兔肩袖腱骨愈合过程中基质细胞衍生因子1的表达及作用机制

doi:10.12307/2024.157

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 3049-3054.doi: 10.12307/2024.157

• 细胞相关实验/试验研究Cell related experimental/trial studies • 上一篇下一篇

兔肩袖腱骨愈合过程中基质细胞衍生因子1的表达及作用机制

王旭1，2，吴亚洁1，2，张鑫福1，2，石志2，3，杨腾云2，4，熊波涵2，4，卢晓君2，4，赵道洪1，2

1昆明医科大学第二附属医院骨科，云南省昆明市 650000；2昆明医科大学，云南省昆明市 650500；昆明医科大学第一附属医院，3骨科，4运动医学科，云南省昆明市 650000

收稿日期:2023-03-27 接受日期:2023-05-15 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-26
通讯作者: 赵道洪，博士，副主任医师，昆明医科大学第二附属医院骨科，云南省昆明市 650000；昆明医科大学，云南省昆明市 650500
作者简介:王旭，女，1996年生，吉林省辽源市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事骨关节病的临床治疗及腱骨愈合的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960412)，项目负责人：赵道洪；云南省科技厅科技计划项目[2019FE001(-065)]，项目负责人：赵道洪；云南省卫生健康委员会医学后备人才培养计划(H-2019013)，项目负责人：赵道洪；昆明医科大学2023年研究生创新基金项目(2023S091)，项目负责人：王旭

Expression and action mechanism of stromal cell-derived factor 1 in tendon-bone healing of rabbit rotator cuff

Wang Xu1, 2, Wu Yajie1, 2, Zhang Xinfu1, 2, Shi Zhi2, 3, Yang Tengyun2, 4, Xiong Bohan2, 4, Lu Xiaojun2, 4, Zhao Daohong1, 2

1Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China; 2Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 3Department of Orthopedics, 4Department of Sports Medicine, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China

Received:2023-03-27 Accepted:2023-05-15 Online:2024-07-08 Published:2023-09-26
Contact: Zhao Daohong, MD, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China; Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
About author:Wang Xu, Master candidate, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China; Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960412 (to ZDH); Science and Technology Plan Project of Yunnan Provincial Department of Science and Technology, No. 2019FE001(-065) (to ZDH); Yunnan Provincial Health Commission Medical Reserve Talent Training Program, No. H-2019013 (to ZDH); 2023 Graduate Innovation Fund Project of Kunming Medical University, No. 2023S091 (to WX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

腱骨愈合：腱骨指肌腱组织和骨组织移行连接处，目前腱骨愈合领域研究多集中于膝关节中的前交叉韧带、肩关节中的肩袖、足踝中的跟腱等，理想愈合为纤维软骨组织与骨组织附着处恢复原有的4层结构，即致密纤维结缔组织、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨组织。
基质细胞衍生因子1(stroma-cell derived factor-1，SDF-1)：又称趋化因子CXCL12，是CXC趋化因子家族的一员，在胚胎发育中可以趋化造血干细胞从胎儿肝脏迁移到骨髓，其主要受体为CXCR4，两者的结合可被AMD3100抑制。

背景：近年在腱骨损伤领域部分学者将基质细胞衍生因子1搭载在组织工程支架上用以促进腱骨愈合，取得了较好的成效，但在基质细胞衍生因子1促进腱骨愈合机制及自然愈合过程中其是否参与修复，目前尚未明确。

目的：研究兔肩袖全层冈上肌断裂后腱骨愈合过程中基质细胞衍生因子1表达，及其在腱骨损伤时对干细胞的迁移作用和最佳体外促迁移浓度。
方法：随机取成年新西兰大白兔18只建立肩袖损伤模型，另取3只为空白对照。于造模后3，5，7，14，21，28 d各处死3只并处死空白组兔，取腱骨连接处组织保存在-80 ℃冰箱。应用ELISA反应检测损伤后各时间点愈合处基质细胞衍生因子1表达。取幼兔股骨骨髓间充质干细胞分离培养鉴定，通过transwell实验验证基质细胞衍生因子1对干细胞的促迁移作用效果及体外促迁移最佳浓度，将培养到P3代的干细胞与Brdu共培养后注入兔耳缘静脉，通过免疫组化染色验证干细胞是否迁移至损伤处。

结果与结论：①基质细胞衍生因子1在肩袖腱骨愈合过程呈双峰表达，于伤后3 d 明显增高(P < 0.01)随后下降，于伤后5 d达最低，后再次升高于伤后14 d 达峰值(P < 0.01)，然后下降；②细胞免疫组化染色可见标记有Brdu的干细胞确有迁移至损伤处；③transwell实验结果表明60-80 ng/mL的基质细胞衍生因子1对干细胞促迁移效果最好，而200 ng/mL浓度反而会起到抑制迁移作用；④基质细胞衍生因子1参与了肩袖腱骨愈合的炎症反应期和增殖期的愈合过程，其作用机制可能为通过促进干细胞迁移至损伤处并分化为各类细胞促进修复，并且基质细胞衍生因子1的促迁移作用存在于一定浓度范围，超出范围则可能起到抑制作用。

https://orcid.org/0000-0002-0169-3289 (王旭)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肩袖大撕裂, 腱骨愈合, 基质细胞衍生因子1, 骨髓间充质干细胞, 兔

Abstract: BACKGROUND: In recent years, some scholars in the field of tendon bone injury have attached stromal cell-derived factor 1 to tissue engineering scaffolds to promote tendon bone healing, and achieved good results. However, whether stromal cell-derived factor 1 promotes tendon bone healing mechanisms and participates in the repair of natural healing has not yet been defined.
OBJECTIVE: To study the expression of stroma-cell derived factor 1 during tendon bone healing after rupture of the whole supraspinatus muscle of the rabbit rotator cuff and its migration effect and optimal in vitro migration promoting concentration on stem cells during tendon bone injury.
METHODS: Totally 18 adult New Zealand rabbits were randomly selected to establish rotator cuff injury models, and an additional 3 rabbits were selected as blank controls. At 3, 5, 7, 14, 21, and 28 days after modeling, three rabbits were executed separately and the rabbits in the blank group were sacrificed. The tissues of tendon bone junction were taken and stored in a -80 ℃ refrigerator. The expression of stromal cell-derived factor 1 was detected by ELISA at each time point after injury. Mesenchymal stem cells were isolated from the bone marrow of young rabbit femur, cultured, and identified. Transwell assay was performed to verify the migration-promoting effect of stromal cell-derived factor 1 on stem cells and the optimal migration-promoting concentration in vitro. The stem cells cultured to P3 were co-cultured with BrdU and injected into the rabbit ear marginal vein, and immunohistochemical staining was used to verify whether the stem cells migrated to the injury site.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Stromal cell-derived factor 1 gene expression was bimodal during rotator cuff tendon bone healing. Stromal cell-derived factor 1 gene expression increased significantly at 3 days post-injury (P < 0.01) and then decreased, reaching a minimum at 5 days post-injury. It increased again and reached a peak 14 days after injury (P < 0.01) and then decreased. (2) Cell immunohistochemical staining displayed that stem cells labeled with BrdU did migrate to the injury site. (3) The results of the transwell experiment exhibited that 60-80 ng/mL stromal cell-derived factor 1 had the best effect on promoting migration of stem cells, while a concentration of 200 ng/mL inhibited migration. (4) Stromal cell-derived factor 1 is involved in the healing of rotator cuff tendon bone during the inflammatory response phase and the proliferation phase. The mechanism of action may be to promote the migration of stem cells to the injury and their differentiation into various types of cells to promote repair. In addition, the pro-migration effect of stromal cell-derived factor 1 exists at a range of concentrations, beyond which it may act as an inhibitor.

Key words: large rotator cuff tear, tendon bone healing, stromal cell-derived factor 1, bone marrow mesenchymal stem cell, rabbit

中图分类号:

王旭, 吴亚洁, 张鑫福, 石志, 杨腾云, 熊波涵, 卢晓君, 赵道洪. 兔肩袖腱骨愈合过程中基质细胞衍生因子1的表达及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3049-3054.

Wang Xu, Wu Yajie, Zhang Xinfu, Shi Zhi, Yang Tengyun, Xiong Bohan, Lu Xiaojun, Zhao Daohong. Expression and action mechanism of stromal cell-derived factor 1 in tendon-bone healing of rabbit rotator cuff[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 3049-3054.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析用于动物造模和对照的21只兔及用于动物体内实验的6只兔，实验过程均无脱失，全部计入结果分析。
2.2 动物模型建立结果实验建立的肩袖冈上肌全层离断模型具有较好的均一性，位置深度较为统一，经骨道固定冈上肌肌腱可达到稳定固定、不易脱落，见图2；在术后取材时可见腱骨恢复良好，3 d时取材可见少量炎性细胞浸润，7，14 d取材多见新生血管形成肉芽组织包裹，21，28 d基本已形成瘢痕纤维连接。

2.3 ELISA法检测损伤后SDF-1表达情况经吸光度计算代入标准曲线得到不同时间点组织中SDF-1含量。SDF-1在正常腱骨组织中有少量表达，而在损伤后表达增加，呈双峰样增加，于伤后3 d达到第1个高峰后逐渐下降，后于14 d达到第2个高峰并缓慢回落，但伤后最低表达水平仍高于正常腱骨组织，见图3。

2.4 BMSC分离培养鉴定
(1)原代培养：原代培养48 h后可见细胞成长梭形细长零星分布，逐次换液后细胞逐渐增多密集，培养9 d后传代至培养瓶内，生长速度明显变快，成漩涡状聚集，见图4A。
(2)成脂、成骨分化：体外成脂诱导分化过程中可见圆形透明脂滴逐渐变大，14 d后可见明显脂滴，油红O染色显现红色，见图4B；成骨诱导分化过程中可见细胞表面钙盐沉积，21 d后茜素红染色见橘红色钙结节沉积，见图4C。

(3)流式细胞仪检测：流式细胞仪检测表面标志物CD34、CD45、CD44、CD29，其中CD44、CD29呈阳性，表达率高于90%；CD34、CD45呈阴性，表达率低于1%，见图5。

2.5 Brdu共培养后免疫组化检测结果 Brdu共培养后进行细胞免疫组化染色，可见Brdu已成功导入干细胞内；注射Brdu-BMSC后的离断造模处组织取材、切片、免疫荧光染色可见荧光，而未损伤的对照组无荧光，表明损伤后的肩袖腱骨结合部位确有募集干细胞作用，见图6。

2.6 Transwell最佳迁移浓度测定结果不同质量浓度的SDF-1对BMSC的迁移作用有明显不同，倒置显微镜下400倍随机选5个视野观察细胞计数。结果可见，在100 ng/mL质量浓度内均有明显促迁移作用，而125 ng/mL时迁移作用并不明显，200 ng/mL时迁移作用反而受到抑制，迁移细胞数少于空白组，实验所设置的浓度中60-80 ng/mL的迁移效果最佳，见图7。

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引言

肩袖损伤往往累及整个肌-腱-骨复合体，其中肌腱和腱-骨界面是最常损伤的部位[1]。随着关节镜技术的发展，很大一部分患者通过手术治疗，肩袖疼痛获得了很好的改善，但肩关节功能改善并不理想[2-3]。肩袖腱骨愈合因存在肌腱与骨2种不同组织相连，涉及4种结构过渡区：肌腱、纤维软骨、矿化纤维软骨和骨[1]，始终是国内外骨科及运动医学医生治疗领域的难题。常规的手术疗法多形成纤维瘢痕愈合[4]，常常难以起到原有的力学分散效果，在合并症(即糖尿病、肥胖)、年龄、撕裂大小、撕裂肌腱数量等影响下临床结局更加不尽人意[5]。随着研究的进一步推进，具有多向分化能力的干细胞在腱骨愈合治疗中展示出了良好的发展前景[6]。有实验通过在关节镜术中使用肱骨头穿刺技术来获取骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)以此避免二次伤害[7]，干细胞条件培养基也在另一项腱骨愈合实验中起到了很好的效果[8]，肌腱干细胞本身来源于肌腱，并且增殖能力比BMSC更快，其研究在近年来也逐渐兴起[9-11]。然而体外输注干细胞始终具有来源稀少和不可控分化的风险[12]，因此如何调动自身干细胞归巢在临床治疗中似乎更为实用。
基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是迄今发现对干细胞募集最有效的趋化因子之一，它在人脑、肺、心脏、肠道、肾脏、肝脏、骨骼肌、软骨、骨髓等组织中均有表达，在具体的血管内皮细胞、成骨细胞和成纤维细胞中也检测到了SDF-1的存在[13-14]。近年在腱骨损伤领域部分学者将SDF-1搭载在新型组织工程支架上用以促进腱骨愈合[15-16]，取得了较好的成效，但在SDF-1促进腱骨愈合机制及自然愈合过程中SDF-1是否在此部位参与修复过程，国内外鲜有研究。该实验旨在通过测定损伤后SDF-1的表达变化规律探究肩袖腱骨自然愈合过程中SDF-1的作用，同时验证在肩袖这一部位的腱骨愈合中干细胞确有归巢效应，同时通过测定SDF-1的最佳促迁移浓度为后续实验奠定基础、提供参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞实验，随机对照动物实验。①建立新西兰大白兔肩袖损伤模型，观察不同时间点局部SDF-1水平变化。②提取幼兔BMSC，与Brdu共培养；将培养后细胞注入肩袖损伤模型兔体内，免疫荧光分析损伤处干细胞的归巢结果。③进行transwell小室迁移实验，验证不同浓度SDF-1促干细胞迁移的作用效果。④多组间均数的比较采用单因素方差分析，2组比较采用独立样本t 检验。实验流程如图1。

1.2 时间及地点实验于 2022年 4-12月在昆明医科大学科研孵化中心进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物普通型雄性3月龄新西兰大白兔27只，体质量2.0-3.0 kg；1月龄普通型新西兰大白兔幼兔用于提取BMSC，实验动物均由昆明医科大学实验动物部提供。
1.3.2 实验用主要试剂和仪器 α-MEM培养基(Gibco，美国)；血清(全式金，中国)；5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)、双抗(biosharp，中国)；BMSC成骨分化培养基、BMSC成脂分化培养基(赛业，中国)；transwell小室(Corning，美国)；AMD3100(源叶生物公司)；兔基质细胞衍生因子1(SDF-1)酶联免疫分析试剂盒(酶免，中国)；无血清细胞冻存液(Biosharp，中国)；anti-Brdu antibody(博士德公司)；Alexa Fluor 594 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(affinity公司)；荧光封固剂(北京中山金桥，中国)；组织切片机(Leica，德国)；共聚焦激光扫描显微镜(Nikon，日本)；流式细胞仪(BD公司，美国)。
1.4 方法

1.4.1 动物模型建立随机抽取18只3月龄大白兔于同一环境下应用3%戊巴比妥1 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，麻醉后备皮肩关节周围10 cm×10 cm，放置于洁净手术台上消毒、铺无菌洞巾，在肩关节正上方做一2 cm纵行切口，将下方三角肌钝性分离后可见明显冈上肌与冈下肌腱骨附着点，用一缝合线固定肌腱避免离断后回缩，于冈上肌肱骨止点处切断全层冈上肌肌腱，并在肱骨头处打一横行骨道，肱骨骨面新鲜化后，将肌腱断端经骨道固定于新鲜化的肱骨头上，逐层缝合，肌肉注射青霉素20 U持续3 d。在术后3，5，7，14，21，28 d分别随机麻醉3只处死，并取剩余3只未手术组作为正常对照，共21个肩袖腱骨结合处组织样本于-80 ℃冰箱保存，用于后续检测。

1.4.2 ELISA检测腱骨结合组织SDF-1蛋白含量分别于上述不同时间点，麻醉后剥离兔冈上肌及肱骨，准确取材腱骨愈合处组织样本，经液氮冷冻RIPA裂解法提取总蛋白，离心取上清液根据BCA方法检测蛋白含量，确定上样量，按ELISA试剂盒说明书步骤操作并绘制标准曲线，计算不同时间点取材的样本中SDF-1蛋白含量。
1.4.3 BMSC分离培养鉴定取1月龄普通型新西兰大白兔幼兔，耳缘静脉空气栓塞处死后，备皮、消毒、铺单、切开，取出双侧股骨且保证两端关节腔未开放，放置于乙醇内浸泡消毒，转移至超净台，用高压灭菌器械小心剥离剩余肌肉组织，手术剪打开两侧关节，5 mL注射器吸取低糖DMEM完全培养基冲洗股骨腔内骨髓至培养皿中，使用移液枪多次冲打培养皿使骨髓分散均匀，静置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每3 d换液1次，待培养至皿底70%面积时传代至培养瓶中，传代至第3代时观察细胞形态，并种植于6孔板中，分别加入成骨、成脂诱导培养基。成骨诱导培养基主要成分为：基础培养基、胎牛血清、双抗、地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C；成脂诱导培养基主要成分为：A液包括基础培养基、胎牛血清、诱导分化添加物A-Ⅰ、诱导分化添加物A-Ⅱ；B液包括基础培养基、胎牛血清、诱导分化添加物B。按说明书换液继续培养至规定天数，染色观察。同时取P3代细胞进行流式细胞仪检验CD29、CD44、CD34、CD45分子的表达。
1.4.4 细胞Brdu共培养并注入模型兔体内取P3代兔BMSC，以含有10 μmol/L Brdu的完全培养基培养孵育24 h(完全培养基：体积分数10%血清+89%αMEM+1%双抗)，细胞免疫组化染色观察Brdu是否转入干细胞，另取共培养后细胞消化、离心，用磷酸盐缓冲液(PBS)混悬并调整浓度，制成Brdu-BMSC，冰上备用。
取6只成年新西兰大白兔随机分为2组：模型组兔如1.4.1的方式行冈上肌肌腱切开缝合建立肩袖损伤模型，空白对照组兔不进行造模。2组兔分别于耳缘静脉注射Brdu标记的干细胞，每只兔注射一瓶T75长满所包含细胞约1×106 Brdu-BMSC，术后当天注射1次。10 d后于冈上肌肌腱损伤模型造模处取材。
1.4.5 细胞Transwell迁移及定量实验取24孔板transwell小室，取P3代BMSC消化离心后，用细胞计数板计数，无血清培养基(99%αMEM+1%双抗)调整细胞浓度为2×108 L-1。
transwell小室上室加入用无血清培养基调整浓度为2×108 L-1的P3代干细胞600 μL，下室分别加入含50，60，80，100，125，250 ng/mL SDF-1α的富血清培养基(20%血清+ 79%αMEM+1%双抗)800 μL；并另设置一组上室内容物不变、下室含有50 ng/mL SDF-1α的富血清培养基800 μL并加入1 μg/mL的AMD3100(CXCR4趋化因子受体拮抗剂)抑制其作用，每组设置2个复孔。操作中避免上下层薄膜之间产生气泡，全程于超净台内无菌操作。随后放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养12 h，取出孔板，去除培养基，并冲洗两三遍后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗后用0.1%结晶紫染液染色，棉签擦去上层未迁移细胞，置于显微镜下观察。
1.4.6 免疫组化检测Brdu导入干细胞及损伤组织干细胞归巢结果 ①按步骤1.4.4共培养后应用细胞免疫组化法检测Brdu是否成功导入干细胞。具体步骤为40 g/L多聚甲醛固定共培养后的干细胞，PBS漂洗3次，1.5 mol/L HCl室温孵育30 min，PBS漂洗后在封闭液中封闭30 min，吸干漂洗后加入配置好的一抗(anti-Brdu antibody，1∶200)4 ℃孵育过夜，隔日取出，PBS清洗3次加入荧光素偶联二抗[Alexa Fluor 594 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) ，1∶200]避光室温孵育2 h，漂洗后加入DAPI孵育5 min，显微镜下观察。②将模型组兔静脉注射Brdu共培养干细胞，10 d后的采样组织制成切片后用同样免疫荧光方法染色观察损伤组织干细胞归巢结果。
1.5 主要观察指标 ①损伤后各时间点兔愈合处 SDF-1的表达；②兔间充质干细胞鉴定结果；③SDF-1对干细胞的促迁移效果及体外促迁移最佳浓度；④Brdu共培养干细胞兔体内注射观察损伤处干细胞归巢结果。
1.6 统计学分析实验数据采用 SPSS 23.0、GraphPad Prism 6.0统计软件进行分析。所有统计学分析结果均采取x±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，2组比较采用独立样本t检验，以 P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经昆明医科大学生物统计学专家审核。

讨论

随着体育活动的全面展开和人口老龄化加剧，肩袖损伤人群逐年增多。而手术失败率居高不下使其治疗始终是一大挑战。冈上肌肌腱因其特殊的解剖位置和止点处缺少血供的生理特点，是肩袖中最容易发生损伤的肌腱[17]，因此，此次实验选用兔冈上肌肌腱为研究对象，并同时兼顾了兔前肢并非主要负重部位这一与人体相似的特点[18]。腱骨结合部位因其特殊的移行结构难以在手术后得到原有解剖结构，Sharpey纤维生成替代了微观结构的逐渐变化，允许机械应变、应力分布和有效的能量转换的功能也随之消失[19]。为真正地恢复其原有结构，在基础科研领域，广大学者将富血小板血浆[20]、细胞因子[21]、干细胞[22]、外泌体[23]、生物支架和基因治疗等技术运用到促进肌腱-骨愈合的基础研究中[24-25]，并取得了良好的疗效。但腱骨愈合阶段各细胞因子时空交替，复杂的层级关系尚未明确。了解肩袖损伤后原位局部微观生理变化将为进一步运用生物学方法促进腱骨愈合打下坚实基础。
SDF-1作为趋化蛋白基质细胞衍生因子，主要通过与G蛋白偶联受体CXC趋化因子受体4 (CXCR4)结合共同发挥作用，其促干细胞归巢功能已多次在不同组织中得到印证，如牙周、角膜、心血管、软骨等[26]。在腱骨愈合领域研究较少，但近年有数位国内外研究者利用组织工程方法将SDF-1通过不同介质植入腱骨损伤局部以求达到促进腱骨愈合的目的，得到了很好的成效[15-16]。决定腱-骨界面完美愈合的主要因素是血管和骨的形成[27]，有研究表明SDF-1可能通过下调miR-339-3p促进BMSC成骨并增加其存活率[28]。不仅如此，一项在的小鼠皮肤伤口的研究中发现在加载了SDF-1的组别中骨髓来源细胞明显增多的同时抗炎单核细胞也有所增加，在第7天结果的对比中M2样巨噬细胞明显多于未加载SDF-1组，M2巨噬细胞有助于组织愈合、血管生成[29]，这一结果说明SDF-1/CXCR4在具有趋化作用的同时，它也可以通过免疫调节功能参与局部抗炎作用。在一项半月板缺损的研究中也得到了类似的实验结果[30]。
此次实验发现在正常肩袖腱骨组织中已有SDF-1存在，在肩袖愈合阶段SDF-1的含量成双峰样增加，峰值集中于3 d和14 d，在此后逐渐趋近于损伤前含量，这与以往在皮肤及口腔愈合中的研究结果相似，但时间点略有延后[31-32]。第一个高峰出现在腱骨修复的炎症期，这可能与损伤后局部组织缺血、缺氧有关。在早期研究中发现缺氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)连接到SDF-1启动子上，可以增加SDF-1 mRNA表达，缺血组织中SDF-1的选择性体内表达与氧张力降低成正比[33-34]，猜测这一机制在肩袖腱骨愈合中SDF-1第一高峰的形成中也发挥着一定作用。近期一项在糖尿病伤口愈合的研究中发现可以通过外源性上调生长分化因子11，进而增加缺氧诱导因子1ɑ从而增多局部SDF-1表达，也从侧面进一步印证了这一通路的作用[35]。巧合的是，损伤后内源性SDF-1第一峰值出现在第3天，这与在心肌梗死后局部分子代谢机制研究结果相同，但在心肌梗死后SDF-1含量的研究中并未出现第二高峰[36]。此次实验中后一峰值集中于腱骨修复增生期，在这一过程中新生血管生成逐渐向瘢痕组织方向愈合[37]。既往研究表明在SDF-1存在的情况下，血管内皮生长因子的过表达可以增加内皮祖细胞的增殖、迁移和分化，减少其凋亡[38]，血管内皮生长因子也可以刺激内皮细胞中CXCR4和SDF-1的表达，两者形成正反馈循环[39]。而SDF-1激活血管内皮生长因子生成的能力并不局限于内皮细胞，在干细胞中也有类似的发现[40]。此外，此次实验通过Brdu共培养干细胞的体内注射验证了在损伤后干细胞确有迁移至损伤处，体外transwell实验印证了SDF-1的促干细胞迁移的归巢作用，因而在肩袖损伤修复阶段SDF-1极有可能通过诱导干细胞归巢的方式参与了修复作用。同时此次实验结果值得关注的是，SDF-1的促迁移作用只有在一定的浓度范围内发挥功效，在此次设定浓度中< 200 ng/mL时促迁移作用明显，超过此浓度范围反而产生抑制作用，此发现可为后续实验浓度的设定提供参考。
综上所述，在肩袖腱骨愈合过程中，SDF-1由原本的表达水平上升，继而可能通过趋化间充质干细胞归巢的方式促进了干细胞迁移、分化，从而加速腱骨部位的再生。随着SDF-1的分泌水平出现升高、降低、再升高、再下降的双峰值变化现象，其局部可能经历了HIF-1α的促生成作用、血管内皮生长因子的正反馈作用等，期间的第一次表达含量上升可能与局部缺氧HIF-1α调控有关，但再次上升机制尚不清楚。SDF-1的生成规律探究将有助于了解肩袖腱骨生理愈合过程。另外该实验仍有一定局限性，在探究最适促迁移浓度时仅进行了体外实验的探究。未来在不同物种甚至是临床应用中仍需进一步明确这一有效作用的具体浓度范围。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

兔肩袖腱骨愈合过程中基质细胞衍生因子1的表达及作用机制

Expression and action mechanism of stromal cell-derived factor 1 in tendon-bone healing of rabbit rotator cuff

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