纳米晶仿生钙磷颗粒的理化性质及细胞相容性

doi:10.12307/2024.487

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (22): 3502-3508.doi: 10.12307/2024.487

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纳米晶仿生钙磷颗粒的理化性质及细胞相容性

陈明学1，牛建华2，林海燕3，吴刚3，万奔1，3，4

1首都医科大学附属北京积水潭医院，北京市 100035；2上海市黄浦区牙病防治所，上海市 200020；3杭州医学院，浙江省杭州市 310059；4杭州彗搏科技有限公司，浙江省杭州市 311217

收稿日期:2023-07-05 接受日期:2023-09-25 出版日期:2024-08-08 发布日期:2024-01-20
通讯作者: 万奔，医疗器械研发工程师，首都医科大学附属北京积水潭医院，北京市 100035；杭州医学院，浙江省杭州市 310059；杭州彗搏科技有限公司，浙江省杭州市 311217
作者简介:陈明学，男，1992年生，海南省文昌市人，汉族，博士，医师，主要从事组织工程研究。牛建华，女，1982年生，上海市人，汉族，医师，主要从事基础医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金项目(82202784)：3D打印多孔钛金属笼促进早期股骨头坏死修复的实验研究，项目负责人：陈明学；浙江省重点研发计划项目(2021C04013)：国际合作技术研发与示范推广项目-高效骨引导/诱导骨修复颗粒的研发，项目负责人：吴刚；浙江省“领雁”研发攻关计划项目(2022C03G1363463)，口腔疾病诊治新技术研究-高效除菌和诱导骨再生的植体周炎治疗新技术研发与转化应用，项目负责人：林海燕

Physicochemical properties and cytocompatibility of biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules

Chen Mingxue1, Niu Jianhua2, Lin Haiyan3, Wu Gang3, Wan Ben1, 3, 4

1Beijing Jishuitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100035, China; 2Shanghai Huangpu District Dental Disease Prevention and Control Institute, Shanghai 200020, China; 3Hangzhou Medical College, Hangzhou 310059, Zhejiang Province, China; 4Hangzhou Huibo Science and Technology Co., Ltd., Hangzhou 311217, Zhejiang Province, China

Received:2023-07-05 Accepted:2023-09-25 Online:2024-08-08 Published:2024-01-20
Contact: Wan Ben, Beijing Jishuitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100035, China; Hangzhou Medical College, Hangzhou 310059, Zhejiang Province, China; Hangzhou Huibo Science and Technology Co., Ltd., Hangzhou 311217, Zhejiang Province, China
About author:Chen Mingxue, MD, Physician, Beijing Jishuitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100035, China Niu Jianhua, Physician, Shanghai Huangpu District Dental Disease Prevention and Control Institute, Shanghai 200020, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (Youth Science Foundation Project), No. 82202784 (to CMX); Key Research & Development Plan Project in Zhejiang Province, No. 2021C04013 (to WG); Zhejiang Province “Leading Wild Goose” Research & Development Project, No. 2022C03G1363463 (to LHY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

仿生钙磷颗粒：指利用仿生技术合成的具有与骨组织相似结构和性能的钙磷颗粒，用于骨缺损修复。
理化表征：指用物理或化学方法对物质进行化学性质的分析、测试或鉴定，并阐明物质的化学特性。理化表征可以分为微观形貌表征、物相分析、热性能分析、成分分析与力学性能测试等。

背景：临床上人工合成的羟基磷灰石陶瓷颗粒被广泛用于修复大体积骨缺损，但制备过程中的高温烧结会降低羟基磷灰石陶瓷颗粒的可降解性和生物活性，限制其骨修复效果。

目的：采用新型低温沉积技术制备纳米晶仿生钙磷颗粒，表征其理化性能与细胞相容性。
方法：采用改良后的过饱和钙磷矿化液和重复静置重悬洗涤方式制备纳米晶仿生钙磷颗粒，以羟基磷灰石生物陶瓷颗粒为对照，通过扫描电镜、X射线衍射仪、傅里叶变换红外光谱仪表征两种颗粒的形貌和物相组成，通过BET-N2法、硬度和接触角测试表征两种颗粒的比表面积、孔隙度分布、硬度和亲水性行为，利用BCA法检测两种颗粒对牛血清白蛋白和胎牛血清蛋白的吸附性能。将两种颗粒或颗粒浸提液分别与人脐带间充质干细胞共培养，采用MTT法检测细胞增殖。

结果与结论：①扫描电镜显示两种颗粒表面略微粗糙并伴有微小颗粒存在，羟基磷灰石生物陶瓷颗粒表面致密光滑，纳米晶仿生钙磷颗粒主要由不均匀纳米尺寸的针/板状晶体组成，并在晶体之间形成纳米孔结构。X射线衍射、傅里叶变换红外光谱显示，相较于羟基磷灰石生物陶瓷颗粒，纳米晶仿生钙磷颗粒的结晶粒小、结晶度低，含有更多的结合水和碳酸根基团。与羟基磷灰石生物陶瓷颗粒相比，纳米晶仿生钙磷颗粒具有更高的比表面积、更好的亲水性、更低的硬度与更高的蛋白吸附能力。②MTT检测结果显示，两种颗粒浸提液基本无细胞毒性，人脐带间充质干细胞在两种颗粒表面存活良好，并且纳米晶仿生钙磷颗粒表面的细胞增殖活性更强。③结果表明与羟基磷灰石生物陶瓷颗粒相比，纳米晶仿生钙磷颗粒具有更好的理化性能与细胞相容性。

https://orcid.org/0000-0001-9689-7286(陈明学)；https://orcid.org/0009-0002-5774-701X(牛建华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 纳米晶仿生钙磷颗粒, 羟基磷灰石, 骨再生修复, 生物相容性, 蛋白吸附, 人脐带间充质干细胞

Abstract: BACKGROUND: Artificially synthesized hydroxyapatite ceramic granules are widely used in clinical practice to repair large-volume bone defects. However, the osteogenic effect of hydroxyapatite ceramic granules prepared by high-temperature sintering is limited by their low degradability and bioactivity.
OBJECTIVE: To prepare biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules by a novel low-temperature deposition technique, and to characterize their physicochemical properties and cytocompatibility.
METHODS: Biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules were prepared using a modified supersaturated calcium phosphate mineralization solution and a repeated settling and decantation washing method. Hydroxyapatite bioceramic granules were used as the control. The morphology and phase composition of the granules were characterized by scanning electron microscopy, X-ray diffraction, and Fourier transform infrared spectroscopy. The specific surface area, porosity distribution, hardness and hydrophilicity of the granules were characterized by BET-N2 method, hardness test, and contact angle test. The adsorption properties of the granules for bovine serum albumin and fetal bovine serum protein were determined by bicinchoninic acid assay. The two kinds of granules or granule extracts were co-cultured with human umbilical cord mesenchymal stem cells, and the cell proliferation was detected by MTT assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that the surface of the two kinds of particles was slightly rough and accompanied by tiny particles, the surface of the hydroxyapatite bioceramic particles was dense and smooth, and the biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules were mainly composed of needle/plate crystals with non-uniform nanometer size, and formed a nanopore structure between the crystals. X-ray diffraction and Fourier transform infrared spectroscopy exhibited that compared with hydroxyapatite bioceramic granules, biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules had smaller crystalline particles, lower crystallinity, and more binding water and carbonic acid groups. Compared with hydroxyapatite bioceramic granules, biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules had higher specific surface area, better hydrophilicity, lower hardness, and higher protein adsorption capacity. (2) The results of MTT assay showed that the two kinds of granule extracts had no cytotoxicity, human umbilical cord mesenchymal stem cells survived well on the surface of the two kinds of granules, and the biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules had stronger cell proliferation activity. (3) These findings indicate that compared with hydroxyapatite bioceramic granules, biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules have better physicochemical properties and cytocompatibility.

Key words: biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granule, hydroxyapatite, bone regeneration and repair, biocompatibility, protein adsorption, human umbilical cord mesenchymal stem cell

中图分类号:

陈明学, 牛建华, 林海燕, 吴刚, 万奔. 纳米晶仿生钙磷颗粒的理化性质及细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(22): 3502-3508.

Chen Mingxue, Niu Jianhua, Lin Haiyan, Wu Gang, Wan Ben. Physicochemical properties and cytocompatibility of biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(22): 3502-3508.

图/表（结果） 9

2.1 两种颗粒的形貌从宏观上看，BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒均为不规则的颗粒状，而羟基磷灰石陶瓷颗粒具有一些大孔，这些孔是由双氧水发泡造孔而形成的[20]。
低倍率(×500)的扫描电镜图像显示，BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒都具有略微粗糙的表面形态，并伴有微小颗粒存在；高倍率(×20 000)扫描电镜图像显示，羟基磷灰石陶瓷颗粒显示致密光滑的表面，BpNcCaP颗粒主要由不均匀纳米尺寸的针/板状晶体组成，并在晶体之间形成纳米孔结构，见图1。高倍率下，使用Image J软件测量颗粒表面晶体尺寸，BpNcCaP颗粒的平均晶粒为(116.9±27.13) nm，羟基磷灰石陶瓷颗粒的平均晶粒(655.6±256.6) nm，组间比较差异有显著性意义(P < 0.000 1)。结果表明高温处理会让颗粒表面结构发生显著改变，高温烧结破坏了羟基磷灰石陶瓷颗粒表面的纳米结构，而低温沉积的BpNcCaP颗粒保留有微纳米孔隙。

2.2 两种颗粒的X射线衍射分析结果为了确定两种颗粒的物相组成和结晶度，对BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒进行了X射线衍射分析(图2)。BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒的衍射峰位置分别出现在25.96°，29.09°，31.90°，32.22°，33.90°，39.55°，46.58°，49.23°，53.29°和64.06°附近，这些峰对应于羟基磷灰石的特征晶面(002)(210)(211)(112)(202)(130)(222)(213)(004)和(510)，所测试衍射峰的位置与ICSD数据库中羟基磷灰石标准PDF卡(09-0432)基本相符，无多余的杂相出现。羟基磷灰石陶瓷经过高温烧结，X射线衍射特征峰更加尖锐、峰强度高，显示出高结晶度和晶粒尺寸大，而BpNcCaP颗粒的X射线衍射特征峰宽大、峰强度低，显示颗粒结晶粒度小、结晶度低。X射线衍物相分析显示BpNcCaP颗粒的物相成分是羟基磷灰石，非煅烧的BpNcCaP颗粒结晶度更低，有助于材料在体内降解。

2.3 两种颗粒的傅里叶变换红外光谱分析结果为了研究两种颗粒化学官能结构的差异，进行了傅里叶变换红外光谱分析。如图3所示，BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒均在3 573 cm-1波长处出现羟基吸收峰，PO43-的吸收峰在1 090，1 047，959，601和571 cm-1附近，符合羟基磷灰石化学基团特征。BpNcCaP颗粒在波长632 cm-1处缺少羟基吸收峰，在1 033 cm-1和564 cm-1出现P-O基团的伸缩振动峰，并且与羟基磷灰石陶瓷颗粒相比峰型宽大、圆钝。图中1 630 cm-1与3 432 cm-1处是H2O的特征吸收峰，1 457 cm-1和1 419 cm-1为CO32-的特征吸收峰。这些结果显示BpNcCaP与羟基磷灰石陶瓷颗粒具有类似的官能基团，并且BpNcCaP颗粒较羟基磷灰石陶瓷颗粒保留有更多结合水和碳酸根基团。

2.4 两种颗粒的维式硬度分析结果为了研究不同热处理过程对颗粒机械硬度的影响，对两组颗粒表面施加了一定的载荷，拍摄了一组压痕照片，并统计出他们的维氏硬度。两种颗粒表面的压痕都呈现出类似的方形轮廓，但是其每个压痕的对角线长度在高分辨率图片中有明显差别。BpNcCaP颗粒的维氏硬度为(28.86±4.54) HV，显著低于羟基磷灰石陶瓷颗粒的维氏硬度(632.0±67.82) HV (P < 0.0001)，见图4。

2.5 两种颗粒的比表面积和孔容分布图5显示了BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒的氮气吸脱附曲线和不同孔径对孔容贡献的分布曲线。如两种颗粒的氮气吸脱附曲线所示，BpNcCaP颗粒的相对压力(P/P0)在0.70-1范围内，羟基磷灰石陶瓷颗粒的P/P0在0.94-1.0范围内，氮气的吸脱附曲线呈闭环，说明两种颗粒中存在不规则的介孔。此外，在不同P/P0下，BpNcCaP颗粒的吸脱氮气体量明显多于羟基磷灰石陶瓷颗粒。这些结果表明相比于羟基磷灰石陶瓷颗粒，BpNcCaP颗粒拥有更丰富的微孔结构。BpNcCaP颗粒的孔容增量分布曲线呈现出2个峰值，一个在约1.3 nm处，另一个在约21.7 nm处，这两种尺寸的孔隙对孔容的贡献最大。结果表明BpNcCaP颗粒的孔隙结构主要以纳米孔为主。羟基磷灰石陶瓷颗粒的孔隙度分布曲线呈现出多峰，主要为100 nm以上的孔为主(117.23，147.6 nm)，而一些更小的纳米孔隙(1.59，2.16，4.32，9.31，13.67，23.39 nm)对颗粒整体孔容积的贡献小。使用BET模型可分别计算得出BpNcCaP颗粒比表面积为110.026 8 m2/g，羟基磷灰石陶瓷颗粒的比表面积为0.290 6 m2/g。结果显示具有微纳米表面的BpNcCaP颗粒比表面积更高，可以为蛋白吸附提供更多的吸附位点，可以作为生物活性因子的缓释载体。

2.6 两种颗粒的蛋白吸附能力比较如图6所示，采用BCA法测量了两种颗粒对牛血清白蛋白和胎牛血清的吸附能力。首先，将两种颗粒与牛血清白蛋白溶液孵育2 h，检测孵育液中残余的牛血清白蛋白，结果显示BpNcCaP颗粒组未被吸附的蛋白量显著少于羟基磷灰石陶瓷颗粒组[(0.81±0.03)，(0.89±0.03) mg/mL]，表明BpNcCaP颗粒比HAP陶瓷颗粒吸附蛋白更加快速。另一方面，采用完全培养基对两种颗粒进行孵育，4 d后利用表面活性剂对颗粒表面黏附的蛋白进行洗脱定量检测，BpNcCaP颗粒的洗脱液中蛋白量比羟基磷灰石陶瓷颗粒更多[(0.36±0.03)，(0.19±0.04) mg/mL]。结果显示BpNcCaP颗粒吸附蛋白的能力更强，有助于植入后细胞早期攀爬、长入。

2.7 两种颗粒的亲水性比较亲水性是影响骨移植物生物活性的重要因素之一，亲水性越高，骨移植物与体液、血液、蛋白质和生长因子的相互作用越强，从而促进细胞附着、增殖和分化。接触角是评价材料亲水性的常用参数，接触角越小材料亲水性越强。图7显示了BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒的接触角测量结果，BpNcCaP颗粒的接触角显著小于羟基磷灰石陶瓷颗粒[(14.11±1.68)°，(50.99±1.57)°]。结果表明，BpNcCaP颗粒具有比羟基磷灰石陶瓷颗粒更好的亲水润湿性，更方便材料植入操作。

2.8 两种颗粒的细胞相容性图8A是按照国标GB/T16886实验标准进行的细胞毒性实验，采用浸提液的方法，与人脐带间充质干细胞进行间接培养。阴性对照组的细胞相对增殖率为1，明显高于两实验组。BpNcCaP颗粒组的细胞相对增殖率(0.730 2±0.036 9)低于羟基磷灰石陶瓷颗粒组(0.951 3±0.048 8)，但都高于阳性对照组(0.164 3±0.033 7)，两实验组的细胞相对增殖率均大于70%，表明颗粒浸提液基本无细胞毒性。图8B相差显微镜观察结果显示，阳性对照细胞皱缩成球，大部分细胞脱离培养皿底部，而BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒组细胞形态与阴性对照组类似，未见明显变化，呈现出梭形贴壁生长。

图9A是两种颗粒分别与人脐带间充质干细胞共培养后的细胞增殖情况。共培养第1天，两组吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；共培养第4，7天，BpNcCaP颗粒组吸光度值高于羟基磷灰石陶瓷颗粒组(P < 0.05)，说明BpNcCaP颗粒对细胞增殖的抑制作用较小。图9B为共培养第4天的相差显微镜观察结果，两组颗粒周围均围绕着呈梭形生长、分层分布的人脐带间充质干细胞，显示出良好的细胞相容性。结果表明，BpNcCaP颗粒无潜在的细胞毒性，对细胞增殖无明显抑制作用。

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引言

大体积骨组织缺损修复是医学中尚未攻克的重大难题之一[1]。钙磷类骨充填材料的化学成分与天然骨相似，能够提供稳定的机械力微环境支撑骨组织再生，成为应用最为广泛的骨修复材料[2]。根据材料来源，骨移植材料可以分为自体骨、同种异体骨、异种异体骨和人工合成材料[3]。自体骨不仅有引导骨再生的钙磷支架，还富含骨诱导作用的生长因子和成骨细胞，因此一直被认为是骨缺损修复的“金标准”[4]。然而自体骨也存在一些缺点，如可供移植的自体骨有限、供体部位疼痛和吸收速率不可预测等。同种异体骨是经过去抗原化处理的人类骨组织，骨引导性良好，但是材料来源受限、免疫反应、伦理或宗教问题阻碍了其广泛运用[4]。异种异体骨取材于动物骨组织，材料供应量丰富，如临床上广泛使用的小牛松质骨、Bio-Oss®骨粉[5]。异种异体骨的生产涉及初始去蛋白、脱脂肪、脱细胞过程，需要在300 ℃甚至1 250 ℃下烧结以去除大部分有机相，从而降低异种异体骨的免疫原性、提高其生物相容性[6]，这样的烧结过程也显著增大了钙磷晶体的结晶度和晶粒尺寸，导致其降解性显著降低[7]。有研究显示，Bio-Oss®植入8个月后在体内仍保留约70%体积，即使在植入10年后仍可观察到Bio-Oss®残留在植骨部位[8]。免疫原性风险、材料可获得性、降解缓慢以及生产成本高都限制了异种骨移植材料的进一步发展。
与天然来源的钙磷材料相比，人工合成的钙磷类骨修复材料大多具有良好的生物相容性与骨引导性能、材料来源广泛、无疾病传播等隐患等特点[9]。人工合成的钙磷类骨修复材料主要有羟基磷灰石、磷酸三钙、羟基磷灰石/磷酸三钙复合而成的双相磷酸钙3种，它们中的一种或多种可以与聚合物进行复合，以提高材料的机械强度、生物相容性、降解性[10]。此外，钙磷类骨修复材料可作为药物的缓释载体用于局部给药，在抗感染、抗肿瘤、促进成骨方面作用明显[10]。不同形式的钙磷类材料被广泛用于多种医疗器械中，包括：人工骨修复颗粒、可注射自固化骨水泥、种植体、接骨钉、人工髋关节表面涂层、人工义眼台等[2，11]。其中大部分医用羟基磷灰石为陶瓷材料，主要制备过程是通过各种湿化学沉淀法合成磷灰石粉末前体，在600-1 300 ℃下烧结制备[12]，在此过程中，高温煅烧会使羟基磷灰石粉末熔接成块，尺寸和结晶度显著增加，因而抗压强度也急剧增加，导致脆性增加、降解速度缓慢[13]。
目前的钙磷类骨填充材料，无论是动物骨、人尸体骨来源还是人工合成的，大部分需要300-1 300 ℃的高温烧结，这种材料降解极为缓慢、骨替代程度低，无法作为生物活性因子的缓释载体，因此，迫切需要开发一种具有更高降解性和更低硬度的钙磷类骨填充材料。前期研究利用仿生矿化溶液制备了一种钙磷涂层，可以高效携带骨形态发生蛋白2诱导成骨；最近，使用过饱和钙磷涂层溶液成功制备了一种钙磷颗粒，具有适当的降解性和类似松质骨的硬度[14-15]。然而，这种钙磷颗粒中含有一些不必要的杂质，如三羟甲基氨基甲烷和氯化钠，可能会降低颗粒的生物相容性。为了解决这个问题，作者增加了一个多次离心洗涤步骤，以最大限度地减少其他化学杂质的含量，提高钙磷颗粒的生物相容性[16]。与其他临床可用的钙磷类骨填充材料相比，作者前期提出制备钙磷颗粒的仿生制备条件：反应条件温和；无需额外热处理；不添加额外化学成分，如模板剂、造孔剂、表面活性剂[17]。
为了制备更高活性的仿生钙磷颗粒、适应医疗器械规模化生产需要，此次实验改用静置重悬洗涤法进行钙磷反应后处理，合成了新型低温沉积制备的纳米晶仿生钙磷(biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate，BpNcCaP)颗粒。为了表征新型BpNcCaP颗粒的理化性质和生物活性，使用羟基磷灰石生物陶瓷作为对照样品，对比两种颗粒的形貌和组成、表面积、孔隙度分布、亲水性和硬度以及细胞相容性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备和表征，体外细胞实验，非配对t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2023年6月在北京积水潭医院完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞与试剂人脐带间充质干细胞(国家干细胞转化资源库)；羟基磷灰石生物陶瓷(四川拜阿蒙生物活性材料有限责任公司，规格：HA/P 0312)；a-MEM完全培养基(MeilunBio，中国)；胎牛血清和青霉素/链霉素双抗(Gibco，美国)；MTT试剂、二甲亚砜(Sigama，美国)；异丙醇(阿拉丁，中国)；BCA试剂盒(Thermo Scientific，美国)；牛血清白蛋白(碧云天，中国)；磷酸氢二钠(成都华邑药用辅料制造有限责任公司)；盐酸(南京试剂)；氯化钠(江苏省勤奋药业有限公司)；二水氯化钙(湖南新绿方药业有限公司)；三羟基甲基氨基甲烷(江苏汉斯通药业有限公司)。
1.3.2 主要仪器扫描电子显微镜(Zeiss Sigma 300，德国)；X射线衍射仪(Ultima IV，日本)；红外光谱仪(Nicolet iS20，美国)；维氏硬度计(Falcon 507，荷兰)；全自动比表面积及孔隙度分析仪(ASAP2460， Micromeritics，美国)；接触角测量仪(JY-82B Kruss DSA，德国)；酶标仪(Bio-Tek Instruments，美国)。
1.4 方法
1.4.1 BpNcCaP颗粒的制备采用新型低温沉积技术制备BpNcCaP颗粒。首先制备5倍过饱和钙磷溶液(20 mmol/L CaCl2、680 mmol/L NaCl、10 mmol/L Na2HPO4和250 mmol/L Tris、200 mmol/L HCl)，调节至pH=7.4。随后，将反应液置于反应釜中以30-50 r/min持续搅拌，保持37 ℃孵育24 h。反应液静置1 h，去除反应上清液，注入去离子水重悬反应液，反复静置重悬洗涤8遍。将洗涤好的沉淀物10 000 r/min离心30-60 min，去除水分。取离心后的浆料平铺在超净工作台上，室温风干。沉淀物硬化成块后，通过研磨、过筛，制备粒径在0.25-1 mm的颗粒。
1.4.2 BpNcCaP颗粒理化性质表征
扫描电镜：将BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒分别固定在扫描电镜样品台上，喷金制样，扫描电镜下观察颗粒的形貌。每种颗粒分别在4个放大倍数(50，500，20 000和50 000倍)下拍摄照片。利用Image J软件统计分析颗粒表面的晶粒尺寸。
X射线衍射图谱：利用X射线衍射仪(Cu Kα射线，40 kV，30 mA)鉴定和分析BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒的物相组成。X射线衍射图谱采集2θ值的范围为10°-80°，扫描速度为2 (°)/min。
傅里叶变换红外光谱：利用傅里叶变换红外光谱仪测定BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒的官能团。采用与KBr混匀压片制样，每个光谱收集32次扫描，扫描范围为400-4 000 cm−1，分辨率为4 cm−1。
维式硬度：采用显微维氏硬度计测量颗粒硬度。将BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒镶嵌，抛光表面后施加0.25 N的载荷，并保持10 s。
比表面积及孔隙度：BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒的比表面积通过氮气吸附-脱附等温线法测量，使用Brunauer-Emmett-Teller (BET)系统。BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒在200 ℃下脱气8 h后进行N2吸附测量。
接触角测试：对BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒压片制样。使用自动滴定法，在BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒的平坦片上分别滴加18 μL去离子水，通过相机/软件测量得到初接触角。每个样品测量6次，计算平均接触角。
蛋白吸附能力检测：①颗粒表面吸附胎牛血清的能力：将BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒分别浸泡于a-MEM完全培养基中，浸提比例为0.1 g/mL，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内孵育4 d。吸除上清液，用PBS洗涤5次，随后每个样品加入0.5 mL 1%Triton溶液洗脱[18]。对照组设置为1%Triton溶液。10 000 r/min离心5 min，取上清液，用BCA测定试剂盒测定溶液中的蛋白质含量，并用酶标仪在620 nm处测定吸光度值。②颗粒表面吸附牛血清白蛋白的能力：称取0.1 g颗粒于EP管中，加入1 mL牛血清白蛋白溶液(1 mg/mL)，混匀后37 ℃水浴孵育2 h[19]，以不加颗粒孵育的牛血清白蛋白溶液为对照组。10 000 r/min离心5 min，取上清液，用BCA测定试剂盒测定溶液中的蛋白质含量，并用酶标仪在620 nm处测定吸光度值。
1.4.3 BpNcCaP颗粒的细胞相容性评估当人脐带间充质干细胞融合度达到80%左右时，按照1∶3-1∶5的比例进行传代，实验所用细胞为3-8代。
颗粒浸提液与细胞共培养：将BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷颗粒分别浸泡于无血清a-MEM培养基中，浸提比例为0.2 g/mL，37 ℃下浸提24 h。将人脐带间充质干细胞接种于96孔板中，细胞接种密度104/孔，分4组培养：两实验组加入含体积分数10%胎牛血清的对应颗粒浸提液100 µL，阴性对照组加入a-MEM完全培养基100 µL，阳性对照组加入含5%二甲亚砜的a-MEM完全培养基100 µL。孵育24 h后去除培养上清液，将50 μL MTT溶液(1 mg/mL )添加到每孔中，37 ℃下孵育2 h，通过酶标仪在570 nm波长下测量吸光度值。细胞相对增殖率=实验组吸光度值/阴性对照组平均吸光度值×100%。
颗粒与细胞直接接触共培养：接种细胞前，将BpNcCaP和羟基磷灰石陶瓷置于a-MEM完全培养基(37 ℃)浸泡24 h。
将人脐带间充质干细胞分别接种到放有两种颗粒的48孔板中，细胞密度为3×104/孔，每种颗粒与培养基的比例为10 mg/mL。每隔3 d更换培养基一次。培养第1，4，7天，吸弃培养基，加入1 mg/mL MTT溶液孵育2 h，加入300 µL异丙醇洗脱，置于摇床上轻轻摇晃30 min，直至蓝紫色结晶完全溶解；取100 µL上清液，通过酶标仪在570 nm波长下测定吸光度值。
1.5 主要观察指标两组颗粒的理化性能以及对人脐带间充质干细胞增殖的影响。
1.6 统计学分析所有数据均以x±s表示。利用SPSS 22.0软件进行统计学分析，使用非配对t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经由首都医科大学附属北京积水潭医院生物统计学专家审核。

讨论

此次实验优化了前期BpNcCaP颗粒的生产制备步骤[15]，制备工艺主要区别在于：采用了静置重悬洗涤方式，清洗液由PBS更换成纯水，减少了真空抽滤步骤。目前临床上应用的羟基磷灰石骨修复材料主要以高温煅烧制备工艺为主，比如以脱细胞牛松质骨为代表的异种骨移植物和羟基磷灰石陶瓷颗粒为代表的人工骨。BpNcCaP颗粒是一种采用非烧结方式制备的人工骨修复材料，其制备方式是依靠钙磷反应液中纳米钙磷晶体的高比表面能，溶液中的纳米粒子相互吸引、团聚、沉积成块，经过研磨、筛选制备的骨填充修复材料。此次实验的对照材料为羟基磷灰石陶瓷颗粒，采用湿化学法合成前体粉末，H2O2发泡、1 050 ℃煅烧2 h制备而成[20]。由于制备工艺不同，两种颗粒的表面结构差异主要体现在微纳米结构上，BpNcCaP颗粒表面具有更小、更均匀的针状或片状晶体，而羟基磷灰石陶瓷颗粒是融接形成较大晶粒。这些结果与采用牛松质骨制备的羟基磷灰石材料类似，比如Bio-Oss®骨粉颗粒，具有部分天然松质骨结构，低倍镜下呈现出纤维质纹理，高倍镜下由纳米级晶体组成[6，21]。X射线衍射显示两种颗粒物相组成均为羟基磷灰石，但是BpNcCaP颗粒的结晶度更低、晶体尺寸更小，这与扫描电镜所显示的颗粒晶体外貌相符。SCALERA等[13]的研究表明，随着烧结温度(600，700，800，900 ℃)的提高，羟基磷灰石粉末晶体尺寸逐渐增加，X射线衍射中(211)(112)晶面衍射峰逐渐锐化、分离。X射线衍射图中BpNcCaP颗粒在(211)(112)两处晶面衍射峰融合在一起，这可能是因为BpNcCaP未经过高温热处理。ŚLÓSARCZYK等[22]研究表明，煅烧温度在800 ℃时，掺杂有碳酸根的羟基磷灰石在1 380-1 580 cm-1处的碳酸根特征吸收峰消失，提示羟基磷灰石中的碳酸根分解；此外，630 cm-1附近的羟基基团特征峰在400 ℃消失，而在800 ℃热处理后出现，提示羟基基团含量增多，结晶完整。傅里叶红外光谱结果显示，BpNcCaP颗粒保留有碳酸根的吸收峰(1 457 cm-1和1 419 cm-1)和结合水的吸收峰(1 630 cm-1与3 439 cm-1)，缺少632 cm-1羟基基团特征峰，表明羟基磷灰石陶瓷颗粒中结合的水、碳酸根相比BpNcCaP颗粒少，这可能是因为高温导致晶体结合水蒸发、碳酸根在高温下分解[23]。
理想的骨植入材料应该和天然骨硬度类似，从而避免在骨重塑过程中高硬度植骨材料的应力遮挡效应[22]。DALL’ARA等[24]对比3种人松质骨硬度测试方法，最接近人松质骨硬度的测量方法是湿法测量，测得松质骨骨块硬度为(32.9±6.6) HV。这个结果与此次实验BpNcCaP颗粒所测结果接近(28.86±4.54) HV，表明BpNcCaP颗粒具有与人松质骨类似的硬度。而羟基磷灰石陶瓷硬度是BpNcCaP颗粒的21.9倍，远远高于人松质骨硬度。ZHU等[25]研究了烧结温度对羟基磷灰石陶瓷硬度的影响，结果显示硬度值随烧结温度增加而逐渐增加。羟基磷灰石陶瓷的高硬度、高脆性远超正常人骨硬度，这可能与高温烧结处理有关。这些结果表明，BpNcCaP颗粒的机械硬度可能比羟基磷灰石陶瓷颗粒更适合骨愈合后期重塑过程。
更大的比表面积意味着材料有更多的有效官能团和吸附点位，这使得它们能够更有效地与外界物质进行交换，比如吸附血液中更多的蛋白质，从而促进细胞早期黏附[20]。人工合成的纳米羟基磷灰石具有高比表面积特征。XU等[26]采用湿化学法制备了不同外貌形态和尺寸的羟基磷灰石纳米颗粒，比表面积148.140-45.002 m2/g不等。此外，PATEL等[27]的研究结果证明，羟基磷灰石粉末制备温度从400 ℃提升到1 000 ℃，比表面积从70-80 m2/g下降至(5±7) m2/g。
此次实验结果表明，BpNcCaP颗粒保留有纳米羟基磷灰石颗粒的高比表面积特性[28]，甚至高于羟基磷灰石陶瓷颗粒与其他骨修复材料，例如异种骨植入物Bio-Oss®的比表面积为84.94 m2/g[21]，β-磷酸三钙的比表面积为0.36-1.85 m2/g[18]，生物活性玻璃的比表面积为1.375 5-1.904 7 m2/g[29]，双磷酸钙的比表面积为1.42-2.93 m2/g[18]。此次实验扫描电镜下可见BpNcCaP由针状纳米羟基磷灰石沉积，形成了不均匀分布的微纳米表面。BpNcCaP颗粒表面晶体之间形成大量纳米介孔(直径主要分布在100 nm以内)，而羟基磷灰石陶瓷表面主要以宏孔为主。
当骨粉颗粒接触到含有蛋白质的溶液(如血液或组织液)时，溶液中的蛋白质会快速地吸附在材料界面上，细胞正是通过包裹的蛋白质层来感知和响应外来植入物，因此蛋白吸附能力对材料的生物活性至关重要。其中，羟基磷灰石颗粒的表面形貌、孔径分布、表面电荷和电势、比表面积、亲疏水性等性质是影响蛋白吸附的重要因素[30-31]。此次实验结果表明，BpNcCaP颗粒比羟基磷灰石陶瓷颗粒拥有更快、更强的蛋白吸附能力，这可能和BpNcCaP具有上述多种理化性质有关。为进一步评估两种颗粒的的安全性和生物相容性，后续将人脐带间充质干细胞分别与颗粒浸提液和颗粒本身共培养。KLIMEK等[32]的研究表明，高比表面积(50 m2/g)羟基磷灰石陶瓷颗粒组的hFOB 1.19细胞活力低于70%，向浸提液中补足Ca2+、Mg 2+、HPO42−离子至对照组水平，hFOB 1.19细胞活性均超过70%。羟基磷灰石陶瓷颗粒具有离子吸附能力，通过降低浸提液中关键离子成分可影响细胞活力。细胞毒性实验结果证实两种颗粒均无潜在细胞毒性，但是BpNcCaP颗粒组的细胞活力低于羟基磷灰石陶瓷组，这个结果可能与BpNcCaP颗粒具有高比表面积吸附了浸提液中关键离子有关。为了进一步探讨颗粒对细胞活性的影响，进行了颗粒与细胞共培养实验，结果显示人脐带间充质干细胞在两种颗粒上均存活良好，并且在与BpNcCaP共培养条件下的增殖活性更强，这可能与BpNcCaP颗粒的高蛋白吸附能力有关，孵育完全培养基后的颗粒表面形成一层蛋白包围，有助于颗粒与细胞接触和增殖。
该研究存在一定局限性：首先，两种颗粒的骨修复效果没有在动物体内进行验证；其次，采用颗粒对胎牛血清和牛血清白蛋白溶液的蛋白吸附效果评估，只能部分模拟颗粒植入人体内后的蛋白吸附效果；最后，BpNcCaP颗粒的独特微纳米结构对人脐带间充质干细胞增殖活性影响仍需要进一步研究。此外，BpNcCaP尺寸是0.25-1 mm的小颗粒，临床使用中可能会有骨粉洒落问题，颗粒材料需要进行固定。目前BpNcCaP颗粒的制备工艺需要进一步改进和优化，通过设计合适的孔隙结构以适应大体积骨缺损对细胞长入的要求。
综上所述，高温烧结虽然可以提高羟基磷灰石颗粒的生物相容性、机械力学性能，但高温烧结过程使得颗粒中的晶粒相互融接形成凝聚的块体，导致脆性增加，微纳米孔丧失，比表面积、蛋白吸附能力、亲水润湿显著下降。与羟基磷灰石陶瓷颗粒相比，BpNcCaP颗粒具有更小的晶粒尺寸、更多的微孔、更高的比表面积和更好的亲水润湿性，这些结果表明BpNcCaP颗粒在骨科和口腔科骨缺损修复中具有较大的临床应用潜力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

纳米晶仿生钙磷颗粒的理化性质及细胞相容性

Physicochemical properties and cytocompatibility of biomimetically precipitated nanocrystalline calcium phosphate granules

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