1.1 设计 体外细胞实验。组间差异采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2021年10至2022年11月在西南医科大学口腔颌面修复重建和再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠20只，2周龄，体质量80-100 g，购买于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2020-030，实验单位使用许可证号：SYXK(川) 2018-065，西南医科大学实验动物福利伦理审查表编号：NO: 20211118-032、NO: 20211015-006。实验过程最大限度减少动物痛苦。
1.3.2 主要试剂 青霉素-链霉素溶液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国，碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(德国，PAN公司)；胰蛋白酶消化液(美国，Gibco公司)；α-MEM基础培养液(美国，Hyclone公司)；黄连素、地塞米松、β-甘油磷酸钠、胰岛素、抗坏血酸、吲哚美辛、IBMX、1%茜素红染色液、油红O染色液(中国，Solarbio科技有限公司)；碱性磷酸酶测定试剂盒(中国，南京建成生物研究工程所)。快速RNA提取试剂盒(中国，艾科瑞生物科技有限公司)；PCR引物(中国，武汉天一华煜基因科技有限公司)；PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(日本，Takara公司)；RIPA(强)组织细胞快速裂解液(中国，Solarbio科技有限公司)；β-catenin抗体、AMPK抗体、Phospho-AMPKα抗体(英国，Abcam公司)。Dorsomorphin(Compound C，CC)(美国，MCE公司)；N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)(中国，索莱宝科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠BMSCs的分离培养 大鼠吸入式麻醉后脱颈处死，分离股骨与胫骨，双抗+PBS清洗后剪断骨头两端的骨骺，α-MEM培养液冲洗骨髓腔并收集冲洗液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入α-MEM完全培养液重悬，将细胞悬液接种于培养瓶中，放置于37 ℃、体积分数为5% CO2恒温孵育箱内培养，显微镜下观察细胞生长情况，2 d后进行半量换液，此后每2 d全量换液1次，待细胞汇合度达90%时，按1∶2传代。第3代细胞用于后续所有实验。
1.4.2 流式细胞术鉴定BMSCs 取第3代BMSCs，弃培养基后PBS清洗，胰酶消化，收集细胞悬液并计数，将细胞浓度调整为1×108 L-1，分别加入CD29、CD34、CD45、CD90抗体各100 μL，空白对照组不加入抗体，室温避光孵育30 min，上流式细胞仪进行检测，并用FCS Express软件进行结果分析。
1.4.3 BMSCs成骨分化检测 取第3代处于生长对数期的BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞后，以2×104/cm2密度接种于6孔板中，待细胞汇合度达80%时，弃去原有培养液，加入2 mL成骨诱导液(含10-7 mol/L地塞米松、10-2 mol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、体积分数10%胎牛血清的α-MEM基础培养基)，每3 d更换1次成骨诱导液。诱导21 d后，弃去培养液，PBS轻柔清洗3次，每次5 min，每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，双蒸水清洗3次，每次5 min，加入茜素红染料(pH=4.2)，室温下避光染色30 min，双蒸水清洗去除多余染料直到双蒸水中无色素，显微镜下观察拍照。
1.4.4 BMSCs成脂分化检测 取第3代处于生长对数期的BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞后，以2×104/cm2密度接种于6孔板中，待细胞汇合度达100%时，弃去原有培养液，加入2 mL成脂诱导液A液，3 d后更换为2 mL成脂诱导液B液，按上述方法不断循环连续培养21 d后，弃去培养液，PBS轻柔清洗3次，每次5 min，每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，PBS清洗3次，每次5 min，加入1 mL红油O染料，室温下避光染色30 min，PBS清洗去除多余染料直到PBS中无色素，显微镜下观察拍照。
1.4.5 CCK-8法检测BMSCs增殖活力 取第3代处于生长对数期的BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞后，以3×103/孔密度接种于96孔板，分为5组，每组3个副孔，分别为正常对照组(培养基葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)，高糖组(培养基葡萄糖浓度为35 mmol/L)，高糖+1 µmol/L黄连素组，高糖+5 µmol/L黄连素组，高糖+10 µmol/L黄连素组。第2天弃去原有培养液，按上述分组加入不同的完全培养基，培养第3，5，7天加入CCK-8工作液，避光孵育2 h，使用酶标仪在波长450 nm处检测吸光度值。
1.4.6 BMSCs的碱性磷酸酶活力检测 取第3代处于对数生长期的BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞后，以2×104/cm2密度接种于12孔板，分为4组，每组3个副孔，分别为正常对照组、高糖组、高糖+黄连素组(黄连素浓度为10 µmol/L)、高糖+黄连素+AMPK抑制剂组(黄连素浓度为10 µmol/L，AMPK抑制剂Dorsomorphin浓度为5 µmol/L)。待汇合度达80%时，弃去原有培养基，按上述分组加入成骨分化诱导液，避光培养，每3 d更换1次成骨诱导培养液。待培养7 d后，弃去孔内培养基，每孔加入500 µL细胞裂解液，室温下静置1 h，将孔内的裂解液转入标记好的无菌EP管中。按试剂盒步骤检测细胞内碱性磷酸酶活力，反应体系见表1。
1.4.7 BMSCs茜素红染色 取第3代处于对数生长期的BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞后，以2×104/cm2密度接种于6孔板，分组同1.4.6，待细胞汇合度达80%时，弃去原有培养基，按上述分组加入成骨分化诱导液，避光培养，每3 d更换1次成骨诱导培养液。连续诱导21 d后，弃去培养基，PBS轻柔清洗3次，每次5 min，每孔加入1 mL 40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，双蒸水清洗3次，每次5 min，加入茜素红染料(pH=4.2)，室温下避光染色30 min，双蒸水清洗去除多余染料直到双蒸水中无色素，显微镜下观察拍照。
1.4.8 活性氧荧光探针检测BMSCs内活性氧水平 取第3代处于生长对数期的BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞后，以2×104/cm2密度接种于6孔板，分为5组，每组设置3个副孔，分别为正常对照组、高糖组、高糖+NAC组(特异性抗氧化剂NAC浓度为500 µmol/L)、高糖+黄连素组(黄连素浓度为10 µmol/L)、高糖+黄连素+AMPK抑制剂组(黄连素浓度为10 µmol/L，Dorsomorphin浓度为5 µmol/L)，于恒温孵育箱内培养。第2天吸净原有培养基，按上述分组加入含不同药物的完全培养基培养48 h。按1∶1 000的比例将活性氧荧光探针溶液加入基础培养基中，配置成终浓度为10 µmol/L的活性氧荧光探针溶液。取出6孔板，每孔加入1 mL活性氧荧光探针溶液，放入孵育箱避光孵育30 min，孵育结束后，弃去活性氧荧光探针溶液，使用α-MEM清洗细胞3遍，于荧光显微镜下观察拍照。Image J软件对荧光图片进行半定量分析。
1.4.9 PCR检测成骨相关基因水平 取第3代处于对数生长期的BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞后，以2×104/cm2密度接种于6孔板，分组同1.4.6。待细胞汇合度达80%时，弃去原有培养基，按上述分组加入成骨分化诱导液，避光培养，每3 d更换1次成骨诱导培养液。待培养7 d后提取细胞总RNA。使用总RNA样本进行反转录和定量检测。q-PCR部分使用到的引物均参照GenBank上的引物序列，由武汉天一华煜基因科技有限公司合成。以β-actin为内参，各基因引物序列如表2所示。
1.4.10 Western blot检测p-AMPK和AMPK的表达 根据1.4.6中分组进行成骨诱导7 d后，使用细胞裂解液提取细胞内总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。使用上样缓冲液稀释样本并煮沸10 min。SDS-PAGE电泳分离样品，湿转法将蛋白从凝胶转至PVDF膜，室温下奶粉慢速摇床封闭1 h，将膜与一抗(anti-p-AMPK、anti-AMPK、anti-β-actin，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日TBST漂洗后，室温下加入对应二抗慢速摇床孵育1 h，TBST洗去多余抗体后加入发光液，凝胶成像系统中曝光蛋白条带，使用Image J软件分析目的蛋白条带的灰度值。
1.5 主要观察指标 ①大鼠BMSCs的形态及其成骨、成脂诱导分化潜能；②黄连素在正常/高糖微环境下对BMSCs增殖的影响；③黄连素在正常/高糖微环境下对BMSCs内碱性磷酸酶活性和钙化结节的影响；④黄连素在正常/高糖微环境下对BMSCs内活性氧水平的影响；⑤黄连素在正常/高糖微环境下对BMSCs成骨标志基因mRNA表达的影响；⑥黄连素在正常/高糖微环境下对AMPK信号通路相关蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析 采用SPSS 26.0中的单因素方差分析方法(One-Way ANONA)进行相关数据处理，结果用x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。每项实验重复3次。该文统计学方法已经西南医科大学生物统计学专家审核。
