维生素D3减轻高糖暴露诱导氧化应激促进人脐带间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2024.179

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 2981-2987.doi: 10.12307/2024.179

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维生素D3减轻高糖暴露诱导氧化应激促进人脐带间充质干细胞的成骨分化

谢婷1，刘婷婷1，曾雪慧1，李亚敏1，周庞虎2，易念华1

1湖北省妇幼保健院妇女保健科，湖北省武汉市 430070；2 武汉大学人民医院骨科，湖北省武汉市 430060

收稿日期:2023-05-08 接受日期:2023-07-08 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-25
通讯作者: 易念华，硕士，主任医师，湖北省妇幼保健院妇女保健科，湖北省武汉市 430070 周庞虎，博士，主任医师，博士生导师，武汉大学人民医院骨科，湖北省武汉市 430060
作者简介:谢婷，女，1981年生，湖北省荆州市人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事骨质疏松、复发性流产、多囊卵巢综合征等研究。
基金资助:
湖北省重点研发计划项目(2021BCA147)，项目负责人：周庞虎

Vitamin D3 attenuates high-glucose exposure-induced oxidative stress to promote osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells

Xie Ting1, Liu Tingting1, Zeng Xuehui1, Li Yamin1, Zhou Panghu2, Yi Nianhua1

1Department of Women’s Health Care, Maternal and Child Health Hospital of Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei Province, China; 2Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Received:2023-05-08 Accepted:2023-07-08 Online:2024-07-08 Published:2023-09-25
Contact: Yi Nianhua, Master, Chief physician, Department of Women’s Health Care, Maternal and Child Health Hospital of Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei Province, China Zhou Panghu, PhD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Xie Ting, Master, Associate chief physician, Department of Women’s Health Care, Maternal and Child Health Hospital of Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Supported by:
Hubei Provincial Key Research and Development Program, No. 2021BCA147 (to ZPH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

高糖暴露：糖尿病是骨质疏松的重要病因之一，高葡萄糖环境会诱导细胞出现氧化应激和功能障碍，并导致骨质疏松的临床治疗效果降低。最近的研究报道，高糖暴露会抑制间充质干细胞的成骨分化能力，探究如何逆转高糖暴露诱导的成骨分化抑制成为干细胞领域的研究焦点。
人脐带间充质干细胞：与其他间充质干细胞相比，人脐带间充质干细胞具有来源丰富、取材方便、分化潜力高等优势，是目前干细胞应用的最佳来源。在骨质疏松疾病中，有效促进人脐带间充质干细胞的成骨分化能够为其临床应用提供新思路。

背景：糖尿病骨质疏松症逐渐受到公众的关注，然而鲜有研究报道高糖环境对人脐带间充质干细胞成骨分化的影响和相应的治疗策略。

目的：探讨维生素D3恢复高糖环境中人脐带间充质干细胞成骨分化的潜力。
方法：通过CCK-8法检测人脐带间充质干细胞活力来筛选适宜的维生素D3干预浓度。在高葡萄糖条件下，通过RT-qPCR、蛋白质印迹、免疫荧光、JC-1线粒体膜电位、茜素红染色和β-半乳糖苷酶染色等实验评估维生素D3干预后人脐带间充质干细胞的成骨分化潜能、细胞内活性氧积累、线粒体膜电位改变和细胞衰老情况，并探讨了潜在的机制。

结果与结论：①维生素D3在0.1 μmol/L至1 mmol/L范围内均能显著促进人脐带间充质干细胞的增殖；②高糖环境下调了人脐带间充质干细胞中成骨相关基因α1-Ⅰ型胶原蛋白、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙蛋白的mRNA和蛋白表达水平，诱发了氧化应激和细胞衰老；③维生素D3在10 μmol/L的干预浓度下显著恢复了高糖条件下人脐带间充质干细胞的成骨表型，并通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻了细胞内的氧化应激和细胞衰老；④结果表明，高糖环境中人脐带间充质干细胞的成骨分化能力降低，维生素D3可以部分提高其成骨分化能力并减轻细胞损伤。

https://orcid.org/0000-0002-7020-4258 (周庞虎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 糖尿病骨质疏松症, 人脐带间充质干细胞, 维生素D3, 高血糖, 线粒体功能障碍, 活性氧, 细胞衰老, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Diabetic osteoporosis is gaining public attention. However, few studies have reported the effect of a high-glucose environment on the osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and the corresponding therapeutic strategies.
OBJECTIVE: To investigate whether vitamin D3 can restore the osteogenic differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells in a high-glucose environment.
METHODS: The viability of human umbilical cord mesenchymal stem cells was detected by CCK-8 assay to screen the appropriate vitamin D3 intervention concentration. Under the high-glucose environment, RT-qPCR, western blot assay, immunofluorescence, JC-1 mitochondrial membrane potential, alizarin red staining, and β-galactosidase staining were used to evaluate the osteogenic differentiation potential, intracellular reactive oxygen species accumulation, mitochondrial membrane potential alteration, and cell senescence of human umbilical cord mesenchymal stem cells after vitamin D3 intervention. The underlying mechanism was also discussed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Vitamin D3 significantly promoted the proliferation of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the range of 0.1 μmol/L to 1 mmol/L. (2) High-glucose environment down-regulated the mRNA and protein level expressions of osteogenic-related genes α1-I collagen, alkaline phosphatase, Runt-associated transcription factor 2, and osteocalcin in human umbilical cord mesenchymal stem cells, which induced oxidative stress and cellular senescence. (3) Vitamin D3 at an intervention concentration of 10 μmol/L significantly restored the osteogenic phenotype of human umbilical cord mesenchymal stem cells under high-glucose conditions and attenuated intracellular oxidative stress and cellular senescence by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway. (4) These findings suggested that the osteogenic differentiation ability of human umbilical cord mesenchymal stem cells was reduced in the high-glucose environment, and vitamin D3 could partially improve their osteogenic differentiation ability and reduce cell damage.

Key words: diabetic osteoporosis, human umbilical cord mesenchymal stem cell, vitamin D3, hyperglycemia, mitochondrial dysfunction, reactive oxygen species, cellular senescence, osteogenic differentiation

中图分类号:

谢婷, 刘婷婷, 曾雪慧, 李亚敏, 周庞虎, 易念华. 维生素D3减轻高糖暴露诱导氧化应激促进人脐带间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 2981-2987.

Xie Ting, Liu Tingting, Zeng Xuehui, Li Yamin, Zhou Panghu, Yi Nianhua. Vitamin D3 attenuates high-glucose exposure-induced oxidative stress to promote osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 2981-2987.

图/表（结果） 5

2.1 人脐带间充质干细胞鉴定结果使用流式细胞术鉴定细胞的表面标志物，其中CD44、CD73、CD90和CD105为阳性，CD34和CD45为阴性，符合HUC-MSCs的表型，见图1。

2.2 维生素D3和葡萄糖对人脐带间充质干细胞活力的影响 CCK-8检测结果表明，维生素D3在0.1 μmol/L-0.1 mmol/L范围内均能显著促进HUC-MSCs的增殖，见图2A。而葡萄糖干预以浓度依赖性在15-120 mmol/L范围内抑制HUC-MSCs生长，见图2B。结合前期文献调研结果，30 mmol/L葡萄糖能够有效模拟体外实验的高糖培养条件[21-22]。因此，在接下来的研究中，采用30 mmol/L葡萄糖干预并探究维生素D3的治疗作用。CCK-8实验结果表明，0.1 μmol/L-0.1 mmol/L维生素D3能够逆转高糖诱导的HUC-MSCs增殖抑制，且10 μmol/L维生素D3组的细胞活力最高，见图2C。根据以上研究结果，接下来的研究采用30 mmol/L葡萄糖来干预模拟高糖环境，并探索10 μmol/L维生素D3对高糖暴露后HUC-MSCs的影响。

2.3 维生素D3对高糖诱导HUC-MSCs成骨能力的保护作用茜素红染色结果显示，HUC-MSCs在成骨分化诱导14 d后，出现了大量橘红色钙结节，表明HUC-MSCs出现了成骨表型；而在高糖培养基中培养的HUC-MSCs橘红色钙结节数量显著减少、范围显著缩小，表明HUC-MSCs成骨分化受抑制，而补充维生素D3可以逆转高糖对成骨分化的不良影响，见图3A。免疫荧光染色结果显示，高糖组RUNX2和OCN的荧光强度均显著下调，而维生素D3干预增强了RUNX2和OCN的荧光表达，见图3B-D。RT-qPCR和免疫印迹结果显示，与对照组相比，高糖组成骨相关COL1A1、ALP、RUNX2和OCN的mRNA及蛋白表达下调，而维生素D3干预可以恢复其表达，见图3E-G。以上实验结果表明，高糖损害了HUC-MSCs的成骨分化潜能，而维生素D3减轻了高糖的危害。

2.4 维生素D3通过Nrf2/HO-1信号通路减轻高糖诱导的HUC-MSCs氧化应激研究表明，高糖诱导的氧化应激是干细胞功能障碍的关键机制之一，而氧化应激诱导的线粒体功能障碍和活性氧积聚会引发骨质疏松[23-26]。Nrf2/HO-1信号通路是调节氧化应激的重要通路[14，27]。通过免疫印迹实验发现，与对照组相比，高糖组Nrf2和HO-1蛋白的表达显著下降，而维生素D3处理增加了细胞中Nrf2和HO-1蛋白的表达，见图4A，B。为了进一步验证维生素D3对Nrf2/HO-1信号通路的调节作用，对HUC-MSCs使用Nrf2信号通路特异性抑制剂ML385干预[14]。活性氧检测结果表明，高糖显著增加了HUC-MSCs的荧光强度，而维生素D3降低了活性氧的产生，但加入ML385后维生素D3的治疗作用消失，见图4C，D。线粒体膜电位检测结果表明，高糖环境中HUC-MSCs呈现出较强的绿色荧光和较弱的红色荧光，表明线粒体膜电位下降，细胞处于早期凋亡阶段，见图4E，F。维生素D3干预提高了未加入ML385的HUC-MSCs的红色荧光强度，降低了绿色荧光强度，见图4E，F。以上研究结果表明，维生素D3减轻了高糖诱导的HUC-MSCs的活性氧积累和线粒体功能障碍。

2.5 维生素D3减轻高糖诱导的HUC-MSCs衰老氧化应激是导致细胞衰老的重要原因[27]，β-半乳糖苷酶染色结果表明，高糖显著诱导了HUC-MSCs衰老，而维生素D3减轻了高糖对HUC-MSCs衰老的作用，见图5。

参考文献

[1] 中国老年2型糖尿病防治临床指南编写组,中国老年医学学会老年内分泌代谢分会,中国老年保健医学研究会老年内分泌与代谢分会,等.中国老年2型糖尿病防治临床指南(2022年版)[J].中华内科杂志,2022,61(1):12-50.
[2] LORENTZON M, ABRAHAMSEN B. Osteoporosis epidemiology using international cohorts. Curr Opin Rheumatol. 2022;34(5):280-288.
[3] 嵇星辰,王明欣,陈少华,等.中国绝经后2型糖尿病患者骨质疏松影响因素的Meta分析[J].中国全科医学,2023,26(4):504-511.
[4] 柳飞扬,吴坚.糖尿病合并骨质疏松的中医研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(1):124-128.
[5] 邴学震,金智生.糖尿病性骨质疏松的中医认识及临床治疗现状[J].中国中医基础医学杂志,2019,25(11):1623-1626.
[6] CAVATI G, PIRROTTA F, MERLOTTI D, et al. Role of Advanced Glycation End-Products and Oxidative Stress in Type-2-Diabetes-Induced Bone Fragility and Implications on Fracture Risk Stratification. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):928.
[7] MOHSIN S, BANIYAS MM, ALDARMAKI RS, et al. An update on therapies for the treatment of diabetes-induced osteoporosis. Expert Opin Biol Ther. 2019;19(9):937-948.
[8] NAPOLI N, CHANDRAN M, PIERROZ DD, et al. Mechanisms of diabetes mellitus-induced bone fragility. Nat Rev Endocrinol. 2017;13(4):208-219.
[9] MARINO S, AKEL N, LI S, et al. Reversal of the diabetic bone signature with anabolic therapies in mice. Bone Res. 2023;11(1):19.
[10] CHIODINI I, GAUDIO A, PALERMO A, et al. Management of bone fragility in type 2 diabetes: Perspective from an interdisciplinary expert panel. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2021;31(8):2210-2233.
[11] YAHAO G, XINJIA W. The Role and Mechanism of Exosomes from Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Inducing Osteogenesis and Preventing Osteoporosis. Cell Transplant. 2021;30: 9636897211057465.
[12] WANG Q, XIA Q, MENG M, et al. miR-153-3p inhibits osteogenic differentiation of BMSCs by down-regulating the expression of RUNX2 in a high glucose environment. Am J Transl Res. 2022;14(10):7027-7039.
[13] KLABKLAI P, PHETFONG J, TANGPORNCHAROEN R, et al. Annexin A2 Improves the Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Exposed to High-Glucose Conditions through Lessening the Senescence. Int J Mol Sci. 2022;23(20):12521.
[14] CHEN B, HE Q, YANG J, et al. Metformin suppresses Oxidative Stress induced by High Glucose via Activation of the Nrf2/HO-1 Signaling Pathway in Type 2 Diabetic Osteoporosis. Life Sci. 2023;312:121092.
[15] KODA S, WADA K, YAMAKAWA M, et al. Associations of Plasma 25-Hydroxy Vitamin D and Dietary Vitamin D Intake with Insulin Resistance in Healthy Japanese Women. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2023;69(1):46-52.
[16] AVILA CASTILLO A, HAGEMANN T, HOFFMANN A, et al. Associations between vitamin D, immunoglobulin E concentrations, and obesity. Front Nutr. 2023;10:1147407.
[17] SHARAFI SM, YAZDI M, GOODARZI-KHOIGANI M, et al. Effect of Vitamin D Supplementation on Serum 25-Hydroxyvitamin D and Homeostatic Model of Insulin Resistance Levels in Healthy Pregnancy: A Systematic Review and Meta-Analysis. Iran J Med Sci. 2023;48(1):4-12.
[18] ZHAN D, ZHAO J, SHI Q, et al. 25-hydroxyvitamin D3 inhibits oxidative stress and ferroptosis in retinal microvascular endothelial cells induced by high glucose through down-regulation of miR-93. BMC Ophthalmol. 2023;23(1):22.
[19] SLOBOGEAN GP, BZOVSKY S, O’HARA NN, et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation on Acute Fracture Healing: A Phase II Screening Randomized Double-Blind Controlled Trial. JBMR Plus. 2022;7(1): e10705.
[20] 中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会.维生素D及其类似物的临床应用共识[J].中华内分泌代谢杂志,2018,34(3):187-200.
[21] KIM SY, LEE JY, PARK YD, et al. Hesperetin alleviates the inhibitory effects of high glucose on the osteoblastic differentiation of periodontal ligament stem cells. PLoS One. 2013;8(6):e67504.
[22] ELUMALAI S, KARUNAKARAN U, MOON JS, et al. High glucose-induced PRDX3 acetylation contributes to glucotoxicity in pancreatic β-cells: Prevention by Teneligliptin. Free Radic Biol Med. 2020;160:618-629.
[23] ZHAO D, LIU D, SHI W, et al. Association between Maternal Blood Glucose Levels during Pregnancy and Birth Outcomes: A Birth Cohort Study. Int J Environ Res Public Health. 2023;20(3):2102.
[24] WANG Y, ZHANG L, WU Y, et al. Peptidome analysis of umbilical cord mesenchymal stem cell (hUC-MSC) conditioned medium from preterm and term infants. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):414.
[25] TOZOUR JN, DELAHAYE F, SUZUKI M, et al. Intrauterine Hyperglycemia Is Associated with an Impaired Postnatal Response to Oxidative Damage. Stem Cells Dev. 2018;27(10):683-691.
[26] HUANG Z, CHEN G, WU H, et al. Ebselen restores peri-implantitis-induced osteogenic inhibition via suppressing BMSCs ferroptosis. Exp Cell Res. 2023;427(2):113612.
[27] KOU Y, RONG X, TANG R, et al. Eldecalcitol prevented OVX-induced osteoporosis through inhibiting BMSCs senescence by regulating the SIRT1-Nrf2 signal. Front Pharmacol. 2023;14:1067085.
[28] XIAOLING G, SHUAIBIN L, KAILU L. MicroRNA-19b-3p promotes cell proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs by interacting with lncRNA H19. BMC Med Genet. 2020;21(1):11.
[29] ZHAO G, LUO WD, YUAN Y, et al. LINC02381, a sponge of miR-21, weakens osteogenic differentiation of hUC-MSCs through KLF12-mediated Wnt4 transcriptional repression. J Bone Miner Metab. 2022;40(1):66-80.
[30] MI B, YAN C, XUE H, et al. Inhibition of Circulating miR-194-5p Reverses Osteoporosis through Wnt5a/β-Catenin-Dependent Induction of Osteogenic Differentiation. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;21:814-823.
[31] KAWABATA T, TOKUDA H, KUROYANAGI G, et al. Incretin accelerates platelet-derived growth factor-BB-induced osteoblast migration via protein kinase A: The upregulation of p38 MAP kinase. Sci Rep. 2020; 10(1):2341.
[32] SUN X, KOMATSU T, LIM J, et al. Nutrient-dependent requirement for SOD1 in lifespan extension by protein restriction in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 2012;11(5):783-793.
[33] LIU Y, WANG N, ZHANG S, et al. Autophagy protects bone marrow mesenchymal stem cells from palmitate‑induced apoptosis through the ROS‑JNK/p38 MAPK signaling pathways. Mol Med Rep. 2018; 18(2):1485-1494.
[34] LIU B, GAN X, ZHAO Y, et al. Inhibition of HMGB1 reduced high glucose-induced BMSCs apoptosis via activation of AMPK and regulation of mitochondrial functions. J Physiol Biochem. 2021;77(2):227-235.
[35] GAO C, QIAO J, LI SS, et al. The levels of bone turnover markers 25(OH)D and PTH and their relationship with bone mineral density in postmenopausal women in a suburban district in China. Osteoporos Int. 2017;28(1):211-218.
[36] WATERHOUSE M, EBELING PR, MCLEOD DSA, et al. The effect of monthly vitamin D supplementation on fractures: a tertiary outcome from the population-based, double-blind, randomised, placebo-controlled D-Health trial. Lancet Diabetes Endocrinol. 2023;11(5): 324-332.
[37] UENISHI K, TOKIWA M, KATO S, et al. Stimulation of intestinal calcium absorption by orally administrated vitamin D3 compounds: a prospective open-label randomized trial in osteoporosis. Osteoporos Int. 2018;29(3):723-732.
[38] MANOJ P, DERWIN R, GEORGE S. What is the impact of daily oral supplementation of vitamin D3 (cholecalciferol) plus calcium on the incidence of hip fracture in older people? A systematic review and meta-analysis. Int J Older People Nurs. 2023;18(1):e12492.
[39] ELSAYYAD NME, GOMAA I, SALEM MA, et al. Efficient lung-targeted delivery of risedronate sodium/vitamin D3 conjugated PAMAM-G5 dendrimers for managing osteoporosis: Pharmacodynamics, molecular pathways and metabolomics considerations. Life Sci. 2022;309:121001.
[40] XIONG Y, ZHANG Y, XIN N, et al. 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 promotes bone formation by promoting nuclear exclusion of the FoxO1 transcription factor in diabetic mice. J Biol Chem. 2017;292(49): 20270-20280.

引言

随着肥胖和人口老龄化，糖尿病和骨质疏松的发病率逐年升高，其并发症严重影响了患者的身心健康[1-2]。一项涉及3 616例患者的Meta分析显示，糖尿病病程、空腹血糖和糖化血红蛋白是骨质疏松的主要影响因素[3]。糖尿病骨质疏松症的定义是确诊糖尿病的患者继发骨量减少、骨脆性增加和骨组织微结构破坏等骨质疏松表现，给家庭和社会带来了巨大的经济负担[4]。
据报道，中国糖尿病患者约有半数并发骨质疏松，并极易出现骨折等并发症，严重影响了患者的日常生活[5]。氧化应激及其相关炎症因子的表达是胰岛B细胞损伤的重要原因之一，并通过激活多种信号通路诱导糖尿病的发生[6]。反之，高血糖可以直接诱发氧化应激的产生，破坏成骨细胞和破骨细胞的动态平衡，从而引起骨质疏松[7-9]。因此，如何有效减轻高糖诱导的氧化应激成为目前的研究焦点[10]。
人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs)来源于新生儿脐带组织，具有收集方式安全、再生效率高、分化能力强等优势，在再生医学中具有广阔的应用前景[11]。间充质干细胞向骨形成转变的过程是成骨发生的关键，然而大量研究证实高糖环境诱导的氧化应激对细胞增殖具有抑制作用，甚至会损害干细胞的成骨分化并促进细胞衰老[12-14]。通过激活核因子红样2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)信号通路，可以减轻高葡萄糖诱导的氧化应激损伤，从而调节高糖诱导的成骨分化抑制和治疗糖尿病骨质疏松症 [14]。
流行病学研究表明，维生素D水平低的人群更容易出现超重和胰岛素抵抗[15-16]，而补充维生素D能够减轻胰岛素抵抗的发生[17]，并减轻视网膜血管内皮细胞的氧化应激和铁死亡[18]。维生素D3又名胆钙化醇，是一种主要由人体自身合成的维生素D，也存在于动物脂肪和鱼肝油中，具有改善骨折愈合的作用[19]。根据中国《维生素D及其类似物的临床应用共识》推荐，补充维生素D3制剂具有较高的安全性，无需监测血清25羟维生素D水平，是临床维生素D补充的首选[20]。然而，尚未有研究探索维生素D3是否能够缓解高糖诱导的HUC-MSCs成骨分化损伤。该文章首次研究了维生素D3对高葡萄糖暴露下HUC-MSCs成骨分化能力的影响，为骨质疏松的治疗提供了新依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计使用高葡萄糖暴露诱导HUC-MSCs氧化应激和细胞衰老，探究维生素D3对高葡萄糖环境中HUC-MSCs成骨分化的影响。
1.2 时间及地点实验于2021年1月至2023年3月在湖北省妇幼保健院和武汉大学人民医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 HUC-MSCs由深圳市茵冠生物科技有限公司提供。干细胞培养遵循相关标准操作规程完成，在该研究中仅使用第3代HUC-MSCs。
1.3.2 主要仪器和试剂 Microplate reader酶标仪(EnVision)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；荧光显微镜(Olympus)；ChemiDoc MP扫膜仪(Bio-Rad)；CCK-8细胞活力检测试剂盒(南京建成)；RNA提取试剂盒(Sigma-Aldrich)；反转录试剂盒(赛维尔)；实时荧光定量PCR检测试剂盒(Solarbio)；ELISA检测试剂盒(南京建成)；维生素D3(源叶)；苯甲基磺酰氟(Servicebio)；碱性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)一抗(Servicebio)；Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)一抗(Abclonal)；骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)一抗(Abclonal)；α1-Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠα1 chain，COL1A1)一抗(Servicebio)；Nrf2一抗(Abclonal)；HO-1一抗(Proteintech)；β-actin一抗(Abclonal)；超敏ECL发光液(雅酶)；人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基(普诺赛)；活性氧检测试剂盒(赛维尔)；茜素红染色试剂盒(碧云天)；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(赛维尔)；衰老细胞β-半乳糖苷酶染色试剂盒(赛维尔)；新型选择性Nrf2抑制剂ML385(MCE)。
1.4 实验方法
1.4.1 流式细胞术分析使用流式细胞术检测HUC-MSCs的表面标志物，使用了针对CD34-FITC、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-FITC和CD105-FITC的抗体。
1.4.2 细胞活力检测将HUC-MSCs以5×103个/孔的密度种植于96孔板中，给予0.01 μmol/L-1 mmol/L浓度梯度的维生素D3干预，分别在第24，48，72小时采用CCK-8法检测细胞活力，筛选适宜的干预浓度。随后，同样采用CCK-8法于第24，48，72小时检测葡萄糖在3.75-120 mmol/L浓度下对细胞毒性的影响，并额外加入0.01 μmol/L-1 mmol/L浓度梯度的维生素D3进一步评估细胞活力。在相应检测时间点滴入CCK-8试剂，2 h后用酶标仪于450 nm处检测各孔的吸光度值。
1.4.3 实验分组 ①将HUC-MSCs随机分为以下3组：对照组、高糖组、高糖+维生素D3组。对照组加入新鲜的HUC-MSCs成骨诱导分化培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青链霉素、1% β-甘油磷酸钠、0.2%抗坏血酸和0.01%地塞米松)，高糖组在加入HUC-MSCs成骨诱导分化培养基的同时加入30 mmol/L葡萄糖，高糖+维生素D3组在加入HUC-MSCs成骨诱导分化培养基的同时加入30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L维生素D3。各组均成骨诱导分化14 d，每3 d更换1次新鲜的成骨诱导分化培养基。通过RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色检测ALP、OCN、RUNX2、COL1A1的mRNA和蛋白表达以及Nrf2/HO-1信号通路激活情况，通过茜素红染色判断HUC-MSCs的成骨分化能力，通过衰老半乳糖苷酶染色评估细胞衰老情况。②将HUC-MSCs随机分为以下4组：对照组、高糖组、高糖+维生素D3组、高糖+维生素D3+ML385组，对照组加入新鲜的HUC-MSCs成骨诱导分化培养基，高糖组在加入HUC-MSCs成骨诱导分化培养基的同时加入30 mmol/L葡萄糖，高糖+维生素D3组在加入HUC-MSCs成骨诱导分化培养基的同时加入30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L维生素D3，高糖+维生素D3+ML385组在加入HUC-MSCs成骨诱导分化培养基的同时加入30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L维生素D3+5 μmol/L Nrf2信号通路特异性抑制剂ML385。各组均成骨诱导分化14 d，每3 d更换1次新鲜的成骨诱导分化培养基。通过Western blot检测Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达，通过活性氧检测试剂盒及线粒体膜电位检测试剂盒分析细胞内活性氧积累情况和线粒体膜电位改变情况。

1.4.4 RT-qPCR检测将HUC-MSCs以2×103个/孔的密度接种于24孔板中，按照分组在诱导分化后的第14天使用RNA提取试剂盒从细胞中分离总RNA，通过反转录试剂盒进行反转录，并在荧光定量PCR仪上完成扩增程序。通过2−ΔΔCT方法计算基因表达水平，使用β-actin作为内参。引物序列如表1所示。

1.4.5 蛋白质印迹将HUC-MSCs以5×105个/孔的密度接种于10 cm直径的细胞培养皿中，按照分组在诱导分化后的第14天使用含有苯甲基磺酰氟的RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，然后通过BCA试剂盒检测蛋白浓度，通过凝胶电泳将蛋白样品转移到PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉于室温下封闭1 h，并与ALP(1∶500)、RUNX2(1∶500)、OCN(1∶500)、Col1A1(1∶1 000)、Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，将膜与二抗在室温下共同孵育1 h，通过扫膜仪使条带可视化，使用Image J软件(Version 1.8.0)进行蛋白定量。
1.4.6 免疫荧光染色将HUC-MSCs以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，按照分组在诱导分化后的第14天用40 g/L多聚甲醛固定30 min，在含 0.2% Triton X-100的PBS中通透10 min后与RUNX2(1∶100)或OCN(1∶50)一抗在4 ℃孵育过夜，然后将细胞与二抗在室温下孵育45 min，使用DAPI染细胞核。最后，使用荧光显微镜观察并拍照，Image J软件(Version 1.8.0)对荧光强度定量。
1.4.7 茜素红染色将HUC-MSCs以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，按照分组在诱导分化后的第14天去除培养基并使用体积分数95%乙醇固定10 min，然后用PBS洗3次后与茜素红S染色液在37 ℃烘箱中孵育30 min，随后用蒸馏水充分洗涤，在显微镜下观察和拍照。
1.4.8 β-半乳糖苷酶染色将HUC-MSCs以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，按照分组在诱导分化后的第14天用PBS洗涤细胞3次，将HUC-MSCs在β-半乳糖苷酶染色固定液中室温固定15 min，弃掉固定液，再次用PBS洗涤细胞，加入β-半乳糖苷酶染色工作液于37 ℃培养箱中孵育过夜，随后在光学显微镜下观察并拍照，每孔随机选取5个视野，让不清楚实验分组的研究人员对β-半乳糖苷酶阳性细胞进行人工计数。
1.4.9 活性氧测定将HUC-MSCs以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，按照分组在诱导分化后的第14天用PBS洗涤细胞3次，将DCFH-DA探针以1∶1 000比例配制成工作液，去除培养基后将细胞用PBS洗涤3次，将DCFH-DA工作液与细胞在37 ℃培养箱中避光孵育30 min，PBS洗涤后在荧光显微镜下观察，使用Image J软件(Version 1.8.0)对荧光强度定量。
1.4.10 线粒体膜电位检测将HUC-MSCs以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，按照分组在诱导分化后的第14天用PBS洗涤细胞3次，按照试剂盒的说明配置JC-1染色工作液以及JC-1染色缓冲液，去除培养基，将细胞与含有血清的JC-1染色工作液于CO2培养箱中孵育30 min，使用JC-1染色缓冲液洗涤，在荧光显微镜下观察并拍照，使用Image J软件(Version 1.8.0)对荧光强度定量。
1.5 主要观察指标通过检测COL1A1、ALP、RUNX2和OCN等成骨相关基因的mRNA及蛋白表达来评估高糖与维生素D3干预后HUC-MSCs成骨能力的变化，并探究HUC-MSCs是否出现活性氧积累、线粒体膜电位下降或细胞衰老。
1.6 统计学分析所有数据均以x±s表示，使用SPSS 22.0软件分析数据，使用GraphPad Prism 8.0软件绘图。对于连续变量，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过武汉大学人民医院生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症被认为是一种与年龄有关的常见代谢性骨病，显著增加了患者骨折、残疾甚至死亡的风险[28]。目前，骨吸收抑制剂被广泛用于治疗骨质疏松症，然而由于骨量丢失难以控制，其疗效不尽如人意[29]。间充质干细胞具有较强的成骨分化能力，已被公认为缓解骨质疏松的潜在策略[30]。向骨质疏松患者移植间充质干细胞后可直接增加骨组织内的间充质干细胞总数量、促进成骨分化、分泌多种趋化因子，从而有效提高骨密度，增加局部骨量和骨力学强度，改善局部骨质疏松状况[30]。HUC-MSCs具有创伤性小和增殖能力强等优势，然而高糖环境对其影响和治疗作用尚不明确[29]。糖尿病骨质疏松症是糖尿病最重要的并发症之一，高浓度和长期接触葡萄糖会通过复杂的信号通路对骨骼等器官造成氧化应激损伤[31]。在该研究中，高糖环境明显抑制了HUC-MSCs的增殖，下调了成骨细胞标志物COL1A1、ALP、RUNX2和OCN的表达，并导致HUC-MSCs氧化应激、线粒体功能障碍及细胞衰老，而补充维生素D3减弱了高糖对HUC-MSCs成骨分化的不良影响。该研究结果提示，高糖环境可能是糖尿病骨质疏松症患者在临床上接受HUC-MSCs输注的巨大挑战，因为这可能导致HUC-MSCs在骨组织中的成骨分化进程延缓或中断，而适当补充维生素D3可能通过减轻HUC-MSCs受到的氧化应激损伤来恢复成骨分化过程。
众所周知，氧化应激是骨骼老化和骨质疏松的主要原因[32]。研究表明，氧化应激诱发的活性氧积累和线粒体功能障碍是干细胞活力下降的主要原因[33]，纠正氧化应激能够促进干细胞成骨分化、减轻细胞凋亡和预防骨骼衰老[34]。细胞衰老代表永久性细胞生长停滞状态，氧化应激导致的损伤DNA分子积累是其主要原因[28]。Nrf2是一种有效的活性氧清除剂，能够稳定而持久地阻断氧化应激，其激活被认为可以抑制细胞衰老，而HO-1是Nrf2的代表性下游靶点[14]。该研究结果与以往的研究结果一致，表明高糖处理导致了HUC-MSCs的氧化应激、线粒体功能障碍和细胞衰老，主要表现为活性氧荧光积累、异常的JC-1聚合物/单体比率及β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数增高。令人惊讶的是，补充维生素D3能够通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻高糖诱发的氧化应激，进而延缓HUC-MSCs衰老。
维生素D在维持骨骼健康中重要发挥重要作用。维生素D缺乏会导致甲状旁腺激素分泌增加，从而导致患者的骨转换率升高和骨吸收增加，最终导致骨质疏松的发生[35]。而补充维生素D可以促进钙吸收并改善骨质疏松患者的骨量[36]。维生素D3可以在人体内转换成1,25(OH)2D3，在骨骼发育中起着关键作用[37]。研究表明，适当补充维生素D3可减少老年人的髋部骨折和非椎骨骨折[38]，并增强利塞膦酸钠等口服药物治疗骨质疏松的疗效[39]。既往研究证实，1,25(OH)2D3能够显著改善成骨细胞中OCN和Runx2等成骨表型标记，并在体内挽救了糖尿病诱导的骨质流失[40]。与1,25(OH)2D3相比，维生素D3具有更高的安全性，成为多数临床医生补充维生素D的首选[20]。然而，维生素D3对糖尿病骨质疏松症的治疗作用及具体机制仍不明确。此研究首次证实了维生素D3能够减轻高糖诱导的HUC-MSCs氧化应激和细胞衰老，从而恢复被高糖环境抑制的HUC-MSCs成骨分化障碍。此外，该研究提示通过补充维生素D3等方式可能增强临床上糖尿病骨质疏松症患者HUC-MSCs输注效果，为糖尿病骨质疏松症的临床诊治提供了新的理论基础。
综上所述，该研究通过系列实验验证了维生素D3能够逆转高糖环境诱导的HUC-MSCs成骨分化潜能减退、氧化应激、线粒体功能障碍和细胞衰老。研究结果阐明了HUC-MSCs通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻高糖诱导的氧化应激的分子机制，为维生素D3和HUC-MSCs联合治疗方案在糖尿病骨质疏松症患者中的临床应用提供了理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

维生素D3减轻高糖暴露诱导氧化应激促进人脐带间充质干细胞的成骨分化

Vitamin D3 attenuates high-glucose exposure-induced oxidative stress to promote osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells

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[1]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[2]	王雯, 郑芃芃, 孟浩浩, 刘浩, 袁长永. 过表达Sema3A促进牙髓干细胞和MC3T3-E1的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 993-999.
[3]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[4]	谢婷, 刘婷婷, 曾雪慧, 李亚敏, 周庞虎, 易念华. 岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3609-3614.
[5]	韩月, 王雨菲, 刘婉晴, 董明, 牛卫东. 淫羊藿苷在炎症环境下对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3709-3714.
[6]	袁长深, 廖书宁, 李哲, 吴思萍, 陈乐伟, 刘晋邑, 李彦宏, 段戡. 机器学习联合生物信息学鉴定骨关节炎细胞衰老关键基因及验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3196-3202.
[7]	王倩, 卢子昂, 李利和, 吕超亮, 王盟, 张存鑫. 青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 224-230.
[8]	陈思敏, 胡颖俊, 闫文睿, 冀乐, 邵梦丽, 孙泽, 郑红星, 祁珊珊. 链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的构建及评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 237-241.
[9]	郭琴, 吴敏敏, 陶莹. 氧化修饰高密度脂蛋白激活活性氧启动p38信号促使大鼠卵巢颗粒细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3055-3060.
[10]	宋悦, 舒晴, 贾绍辉, 田峻. 光生物调节诱导间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3069-3075.
[11]	吴雅茹, 米焱, 魏凯悦, 高和平, 张丁予, 王彩丽. 人脐带间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肠道屏障功能的调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 2967-2973.
[12]	苟秋童, 罗文豪, 王频, 兰玉燕, 刘敏, 黄海霞. 黄连素在高糖环境下促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 2974-2980.
[13]	韩维娜, 徐晓庆, 史晋宁, 李欣儒, 蔡红艳. 胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2568-2573.
[14]	谢恒, 顾叶, 顾赢楚, 吴泽睿, 方涛, 王秋霏, 彭育沁, 耿德春, 徐耀增. 骨骼疾病中的铁死亡：骨质疏松治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2613-2618.
[15]	卞璐, 夏丹丹, 钱源, 史雯, 阙云端, 吕龙, 徐爱花, 史文涛. 纳米二氧化锆对鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2346-2350.