人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障功能的调节作用

doi:10.12307/2024.158

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 2967-2973.doi: 10.12307/2024.158

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人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障功能的调节作用

吴雅茹1，米焱2，魏凯悦1，高和平1，张丁予1，王彩丽2

1内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古自治区包头市 014000；2内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院肾内科，内蒙古自治区包头市 014000

收稿日期:2023-03-21 接受日期:2023-05-19 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-25
通讯作者: 王彩丽，教授，主任医师，内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院肾内科，内蒙古自治区包头市 014000
作者简介:吴雅茹，女，1991年生，内蒙古自治区巴彦淖尔市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事糖尿病肾病的临床、病理及基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82160141)，项目负责人：王彩丽

Regulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on intestinal barrier function in diabetic nephropathy rats

Wu Yaru1, Mi Yan2, Wei Kaiyue1, Gao Heping1, Zhang Dingyu1, Wang Caili2

1Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Department of Nephrology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2023-03-21 Accepted:2023-05-19 Online:2024-07-08 Published:2023-09-25
Contact: Wang Caili, Professor, Chief physician, Department of Nephrology, First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Wu Yaru, Master, Attending physician, Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014000, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82160141 (to WCL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

人脐带间充质干细胞：与其他来源的间充质干细胞相比，人脐带间充质干细胞的潜伏性病毒和病原微生物感染及传播率更低，具有更强的增殖分化能力，且来源广、易获取、免疫原性低和伦理争议小，日益受到人们的关注。
糖尿病肾病：是糖尿病常见的慢性微血管并发症，也是慢性肾脏病的首要病因，可发展至终末期肾病，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。

背景：糖尿病肾病是引起终末期肾病的重要原因，其中肠道屏障损伤在糖尿病肾病的发生发展中起到了重要作用。

目的：观察人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障的保护作用。
方法：30只8周龄雄性SD大鼠随机分配至健康对照组、模型组和人脐带间充质干细胞组，每组10只。人脐带间充质干细胞组大鼠在糖尿病肾病成模后经尾静脉注射1×106个人脐带间充质干细胞，每周1次，连续4周，健康对照组和模型组大鼠在相同时间注射等体积PBS。末次注射后1周，光镜下观察肾脏和结肠组织形态学改变情况，免疫组化法检测大鼠结肠组织中ZO-1和Occludin的表达；ELISA法检测大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平。此外，还利用活体成像系统观察DiR染料标记的人脐带间充质干细胞在大鼠体内的示踪分布，以及应用免疫组化法检测结肠组织中人源性间充质干细胞表面标志抗原CD44和CD90的表达。

结果与结论：①与模型组比较，人脐带间充质干细胞移植显著抑制了糖尿病肾病大鼠尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白水平和尿白蛋白/肌酐比值的增加(均P < 0.05)；②在糖尿病肾病大鼠结肠中发现了人源间充质干细胞表面标志物CD44和CD90的表达；③与健康对照组相比，模型组大鼠结肠组织中紧密连接蛋白Occludin与ZO-1蛋白表达水平显著减少，而人脐带间充质干细胞治疗后显著提高了Occludin和ZO-1的表达；④与模型组比较，人脐带间充质干细胞移植后显著降低了糖尿病肾病大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平；⑤结果提示，人脐带间充质干细胞可能通过增强糖尿病肾病大鼠肠道紧密连接蛋白的表达来保护肠道屏障功能。

https://orcid.org/0000-0002-9458-3624 (吴雅茹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人脐带间充质干细胞, 糖尿病肾病, 肠道屏障, ZO-1, Occludin

Abstract: BACKGROUND: Diabetic nephropathy is an important cause of end-stage renal disease, and intestinal barrier damage plays an important role in the occurrence and development of diabetic nephropathy.
OBJECTIVE: To observe the protective effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the intestinal barrier in rats with diabetic nephropathy.
METHODS: Thirty 8-week-old male SD rats were randomly assigned to healthy control group, model group and human umbilical cord mesenchymal stem cell group, with 10 rats in each group. Rats in the human umbilical cord mesenchymal stem cell group were injected with 1×106 human umbilical cord mesenchymal stem cells through the tail vein once a week for 4 weeks after the model establishment of diabetic nephropathy. Rats in the healthy control group and the model group were injected with an equal volume of PBS at the same time. 1 week after the last injection, the histomorphological changes in the kidney and colon were observed under a light microscope. The expressions of ZO-1 and Occludin in the colon tissue of rats were detected by immunohistochemistry. Serum D-lactic acid and lipopolysaccharide levels were detected by ELISA. In addition, the distribution of human umbilical cord mesenchymal stem cells labeled with DiR dye in rats was observed by in vivo imaging system. The expression of human mesenchymal stem cell surface marker antigens CD44 and CD90 in colon tissue was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation significantly inhibited the increase of urea nitrogen, serum creatinine, 24-hour urine protein level and urinary albumin/creatinine ratio in diabetic nephropathy rats (all P < 0.05). (2) The expression of human mesenchymal stem cell surface markers CD44 and CD90 was found in the colon of diabetic nephropathy rats. (3) Compared with the healthy control group, the expression levels of tight junction proteins Occludin and ZO-1 in the colon tissue of the model group were significantly reduced, while the expressions of Occludin and ZO-1 were significantly increased after treatment with human umbilical cord mesenchymal stem cells. (4) Compared with the model group, human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation significantly reduced serum D-lactic acid and lipopolysaccharide levels in diabetic nephropathy rats. (5) The results suggest that human umbilical cord mesenchymal stem cells may protect the intestinal barrier function by enhancing the expression of intestinal tight junction proteins in diabetic nephropathy rats.

Key words: human umbilical cord mesenchymal stem cell, diabetic nephropathy, intestinal barrier, ZO-1, Occludin

中图分类号:

吴雅茹, 米焱, 魏凯悦, 高和平, 张丁予, 王彩丽. 人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障功能的调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 2967-2973.

Wu Yaru, Mi Yan, Wei Kaiyue, Gao Heping, Zhang Dingyu, Wang Caili. Regulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on intestinal barrier function in diabetic nephropathy rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 2967-2973.

图/表（结果） 6

2.1 HU-MSCs的形态特征和特征性表面标记物原代HU-MSCs培养贴壁生长，48-72 h传代1次，传至第4代时，光镜下观察细胞呈梭状排列，即HU-MSCs外观为成纤维细胞状，见图1A。流式细胞术检测证实HU-MSCs的特征性表面标记物CD105、CD90、CD44、CD29的阳性率分别为99.8%，100%，100%，99.4%，而HLA-DR、CD45、CD34的阳性率分别为1%，1.6%，1.3%，见图1B。证明HU-MSCs纯度较高，免疫原性较低。

2.2 糖尿病肾病大鼠的一般情况 SD大鼠腹腔注射35 mg/kg链脲佐菌素后，从第6天开始到12周大鼠体质量增加明显低于健康对照组，见图2A。同样，模型组大鼠血糖水平在链脲佐菌素注射后从第6天开始到12周均显著高于健康对照组，见图2B。此外，在链脲佐菌素注射第12周时，健康对照组大鼠肾脏组织PAS染色和Masson染色显示肾小球、肾小管、肾间质及小血管均结构正常；而模型组大鼠肾脏PAS染色和Masson染色显示肾小球系膜细胞和系膜基质轻中度弥漫性增生，基底膜轻中度均匀增厚，肾小管上皮细胞小灶性空泡变性，肾间质小灶性纤维化，小血管管壁轻度增厚，管腔轻度狭窄，肾小球体积增大，见图2C。这些结果说明糖尿病肾病大鼠模型成功建立。

2.3 HU-MSCs在实验大鼠体内的示踪分布 DiR染料标记的HU-MSCs经尾静脉注射到模型组和健康对照组大鼠体内后，均可在腹部观察到DiR染料的荧光分布，且荧光主要分布在模型组大鼠的脾胃与胰腺区，而在健康对照组大鼠主要分布在肝脏区，见图3A。为了进一步探讨DiR染料标记的HU-MSCs在模型组大鼠结肠中的分布，该研究观察了人源性间充质干细胞特征性表面标志蛋白CD90和CD44的表达，结果发现，在模型组大鼠的结肠黏膜间质中均有CD44蛋白(红色箭头)CD90蛋白的表达(黑色箭头)，见图3B，C，证明HU-MSCs在模型组大鼠结肠中定植。

2.4 HU-MSCs对糖尿病肾病大鼠肾脏功能的影响在糖尿病肾病大鼠建模过程中观察到模型组大鼠的饮水量和摄食量明显高于健康对照组。与模型组相比，HU-MSCs组大鼠饮水和摄食量下降，血糖浓度增加不明显，且在第2次注射后1周血糖水平明显下降，见图4A-C。末次治疗后1周，与健康对照组相比，模型组大鼠尿素氮和血肌酐水平均明显增加，HU-MSCs组大鼠尿素氮和血肌酐水平显著降低，见图4D-E。与模型组比较，HU-MSCs组大鼠24 h尿蛋白水平和尿白蛋白/肌酐比值明显下降，尿肌酐水平上升，见图4F-H。同样，HU-MSCs治疗后大鼠病理改变得到改善，肾小球系膜细胞和系膜基质轻度弥漫性增生，基底膜轻度均匀增厚，肾小管上皮细胞空泡变性数量减少，肾间质纤维化减轻，小血管病变也得到改善，见图4I。

2.5 HU-MSCs移植改善糖尿病肾病大鼠肠道通透性健康对照组大鼠结肠切片显示黏膜结构正常，而模型组大鼠结肠组织可见黏膜脱落，HU-MSCs治疗后糖尿病肾病大鼠的结肠组织损伤得到改善，见图5A。为了进一步评估肠道屏障的完整性，通过免疫组化方法检测了肠道屏障中紧密连接蛋白(Occludin和ZO-1)的表达。健康对照组大鼠结肠组织中Occludin蛋白阳性细胞主要分布在黏膜上皮，与健康对照组相比，模型组大鼠结肠组织中Occludin蛋白表达水平明显降低，而HU-MSCs治疗后显著提高了结肠组织中Occludin蛋白的表达水平。健康对照组大鼠结肠组织中ZO-1蛋白阳性细胞主要分布在黏膜间质，与健康对照组相比，模型组大鼠结肠组织中ZO-1蛋白表达水平明显降低，而HU-MSCs治疗后显著提高了结肠组织中ZO-1蛋白的表达水平，见图5B-D。为了进一步观察HU-MSCs治疗对糖尿病肾病大鼠肠道屏障功能的改善，检测了大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平，结果发现，与健康对照组相比，模型组大鼠血清中D-乳酸和脂多糖水平显著升高，而HU-MSCs组大鼠血清中D-乳酸和脂多糖水平下降，见图5E，F及表1。因此，HU-MSCs可能通过增强必需紧密连接蛋白的表达水平来保护肠道屏障。

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引言

糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，也是引起终末期肾病高发病率的重要原因[1-2]。流行病学调查结果显示，截至2021年全球成年糖尿病患者人数共计5.37亿，若不加干预，到2045年这个数字将上升至7.83亿[3]。随着糖尿病患者人数的增加和疾病的流行，糖尿病肾病的发病率会呈快速增长趋势，导致需要进行肾脏替代治疗的糖尿病肾病患者数量持续增加，造成了巨大的医疗负担和社会经济负担。目前，针对糖尿病肾病的治疗方法主要是控制血压和血糖，以及使用血管紧张素受体阻滞剂和血管紧张素转换酶抑制剂，然而这些方式在预防糖尿病肾病进展方面显示出有限的效果[4-6]。因此，寻找糖尿病肾病的病因以及新的、潜在的治疗靶点和治疗方法，有效延缓或阻断疾病进程是防治糖尿病肾病的关键。
近年，大量研究促使人们认识到肠道菌群失衡诱发的肠道屏障破坏在慢性肾脏疾病的发生发展中起到了重要作用。慢性肾脏疾病患者常存在肠道菌群失调、细菌代谢产物积累、肠道屏障功能破坏和慢性炎症[7-8]。将终末期肾病患者肠道菌群移植到腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病无菌小鼠模型中，尿毒素水平增加，同时肠道菌群稳态和肠道黏膜屏障被破坏，导致细菌和毒素易位增多，慢性肾脏疾病小鼠病程加速进展[9]。
肠道菌群失衡是糖尿病肾病的常见现象[10-11]。由于肠道微生态失调改变了肠道的生化环境，这可能导致肠上皮细胞紧密连接蛋白改变，进而引起肠屏障功能受损，有害代谢物质泄漏进入肠壁和体循环，从而加重糖尿病肾病的病情[12]。这提示，通过干预肠道代谢途径提高肠道屏障功能可能是治疗糖尿病肾病的有效方法。
目前，间充质干细胞在糖尿病及糖尿病肾病治疗中取得了一定的成果[13]。研究表明，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HU-MSCs)能显著改善糖尿病肾病大鼠的肾脏功能，降低血糖[14]。前人研究发现，炎症性肠病小鼠注射骨髓间充质干细胞后，在腹膜中形成由巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞以及免疫调节分子组成的聚集物，从而减轻了肠道炎症[15]。YANG等[16]明确了间充质干细胞来源外泌体可以通过肿瘤坏死因子α刺激基因6修复炎症性肠病小鼠黏膜屏障和肠道免疫稳态，对炎症性肠病具有保护作用。目前虽然未见HU-MSCs用于糖尿病肾病肠道屏障修复的相关报道，但考虑到糖尿病肾病与肠道微生态的紧密关系，假设HU-MSCs具有改善糖尿病肾病肠道屏障的作用。该研究将HU-MSCs植入到糖尿病肾病大鼠体内，观察HU-MSCs对糖尿病肾病大鼠肾脏功能和病理的影响，以及对肠道屏障功能的修复作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用One-way ANOVA检验。
1.2 时间及地点实验于2021年12月至2022年5月在内蒙古科技大学包头医学院转化医学中心动物实验平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组 30只8周龄雄性SD大鼠，体质量180-200 g，健康清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，适应性饲养1周后随机分为3组：HU-MSCs组、模型组和健康对照组，每组10只。实验方案经内蒙古科技大学包头医学院医学伦理委员会批准，审批号为2023013。实验过程遵循了《关于动物伦理与福利的作者指南共识》。
1.3.2 实验试剂和仪器链脲佐菌素(美国Sigma公司)；体积分数10%胎牛血清、DF-12培养基(美国Gibico公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海酶联生物科技公司)；大鼠D-乳酸检测试剂盒(美国Sigma公司)；大鼠脂多糖/内毒素检测试剂盒(武汉赛培生物有限公司)；兔抗鼠ZO-1一抗(英国Abcam公司，EPR19945-296)；兔抗鼠Occludin一抗(Affinity Biosciences，DF7504)；鼠抗人CD105-PE、CD90-PE、CD29-PE、CD44-PE及同型鼠IgG-PE、CD34-FITC、HLA-DR以及IgG-FITC同型抗体(中国Beckman公司)；CD44单克隆抗体(Proteintech，60224-1-Ig)；CD90单克隆抗体(Proteintech，66766-1-Ig)；流式细胞仪(Becton Dickinson，AccuriC6 plus)；全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技公司，Chemray 800)；小动物活体成像仪(美国Perkin Elmer公司，IVIS Spectrum)。
1.4 实验方法
1.4.1 HU-MSCs的体外培养实验中所用原代HU-MSCs购自北京清大赛尔有限公司。原代HU-MSCs用含体积分数10%胎牛血清的DF-12培养基，在37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中进行培养。当细胞融合度接近80%-90%时进行传代，并按照1∶3传代接种至细胞培养皿中，24 h后换液，接着每48 h更换培养液1次，直到细胞长满瓶底，镜下观察细胞形态。
1.4.2 流式细胞仪鉴定HU-MSCs 在第4代HU-MSCs悬液中加入鼠抗人CD90、CD105、CD44、CD29、CD34抗体及同型鼠IgG抗体，避光环境下孵育30 min，随后加入PBS吹打均匀，1 000 r/min离心4 min，弃去上清液，重复2次，再次加入PBS制成HU-MSCs悬液，上流式细胞仪检测HU-MSCs表面标志抗原的阳性率。
1.4.3 糖尿病肾病大鼠模型制备大鼠适应性饲养1周后被随机分为3组开始造模。造模前1 d予以禁食不禁水12 h，准确称量大鼠体质量，模型组和HU-MSCs组大鼠腹腔注射35 mg/kg链脲佐菌素溶液(将链脲佐菌素溶解于新鲜配制的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，pH值调为4.2，质量浓度为2.5 g/L，现配现用，避光保存)，健康对照组腹腔注射同等剂量的柠椽酸-柠檬酸钠缓冲液，连续注射3 d，第4天开始测量随机血糖，当血糖值大于16.7 mmo/L时认定糖尿病大鼠模型制备成功(不成模大鼠继续补打链脲佐菌素溶液，直至成模)。糖尿病模型制备成功后继续饲养12周，当肾脏出现典型的糖尿病肾病病理学改变，认定模型制备成功。
1.4.4 DiR染料标记的HU-MSCs在大鼠体内示踪新鲜配置的近红外荧光(DiR)染料加入HU-MSCs中，37 ℃下避光孵育5 min，之后PBS轻柔清洗细胞2次，避光保存。
选取健康对照组和模型组大鼠各3只，在糖尿病肾病造模成功后分别经尾静脉注射DiR-HU-MSCs，代谢12-16 h后在小动物活体光学3D成像系统下观察DiR-HU-MSCs在两组大鼠体内的示踪分布情况。利用IVIS Lumina II 成像仪记录成像。在DiR-HU-MSCs移植后1周处死实验动物，取结肠制作病理组织切片，利用人源性间充质干细胞特异性抗体CD90、CD44染色大鼠结肠组织，观察移植入大鼠体内的HU-MSCs在结肠的定植情况。
1.4.5 HU-MSCs移植治疗糖尿病肾病大鼠 HU-MSCs组大鼠在糖尿病肾病成模后开始经尾静脉缓慢注射1×106个HU-MSCs(第4代HU-MSCs，配置成细胞浓度为2×109 L-1的细胞悬液，注射500 μL)，每周1次，连续4周，模型组和健康对照组大鼠在相同时间注射等体积PBS。
1.4.6 实验动物肾功能指标检测末次HU-MSCs移植后1周，实验大鼠麻醉后进行样本收集(24 h尿液、血液)，采用全自动生化仪检测血肌酐、尿素氮和尿白蛋白水平，采用BCA蛋白定量试剂盒检测尿蛋白水平，采用ELISA试剂盒检测尿肌酐水平。最后计算24 h尿蛋白水平和尿白蛋白/肌酐比值。
1.4.7 大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平的检测采用ELISA试剂盒检测大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平，具体步骤按照说明书操作。
1.4.8 肾脏组织和结肠组织病理检测末次HU-MSCs移植后1周，麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠，迅速取出肾脏和结肠。将大鼠右肾脏包膜去掉后，沿着横轴切开，在每一半肾脏上再沿着横轴切一下，使肾脏薄片变成厚度为原来的1/2，然后固定于40 g/L多聚甲醛，进行石蜡包埋，切4 μm厚的切片进行PAS染色和Masson特殊染色，光镜下观察肾小球和肾间质形态学改变。大鼠结肠组织固定于40 g/L多聚甲醛，进行石蜡包埋，切4 μm厚的切片进行苏木精-伊红染色，光镜下观察结肠组织形态学改变。
1.4.9 结肠组织免疫组织化学染色在末次HU-MSCs移植后1周处死实验动物，取结肠制作病理组织切片，观察Occludin与ZO-1蛋白在结肠中的表达。将石蜡包埋的结肠组织切成4 μm厚切片，烘烤后放入二甲苯中脱蜡3次，梯度乙醇水合；滴柠檬酸钠到切片上进行抗原修复，之后滴加50 μL正常山羊血清溶液室温封闭30 min；吸干切片的液体，加入相应稀释后的一抗(Occludin的稀释比例为1∶50，ZO-1的稀释比例为1∶500)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次10 min，加入稀释后的二抗(稀释比例为1∶1 000)，室温孵育60 min；在结肠组织切片上滴加DAB显色液，待出现阳性细胞后倾去显色液，用双蒸水终止染色。待结肠组织切片经过乙醇、二甲苯脱水、透明、树胶封固后，光镜下观察、拍照、分析。
1.5 主要观察指标 ①DiR标记的HU-MSCs在糖尿病肾病大鼠体内的示踪分布，以及人源性间充质干细胞表面抗原CD90和CD44在结肠中的表达与分布；②HU-MSCs对糖尿病肾病大鼠结肠和肾脏损伤的修复作用；③HU-MSCs对糖尿病肾病大鼠结肠中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达的影响；④HU-MSCs对糖尿病肾病大鼠血清D-乳酸和脂多糖水平的影响；⑤HU-MSCs对糖尿病肾病大鼠生化指标的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料数据采用x±s表示，健康对照组和模型组间体质量和血糖比较采用t检验；多组间血糖、摄食量、饮水量、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、尿肌酐、尿白蛋白/肌酐比值以及D-乳酸和脂多糖水平比较采用One-way ANOVA检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

许多研究表明，糖尿病患者及其动物模型中存在肠道屏障功能受损，主要表现为肠黏膜形态学改变和通透性增加。BOSI等[17]研究者通过乳果糖-甘露糖渗透实验测定肠黏膜通透性，发现1型糖尿病患者的肠黏膜通透性显著大于正常人群。ZHONG等[18]研究者采用Lewis评分评估2型糖尿病患者胶囊内镜下的小肠黏膜损伤情况，该评分基于3个胶囊内镜变量：绒毛外观(水肿)、溃疡和狭窄，结果显示，与非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者小肠绒毛水肿患病率和Lewis评分显著增高，将不同类型的糖尿病并发症与Lewis评分进行关联性分析发现：糖尿病肾病患者的Lewis评分明显高于非糖尿病肾病患者，相比之下，心脑血管并发症或糖尿病周围神经病变病史并没有影响Lewis评分。由此可见，不论是1型糖尿病还是2型糖尿病，都存在肠道屏障损伤，且肠道屏障损伤与糖尿病肾病的形成有关。
革兰阴性菌外膜中的脂多糖和肠道细菌新陈代谢产物D-乳酸的血清水平被认为是肠黏膜通透性增加的生物标志物，当肠道菌群失衡、肠道屏障损伤时，肠黏膜和毛细血管通透性增加，大量的脂多糖和D-乳酸通过受损的肠黏膜进入血液循环，外周血脂多糖和D-乳酸水平显著增高[19-20]。而肠上皮细胞间的紧密连接蛋白是维持肠道屏障功能的重要结构基础，也是决定肠黏膜通透性的重要因素[21-22]。DENG等[23]研究表明与低脂饮食组小鼠相比，糖尿病肾病小鼠结肠组织中肠黏膜上皮紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达显著降低，且粪便和血清中的脂多糖水平显著增高。另外一项动物研究也同样发现，在db/db 2型糖尿病肾病小鼠结肠中黏蛋白Muc2、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表达显著低于db/m对照组小鼠[12]。霍丽霞等[24]发现，糖尿病肾病患者血清中脂多糖水平明显高于健康对照组和2型糖尿病患者组，且脂多糖水平与24 h尿蛋白有显著相关性；血清D-乳酸水平高于健康对照组，且D-乳酸与空腹血糖有显著相关性，表明糖尿病肾病患者存在肠道屏障损伤，肠黏膜通透性显著增加。在此研究中，作者观察到糖尿病肾病大鼠结肠组织中ZO-1蛋白和Occludin蛋白表达显著减少，且结肠组织的形态发生明显改变，黏膜细胞脱落。这进一步说明，肠道屏障功能可能对于糖尿病肾病的发生和进展具有重要意义，针对肠道屏障的修复可能是延缓糖尿病肾病进展的重要方法。
间充质干细胞是一类起源于中胚层的成体干细胞，最早在骨髓中发现[25]，后来发现广泛分布于身体的各个组织，包括脂肪、脐带、胎盘、牙髓等，具有多向分化和自我更新能力。间充质干细胞通过其定向分化和旁分泌功能实现组织修复和免疫调节，成为近年来疾病治疗的研究热点。HU-MSCs与其他来源的间充质干细胞相比，潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播率更低，具有更强的增殖分化能力，且来源广、易获取、免疫原性低和伦理争议小，日益受到人们的关注[26-27]。
大量的动物实验证实了间充质干细胞治疗糖尿病肾病的有效性。近期发表的一篇Meta分析表明，间充质干细胞移植可改善糖尿病肾病动物模型的血糖，降低血肌酐、尿素氮和蛋白尿，减轻肾脏纤维化[13]。此外，HU-MSCs也被证实具有延缓糖尿病大鼠肾脏疾病进展的作用。CHEN等[28]所在的研究团队发现，糖尿病肾病大鼠每周输注1次HU-MSCs，连续2周，大鼠24 h尿蛋白、尿白蛋白/肌酐比值、血肌酐和尿素氮的增加受到抑制，同时，HU-MSCs改善了糖尿病肾病大鼠肾脏的病理改变，并发现这种改善作用可能是通过
HU-MSCs抑制肾脏细胞凋亡来实现的。此研究同样得出类似的结论，HU-MSCs移植明显改善了糖尿病肾病大鼠的生存状态，显著降低糖尿病肾病大鼠的血肌酐、尿素氮、尿白蛋白/肌酐比值和24 h尿蛋白水平，明显改善了肾小球系膜基质增生，且在HU-MSCs移植后第2周糖尿病肾病大鼠血糖水平明显下降。
目前，间充质干细胞对糖尿病肾病的肾脏保护机制还不明确。研究证实，间充质干细胞具有“归巢”特性，当机体出现缺血、缺氧和损伤时，间充质干细胞会定向迁移至靶组织并定植存活[29-30]，通过旁分泌和分泌外泌体的方式进行免疫调节、组织修复和抑制炎症[31-33]。此外，间充质干细胞通过改善炎症反应、抑制纤维化、调节自噬、减少肾脏细胞凋亡和改善氧化应激，直接或间接的发挥肾脏保护作用，降低糖尿病肾病动物模型的血糖，改善肾功能，减少蛋白尿，逆转肾组织损伤[34-39]。肠道菌群失衡与肠道屏障损伤参与了糖尿病肾病的发生发展，但目前还没有间充质干细胞修复糖尿病肾病肠道屏障损伤的相关研究。在炎症性肠病小鼠中，间充质干细胞外泌体可通过肿瘤坏死因子α刺激基因6恢复小鼠黏膜屏障和肠道免疫稳态[16]。北京大学口腔医院张益教授团队发现，脂肪间充质干细胞可以显著改变糖尿病小鼠的肠道菌群结构[40]。在此研究中，作者发现HU-MSCs在糖尿病肾病大鼠的结肠组织定植，更重要的是，HU-MSCs促进糖尿病肾病大鼠结肠紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，这说明HU-MSCs具有改善肠道屏障的作用，且可能通过增强ZO-1和Occludin的表达减弱肠道通透性，从而起到保护肾脏功能的作用。
总之，该研究表明HU-MSCs可以改善糖尿病肾病大鼠的肾脏功能，延缓肾脏病理进展，修复肠道屏障损伤，且可能通过增强肠道紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达来减弱肠道通透性。因此，HU-MSCs移植恢复肠道屏障功能可能是未来糖尿病肾病治疗的新方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障功能的调节作用

Regulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on intestinal barrier function in diabetic nephropathy rats

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