醇溶液600 mL中，4 ℃下磁力搅拌4 h(300 r/min)；将混合液5 000 r/min离心10 min，取上清液，4 000 r/min离心10 min，取沉淀即为缓释微球。将释放微球在-80 ℃下冷藏2 h，放入真空冷冻干燥箱中干燥处理24 h，最终得到570.49 mg的VANCO缓释微球。
1.4.3 VANCO缓释微球的表征
缓释微球形态、粒径检测：通过扫描电镜观察并测量VANCO缓释微球的形貌与粒径。
缓释微球载药量、包封率检测：将VANCO微球于乙酸乙酯溶液中进行复溶后加入适量PBS，充分振荡混匀，使用分光光度计在280 nm波长下测定所得溶液的吸光度值，根据VANCO质量浓度与吸光度值的标准曲线方程计算出VANCO含量。
载药量=缓释微球中所含VANCO的质量/缓释微球的总质量×100% 公式(1)
包封率=缓释微球包封的VANCO总质量/投入VANCO质量总和×100% 公式(2)
缓释微球体外药物缓释检测：取10 mg VANCO缓释微球溶于5 mL PBS中，置于37 ℃振荡培养箱(90 r/min)中孵育。第1-29天取出PBS 2 mL(同时补充新鲜的PBS)，-20 ℃保存，在280 nm处测量吸光度值，根据VANCO质量浓度-吸光度标准曲线计算各时间段VANCO的质量浓度，统计各时间段VANCO累积释放百分率，然后制作缓释微球的时间-VANCO释放百分率曲线。
1.4.4 VANCO缓释微球丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石支架的制备参照课题组前期制备三维支架方法[25]，取10 mL质量分数2%的丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石(丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石的质量比为1∶1∶1)混合溶液搅拌均匀，冷却后分别加入质量7.5，10，12.5 mg的VANCO缓释微球混合，常温搅拌均匀后形成均一黏稠的溶液，迅速取混合液1.2 mL加入铸模槽中，冷冻干燥24 h后用等体积比的75%CH3OH、1 mol/L NaOH混合溶液进行交联；再经过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液交联24 h，冷冻干燥48 h后得到支架1(含缓释微球7.5 mg)、支架2(含缓释微球10 mg)、支架3(含缓释微球12.5 mg)，4 ℃保存备用。
1.4.5 VANCO缓释微球丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石支架的表征
支架大体观察检测：用游标卡尺测量支架的直径、长度，用电子天平测定支架质量。
支架孔隙率检测：取适当体积的乙醇置于小量桶内，记录体积，记为V1；将支架置入40 min后读取量桶中乙醇体积，记为V2；将支架取出，记录剩余乙醇体积，记为V3。
P(孔隙率)=(V1-V3)/(V2-V3)×100% 公式( 3)
支架吸水膨胀率检测：将支架浸入双蒸水中24 h，取出支架后用滤纸吸干表面水分后称质量，记为m1，然后将支架放置-80 ℃冷冻24 h、真空干燥24 h，称支架质量，记为m2。
P(吸水膨胀率)=(m1-m2)/m2×100% 公式( 4)
支架热水溶失率检测：称量彻底真空干燥后的支架质量，记为m1；将支架浸入双蒸水中，置于37 ℃恒温水浴箱中持续振荡，于1，2，3，4，5，6周将支架烘干，称量残余支架质量，记为m2。
P(热水溶失率)=(m1-m2)/m1×100% 公式 (5)
支架内部结构：将支架从横切面切开后行离子喷金处理，使用扫描电镜观察其内部结构。每个支架测量10个孔径，取平均值得到支架孔径尺寸。
支架能谱分析及离子分布：利用光电效应原理来鉴别支架中化学元素的含量和组成，进行定性及半定量分析。
支架体外药物缓释检测：3组支架各取8个溶于5 mL PBS中，置于37 ℃振荡培养箱(80 r/min)中孵育。于1-29 d取出全部PBS，并补充对应体积的PBS，取出液置于-20 ℃保存，在280 nm处测量吸光度值，根据VANCO质量浓度-吸光度标准曲线计算各时间段VANCO质量浓度，统计各时间段VANCO累积释放百分率，制作支架的时间-VANCO释放百分率曲线。
1.4.6 支架修复兔感染性骨软骨缺损

实验动物分组与干预：采用随机数字表法将45只新西兰大白兔分为空白组、对照组与实验组，每组15只。盐酸赛拉嗪肌肉注射(0.02 mL/kg)麻醉3组兔，麻醉生效后消毒、铺巾，在右后肢膝关节沿髌骨旁逐层竖行切开，暴露股骨髁间孔处关节面，用电动手钻将无菌克氏针固定，在股骨髁间窝关节面建立一直径4 mm、深度7 mm的软骨缺损区；根据预实验结果在缺损区注入金黄色葡萄球菌悬液(105 CFU/mL，0.02 mL/kg)，静置6 h后局部依次用双氧水、碘伏、生理盐水彻底冲洗；空白组不做特殊处理，对照组植入丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石支架，实验组植入VANCO缓释微球(10 mg)丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石支架，复位髌骨，逐层缝合伤口。术后单笼饲养。实验步骤见图1。观察术后兔刺激反应、行走步态、饮食及全身状况，术区伤口是否合并膝关节肿胀畸形、窦道流脓等。

炎性指标检测：术后1周，于各组兔股静脉处抽血，让其自然凝结，分离血清，检测C-反应蛋白与白细胞水平。

骨软骨缺损处大体与组织学观察：术后4，8，12周，每组随机选取5只兔，耳缘静脉注入空气处死兔，逐层分离股骨远端获取术区组织，进行大体形态观察及软骨修复ICRS评分(表1)，由 2名熟悉软骨修复ICRS评分的创伤骨科高年资医师进行评分，最低分0分，最高分16分，评分结果越低表明软骨修复越差；充分固定后、脱钙、包埋、切片后，分别进行Masson、阿利新蓝、苏木精-伊红、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色与Wakitani病理评分(表2)。

1.5 主要观察指标 VANCO缓释微球丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石支架的物理性能与修复感染性股软骨缺损的效果。
1.6 统计学分析采用 SPSS 20.0、GraphPad Prism 9.5.0软件进行统计学分析，所有计量资料以x±s表示，两组间独立样本比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经遵义医科大学生物统计学专家审核。

讨论

骨软骨主要存在于人体关节和骨骼表面，由关节软骨成分和较深的软骨下骨成分组成[26]。软骨层主要由细胞外基质、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖组成[27]；软骨下骨由羟基磷灰石和Ⅰ型胶原蛋白组成[28- 29]，有较强的硬度和刚度[30]。骨软骨单元不仅能承受相对重的负荷和应力[31]，还能够有效缓冲关节和骨骼之间的力量，保持骨骼和关节运动的稳定性和灵活性。目前针对骨软骨缺损的治疗方式主要与缺损的形状、位置和大小相关[32]，常用手术方式有关节镜下病灶微骨折术[33]、骨软骨移植术等，后期甚至考虑行关节置换术[27，34]。前期研究已经证明，直径和深度超过3 mm的兔骨软骨缺损模型将不能自行愈合，所以实验兔关节软骨缺损的直径和深度都超过3 mm，结果显示空白组术后12周骨软骨缺损未完全愈合[35-37]。
金黄色葡萄球菌是引起骨软骨损伤合并感染的主要致病菌[38]，而VANCO是此类感染治疗首选抗生素之一。近年来，针对骨软骨损伤并感染的治疗手段不断更新，主要有外科治疗、抗生素治疗、生物组织工程技术、细菌生物膜覆盖保护治疗等；但除外科干预外，抗生素仍是首选治疗方法。研究表明，VANCO缓释微球支架可以达到药物缓慢释放及降低突释率的目的，提高局部药物浓度[23]，在牙周炎[39]、骨缺损合并感染等治疗中效果良好[40]。相对全身用药，局部应用载药微球可使病灶血药浓度升高200倍[41]；载药微球可在缺损处持续释放抗生素；全身毒副作用小，可避免静脉长期大剂量或口服抗生素造成的肝肾损害和肠道菌群失调；另外，局部填充载药缓释微球支架同时可以填补局部骨缺损，协同抗生素缓释微球治疗能更好地促进骨修复[42]。
聚乳酸-羟基乙酸聚合物是现目前广泛应用于临床的一种新型缓释药物载体，该材料制备的缓释微球生物相容性、生物利用度及可降解性等指标均较理想[43]。此次实验采用水/油/水复乳溶剂挥发法制备VANCO缓释微球的粒径为(21.45±6.09) μm，载药率为(23.86±1.35)%，包封率为(46.21±11.78)%，相比刘华蔚[44]制备的缓释微球相比上述指标更加优良。
骨软骨组织工程支架已成为修复骨软骨损伤、骨缺损的热点[45-46]。既往研究已证实，孔隙率越大、孔间越高度相通，越有利于组织细胞的修复[47]；大孔径支架可以为细胞的增殖、生长及分化提供一个良好的的空间，研究证实支架孔径在100-300 μm之间最合适细胞的生长[48]。膨胀率高预示支架能迅速膨胀填充软骨缺损区，为组织细胞提供生长场所[49]。考虑到骨软骨缺损到完全修复的时间，理论上植入的支架在体内存留时间至少需要达到48周以上[50-51]。此次实验实验制备的载VANCO缓释微球支架与向柄彦等[52]制备的载VANCO缓释微球支架药物释放曲线程度基本一致，尽管增加载药微球量可以提高支架的药物释放效果，但是过量的载药微球会导致支架孔隙率下降，而孔隙率是影响支架中药物释放效果的重要因素。只有适当的孔隙率和孔径，才能使药物在支架中充分释放，从而为细胞的生长、繁殖和分化以及血管新生提供更好的空间和环境。此次实验支架中加VANCO缓释微球10 mg制备的支架2最符合细胞生长需求。
LI等[53]在感染性骨缺损的研究中发现，VANCO支架在抗金黄色葡萄球菌中起重要作用。马涛等[54]研究进一步证实VANCO支架可通过抑制、破坏金黄色葡萄球菌生物膜达到抗菌作用。此次实验大体观察发现相较于实验组，空白组、对照组兔关节畸形肿胀明显，部分术区窦道流脓，甚至术后8周可在远离术区部位形成脓肿。此次实验结果显示，空白组、对照组术后1周C-反应蛋白及白细胞数等炎性反应指标较实验组明显升高，与冯建波等[55]的实验对照组、普通支架组炎性指标较抗生素支架组明显升高相符。感染是开放性骨软骨损伤不愈合的关键因素，有效控制感染是这类骨折愈合的前提和关键。此次实验病理形态观察结果证实，VANCO支架植入到体内能够更好地促进关节骨软骨缺损的修复。此次实验评估的软骨修复ICRS评分较唐洪[56]制备的自体软骨微粒复合仿生凝胶修复局灶性关节软骨缺损研究中的ICRS评分差，可能与此次实验为感染性骨缺损模型有关。
综上所述，实验结果显示，载VANCO缓释微球支架植入到兔感染性关节面骨软骨缺损区能促进局部感染的控制及关节骨软骨缺损的修复。抗感染骨软骨组织工程支架有望成为临床上开放性关节骨软骨缺损治疗的新方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

缓释万古霉素三维支架修复兔感染性骨软骨缺损

Repair of infected osteochondral defect with sustained release vancomycin three-dimensional scaffold in rabbits

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