生长分化因子5诱导兔骨髓间充质干细胞的软骨分化

doi:10.12307/2024.126

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (13): 1976-1982.doi: 10.12307/2024.126

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生长分化因子5诱导兔骨髓间充质干细胞的软骨分化

李飞非，王布雨，杨治航，董晓宇，邓江

遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2023-02-28 接受日期:2023-04-04 出版日期:2024-05-08 发布日期:2023-08-28
通讯作者: 邓江，教授，主任医师，博士生导师，遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)，贵州省遵义市 563000
作者简介:李飞非，男，1995年生，贵州省石阡县人，仡佬族，遵义医科大学在读硕士，医师，主要从事关节骨软骨损伤修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81660367)，项目负责人：邓江；贵州省卫生健康委科学技术基金(gzwkj 2021-236)，项目负责人：邓江

Chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by growth differentiation factor 5

Li Feifei, Wang Buyu, Yang Zhihang, Dong Xiaoyu, Deng Jiang

Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University (First People’s Hospital of Zunyi), Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2023-02-28 Accepted:2023-04-04 Online:2024-05-08 Published:2023-08-28
Contact: Deng Jiang, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University (First People’s Hospital of Zunyi), Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Li Feifei, Master candidate, Physician, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University (First People’s Hospital of Zunyi), Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81660367 (to DJ); Guizhou Provincial Health Commission Science and Technology Fund, No. gzwkj 2021-236 (to DJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

生长分化因子5：属于转化生长因子β超家族成员之一，亦称软骨形态发生蛋白1，可以诱导间充质干细胞多向分化，在组织工程中应用广泛。
骨髓间充质干细胞：由Friedenstein等首次分离出来，是一种多能干细胞，可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种谱系分化。骨髓间充质干细胞易于获得、体外扩增容易，具有低免疫原性等特性。

背景：生长分化因子5属于转化生长因子超家族成员之一，也是关节发育的最早标志之一，对软骨修复具有重要作用。

目的：探讨生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的作用机制。
方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞，CCK-8法检测不同质量浓度生长分化因子5对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响，RT-PCR检测不同质量浓度生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化相关基因的表达；为进一步探讨生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的作用机制，加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939和激活剂Laduviglusib诱导培养14 d，RT-PCR和Western blot检测软骨相关基因和Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白的表达。

结果与结论：①CCK-8结果表明生长分化因子5对骨髓间充质干细胞增殖没有明显影响；②生长分化因子5促进了软骨相关基因Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox9的表达，其中以50 ng/mL组软骨相关基因上调明显；③加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂Laduviglusib之后，Sox9、β-catenin和Ⅱ型胶原表达上调(P < 0.05)，加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939之后，Sox9、β-catenin和Ⅱ型胶原表达下调(P < 0.05)；④综上，生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

https://orcid.org/0000-0003-1368-5478 (李飞非)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 生长分化因子5, 骨髓间充质干细胞, 软骨分化, 软骨细胞, Wnt, β-catenin, 机制

Abstract: BACKGROUND: Growth differentiation factor 5 is a member of the transforming growth factor superfamily and one of the earliest markers of joint development. Growth differentiation factor 5 has an important role in cartilage repair.
OBJECTIVE: To explore the action mechanism of growth differentiation factor 5-induced chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured. CCK-8 assay was used to detect the effect of different mass concentrations of growth differentiation factor 5 on the proliferation activity of bone marrow mesenchymal stem cells. RT-PCR was utilized to detect the expression of genes related to chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by different mass concentrations of growth differentiation factor 5. To further investigate the action mechanism of growth differentiation factor 5-induced chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, we added inhibitor XAV-939 and activator Laduviglusib of Wnt/β-catenin signaling pathways to induce cell culture for 14 days. RT-PCR and western blot assay were performed to detect the expression of cartilage-related genes and Wnt/β-catenin signaling pathway proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 results showed no significant effect of growth differentiation factor 5 on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. (2) Growth differentiation factor 5 promoted the expression of cartilage-related genes type II collagen, aggrecan and Sox9, among which growth differentiation factor 5 induced a significant upregulation of cartilage-related genes in the 50 ng/mL group. (3) Addition of Laduviglusib, an activator of Wnt/β-catenin signaling pathway, upregulated Sox9, β-catenin and type II collagen expression (P < 0.05). Addition of XAV939, an inhibitor of Wnt/β-catenin signaling pathway, down-regulated Sox9, β-catenin and type II collagen expression (P < 0.05). (4) Taken together, growth differentiation factor 5-induced chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells may be associated with the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Key words: growth differentiation factor 5, bone marrow mesenchyml stem cell, cartilage differentiation, chondrocyte, Wnt, β-catenin, mechanism

中图分类号:

李飞非, 王布雨, 杨治航, 董晓宇, 邓江. 生长分化因子5诱导兔骨髓间充质干细胞的软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(13): 1976-1982.

Li Feifei, Wang Buyu, Yang Zhihang, Dong Xiaoyu, Deng Jiang. Chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by growth differentiation factor 5[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(13): 1976-1982.

图/表（结果） 8

2.1 BMSCs的形态首次换液后可见细胞呈集落样生长，继续培养3 d后可见细胞明显增多，许多细胞聚集在一起，细胞数量越加密集，呈纺锤形或梭形，培养至第7天后细胞逐渐增多，更加密集生长。经过传代处理后，细胞基本铺满瓶底，见图1。

2.2 兔BMSCs多向分化鉴定结果诱导BMSCs成骨、成软骨、成脂分化，采用茜素红、阿利新蓝、油红O染色鉴定BMSCs的多向分化能力，见图2。茜素红染色可见大量的红色钙结节，不均匀分布，结节大小不一；阿利新蓝染色见许多蓝色的颗粒，细胞质染成红色，聚集在一起，形成细胞外基质；油红O染色见大量的褐色沉着。

2.3 免疫荧光鉴定BMSCs表型对BMSCs进行CD29、CD44、CD90、CD34、HLA-DR免疫荧光染色，结果显示：BMSCs高表达CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)，不表达CD34(-)，见图3。

2.4 不同质量浓度GDF5对BMSCs增殖活性的影响 50，100，200 ng/mL GDF5均促进了BMSCs增殖，但各组之间无显著差异。GDF5组与对照组(0 ng/mL)相比，差异也无显著性意义。总的来说，GDF5对BMSCs的增殖活性无显著影响，见表2和图4。

2.5 不同质量浓度GDF5诱导BMSCs向软骨分化相关基因的表达 RT-PCR检测不同质量浓度GDF5诱导后BMSCs软骨相关基因的表达，结果提示：不同质量浓度的GDF5(0，50，100，200 ng/mL)均促进了软骨相关基因Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox9的表达，其中以50 ng/mL GDF5诱导组软骨相关基因表达上调最为明显，见图5。

2.6 GDF5诱导BMSCs成软骨分化的机制研究
2.6.1 RT-PCR检测软骨相关基因Ⅱ型胶原、Sox9和Wnt通路中β-catenin的表达与BMSCs组比较，GDF5+BMSCs组、GDF5+Laduviglusib+BMSCs组、GDF5+XAV939+BMSCs组Sox9和β-catenin表达上调(P < 0.05)，GDF5+Laduviglusib+BMSCs组Ⅱ型胶原表达上调(P < 0.05)。与GDF5+BMSCs组比较，GDF5+Laduviglusib+BMSCs组Ⅱ型胶原、Sox9和β-catenin表达上调(P < 0.05)，GDF5+XAV939+BMSCs组Sox9的表达下调(P < 0.05)，见图6。

2.6.2 Western blot检测软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、Sox9及Wnt通路中β-catenin、Gsk-3β蛋白的表达与BMSCs组比较，GDF5+BMSCs组、GDF5+Laduviglusib+BMSCs组Ⅱ型胶原、β-catenin蛋白表达上调(P < 0.05)；GDF5+Laduviglusib+BMSCs组Sox9蛋白表达上调(P < 0.05)；与GDF5+BMSCs组相比，GDF5+XAV-939+BMSCs组Ⅱ型胶原、β-catenin表达下调(P < 0.05)，见图7。

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引言

随着人口老龄化的增长，膝骨关节炎的发病率呈上升趋势[1-2]。膝骨关节炎的主要特征是关节软骨退行性变，常常累及到软骨下骨[3]。由于关节软骨无直接的血液供应，无淋巴、神经等营养支持，损伤后很难自我修复。目前的治疗方法主要包括药物治疗、运动治疗、手术治疗等[4]，然而，这些治疗方法仅仅是改善症状，不能逆转关节软骨的退行性变，而组织工程的出现为软骨再生提供了可行的方法。组织工程主要包括3要素：种子细胞、细胞因子、支架材料，组织工程技术即是将体外分离培养的种子细胞结合细胞因子种植到制备的支架材料中，然后移植到体内骨软骨缺损处，从而实现骨软骨再生的目的[5]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs)是组织工程中常用的种子细胞[6]，具有多向分化潜能，能够向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多向分化[7]。有研究发现，BMSCs分化来源的软骨细胞能够与软骨下骨更好地融合[8]，将BMSCs作为组织工程中的种子细胞对于骨软骨损伤修复可能更具有优势。
生长分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)也称软骨形态发生蛋白1，是转化生长因子β超家族成员之一，与骨和关节发育密切相关[9-10]。GDF5是近几年来研究比较多的细胞因子，具有特殊的软骨诱导能力[11]，有研究表明，它参与了软骨组织形成、生长，可促进关节软骨的损伤修复[12]。GDF5可诱导成纤维细胞分化为软骨细胞，并分泌软骨细胞特异性基质(Ⅱ型胶原和蛋白聚糖)，同时抑制分解代谢因子(基质金属蛋白酶13和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5)的表达[13]。研究表明，与正常的髓核细胞相比，椎间盘退行性变的髓核细胞中GDF5表达显著减少，外源性加入GDF5可逆转椎间盘的退行性变[14]。LUO等[15]研究表明GDF5可促进退行性髓核细胞分泌细胞外基质，为治疗椎间盘退行性变提供了新的方法。
总之，GDF5在许多方面均发挥着重要的作用，譬如骨再生[16-17]、治疗椎间盘退行性变[12，18-19]、肌腱修复[20-21]、神经再生等[22-23]。GDF5可诱导间充质干细胞成软骨分化，但是其作用机制研究较少。ZHOU等[24]研究认为转化生长因子β通过激活Wnt信号通路可刺激人BMSCs向软骨细胞分化。由此猜想GDF5也可能通过Wnt信号通路促进BMSCs成软骨分化。因此，该研究旨在探讨体外GDF5诱导BMSCs向软骨分化的可能作用机制，以期为GDF5应用于软骨损伤修复奠定基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年5月至2022年3月在遵义医科大学第三附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物新西兰大白兔1只，3月龄左右，雌雄不限，体质量2 kg左右，购自重庆康格生物科技有限公司，实验动物合格证号：SCXK(黔)2021-0001，饲养于遵义医科大学第三附属医院中心实验室动物中心，通风良好，自由饮水，定期饲养。实验方案已通过遵义市第一人民医院实验动物伦理委员会审核，编号：伦审(2021)-2-25号。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM低糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Biological Industries)；GDF5(Peprotech公司)；成软骨诱导培养基(Sciencell公司)；成骨诱导培养基、成脂诱导培养基(Procell公司)；细胞计数板、CCK-8试剂盒、组织/细胞RNA提取试剂盒(Beyotime公司)；反转录试剂盒(Takara公司)；胰酶、茜素红S染色液、油红O染色液、阿利新蓝染色试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、高效RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、DAPI溶液(Solarbio公司)；PAGE凝胶快速制备试剂盒、5×蛋白上样缓冲液(Buffer)、双色预染蛋白Marker(10-250 kD)、Omni-ECL™超灵敏化学发光检测试剂盒(飞克级)、无蛋白快速封闭液(5×)(雅酶生物公司)；GAPDH抗体(NO.GTX100118，GeneTex公司)；Ⅱ型胶原抗体(NO.28459-1-AP)、Gsk-3β抗体(NO.14850-1-AP)、β-catenin抗体(NO.28776-1-AP)(Proteintech公司)；Sox9抗体(NO.ET1611-56，HUABIO公司)；Goat Anti-Rabbit lgG-H&L(HRP)(欣博盛生物公司)；XAV-939(HY-15147，MCE公司)；Laduviglusib (HY-10182，MCE公司)；PVDF膜(0.45 µm，Millipore公司)；引物合成(Invitrogen公司)；PrimeScript RT Reagent Kit(Takara公司)；CD29抗体、CD44抗体、CD90抗体、CD34抗体(Bioss公司)；Coralite488-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG(H+L)(Proteintech公司)；CO2恒温培养箱(Panasonic公司)；T25培养瓶、15 mL离心管、50 mL离心管(NEST)。
XAV-939为一种Tankyrase抑制剂，可抑制β-catenin转录进入细胞核，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。Laduviglusib为一种有效的、选择性的GSK-3β抑制剂，可激活Wnt/β-catenin信号通路。
1.4 方法
1.4.1 BMSCs分离与培养取2 kg左右新西兰大白兔1只，雌雄不限，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，待麻醉后，采取仰卧位固定四肢，兔膝关节部位备皮、消毒，铺治疗巾，用无菌骨穿针接20 mL注射器，预先吸取含肝素的DMEM低糖培养基，然后抽取双侧股骨骨髓5 mL，上下颠倒轻轻摇匀后注入含4 mL DMEM低糖培养基的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中静置培养，2 d后首次半换液，以后每两三天换液1次，在显微镜下观察细胞生长状态。待细胞长满瓶底80%-90%，用0.25%胰酶消化细胞，以1∶2比例传代处理，记为第1代(P1)，依次类推。
1.4.2 BMSCs多向分化潜能鉴定取第3代生长状态良好的BMSCs，PBS洗涤2次，加入1.0-2.0 mL 0.25%胰酶进行消化处理，将消化下来的细胞转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM低糖培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×109 L-1，接种于6孔板中，每孔1 mL，待细胞融合达孔底80%-90%时，分别加入不同的培养基：成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基、成脂诱导培养基，连续培养14 d后，分别进行茜素红染色、阿利新蓝染色、油红O染色，各组染色根据染色试剂盒说明书进行，然后于显微镜下观察并拍照。

1.4.3 免疫荧光鉴定BMSCs表型取第3代BMSCs，胰酶消化处理后，转至6孔板中培养，待细胞长满孔底80%以上时，取出6孔板，通过免疫荧光染色检测BMSCs表面分子CD29、CD44、CD90、CD34的表达，具体染色步骤如下：用40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，然后每孔加入1 mL免疫染色通透液室温通透10 min，PBS洗涤，每孔加入1 mL 5%BSA封闭30 min；加入一抗[CD29(1∶200)、CD44(1∶200)、CD90(1∶200)、CD34(1∶200)]，4 ℃冰箱孵育过夜，加入二抗[Coralite488-conjugated Goat anti-Rabbit lgG(H+L) (1∶200)]，室温避光孵育1 h，DAPI溶液复染10 min，PBS洗涤，滴加抗荧光淬灭剂封固，荧光显微镜下观察。

1.4.4 CCK-8法检测GDF5对BMSCs活性的影响取第3代生长状态良好的BMSCs，PBS洗涤2次，加入1.0-2.0 mL 0.25%胰酶进行消化处理，显微镜下观察细胞由梭形变为圆形时，加入等体积DMEM低糖培养基终止消化，轻吹打瓶底将未消化完全的细胞吹打下来，转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM低糖培养基重悬细胞，细胞计数板计数细胞，以每孔2 000个细胞接种于96孔板，实验分为4组，分别为0，50，100，200 ng/mL GDF5组，每组设置5个复孔，分别在干预1，2，3，4，5，6 d时各取1板加入10 μL CCK-8溶液，放入培养箱孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值。
1.4.5 RT-PCR检测不同质量浓度GDF5诱导BMSCs向软骨分化相关基因的表达取第3代BMSCs，胰酶消化后调整细胞浓度为2×109 L-1，接种于6孔板中，每孔1 mL，加入DMEM低糖培养基培养，待细胞长满孔底80%-90%时加入含不同质量浓度GDF5(0，50，100，200 ng/mL)的成软骨诱导液，置于细胞培养箱中继续培养，每隔两三天换液1次，连续诱导14 d，提取细胞总RNA，然后将RNA反转录成cDNA，RT-PCR检测软骨相关基因Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Sox9的mRNA表达。
1.4.6 GDF5诱导BMSCs成软骨分化的机制研究为了进一步探讨GDF5诱导BMSCs向软骨分化的作用机制，加入Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂(XAV939)和激活剂(Laduviglusib)与BMSCs共培养，GDF5终质量浓度为50 ng/mL，XAV939浓度为5 μmol/L，Laduviglusib浓度为5 μmol/L，实验分为4组：BMSCs组、GDF5+BMSCs组、GDF5+XAV939+BMSCs组、GDF5+Laduviglusib+BMSCs组，诱导培养14 d后收集细胞，RT-PCR和Western blot检测软骨相关基因Ⅱ型胶原、Sox9和Wnt/β-catenin通路中β-catenin、Gsk-3β的mRNA和蛋白表达。

(1) RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Sox9和Wnt通路中β-catenin的表达：取出诱导培养14 d的细胞，用预冷的PBS洗涤2次，根据RNAeasyTM动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)说明书提取总RNA，再使用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，通过RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Sox9、β-catenin基因的表达，PCR扩增体系为：上下游引物各1 μL，SYBR 10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，总体系20 μL。结果以目的基因的相对表达量2-ΔΔCt表示。RT-PCR引物序列见表1。

(2) Western blot检测软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、Sox9及Wnt通路中β-catenin、Gsk-3β蛋白的表达：取出诱导培养14 d的细胞，按照总蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法进行蛋白浓度测定，加入1/4蛋白体积的Buffer，煮沸变性10 min，待冷却后放入-20 ℃保存备用。
Western blot步骤：制备SDS-PAGE凝胶，加入蛋白样品和Marker后，将电压调至70 V恒压电泳，待蛋白跑最下方时停止电泳，取出玻板，根据目的蛋白分子质量大小进行切胶，裁剪好合适大小PVDF膜，放入甲醇中浸泡3-5 min，按照“黑胶白膜”的顺序放置凝胶和PVDF膜，制备类似“三明治”结构，放入转膜槽中，倒满电转液，盖好盖子将电流调至295 mA，转膜70 min。转膜结束后将PVDF膜放入封闭液中室温封闭1 h，TBST洗涤，加入一抗[GAPDH (1∶5 000)、Ⅱ型胶原(1∶2 000)、Sox9 (1∶500)、β-catenin (1∶2 000)、Gsk-3β (1∶2 000)]，4 ℃冰箱孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗[Goat Anti-Rabbit lgG-H&L(HRP) 1∶5 000]室温孵育1 h，TBST洗涤，ECL化学发光液浸泡PVDF膜，凝胶成像仪下显影曝光。对目的蛋白的灰度值进行统计分析，计算目的蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①BMSCs的形态及鉴定结果；②GDF5对BMSCs增殖活性的影响；③GDF5对BMSCs向软骨分化相关基因表达的影响；④GDF5诱导BMSCs成软骨分化的机制。
1.6 统计学分析应用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。数值变量资料用x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法经过遵义医科大学相关统计学专家审核。

讨论

BMSCs已在关节炎疾病、软骨缺损和骨修复中得到广泛研究。BMSCs移植后可减缓关节疾病的进展，有助于软骨组织的再生[25]。同样，BMSCs在促进骨折愈合过程中也发挥了重要的作用[26]。
GDF5属于转化生长因子β超家族成员之一，不仅可以促进BMSCs向软骨分化，而且可以促进骨再生、肌腱损伤修复等[27-28]。在该研究中，GDF5上调了软骨相关基因的表达，表明GDF5促进BMSCs向软骨细胞分化。有研究表明，GDF5诱导成软骨分化有一定的剂量关系，成软骨分化以低剂量为主，高剂量更倾向于成骨分化[29]。在该研究中，探索不同质量浓度GDF5对成软骨分化的影响，结果表明，50 ng/mL GDF5诱导软骨分化更显著，与其他研究一致[30]。然而，有研究认为，100 ng/mL GDF5更适合细胞成软骨分化，这可能与细胞类型不同有关[31]。还有研究研究对象虽然为BMSCs，但是未设置50 ng/mL组，因此得出的最适质量浓度也为100 ng/mL，这些矛盾的地方仍有待探索[32]。更高质量浓度的GDF5是否更倾向成骨分化，目前还鲜有研究。
Wnt/β-catenin信号通路是胚胎发育和组织稳态与再生所必需的，该通路的异常调控与许多疾病类型密切相关[33]。有研究表明，Wnt信号通路影响骨关节炎的发病机制，因为该途径既能调节成骨细胞和软骨细胞的分化，也能调节分解蛋白酶的产生[34]。ZHU等[35]通过Col2a1-ICAT转基因小鼠，过表达小分子ICAT(β-catenin和T细胞因子的抑制剂)来抑制软骨细胞中β-catenin的活性，使Wnt/β-catenin通路失活，发现导致了关节软骨破坏、软骨细胞凋亡，这说明激活Wnt/β-catenin通路可对关节软骨有保护作用。然而，有人认为过度的Wnt/β-catenin信号激活可能促进骨关节炎的发展。β-catenin在骨关节炎小鼠关节软骨表层中显著上调，在骨关节炎患者软骨中显著升高[36]。有学者使用Col2a1-CreERT2转基因小鼠诱导软骨细胞中β-catenin激活，导致膝关节、髋关节和颞下颌关节的关节软骨显著破坏[37-39]。最近的研究证明，在兔滑膜关节注射氯化锂激活β-catenin，促进了关节软骨的退行性变，导致软骨退化和骨关节炎的发展[40]。因此，适度激活Wnt/β-catenin信号通路对保护关节软骨是必要的。
间充质干细胞向软骨细胞谱系分化已证实受Wnt/β-catenin信号通路调控[41]。有研究者用BIO处理BMSCs，发现BIO能够诱导BMSCs体外成软骨分化是通过激活Wnt/β-catenin信号通路[42]。总之，Wnt/β-catenin信号通路能够调节软骨细胞形成和细胞外基质的分泌，在分化的不同阶段起正向或负向的调控作用。HAN等[43]用GDF5诱导脂肪间充质干细胞，在第14天高表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，而在第21，28天高表达Ⅰ型胶原和Ⅹ型胶原，表明GDF5在早期促进成软骨分化，晚期促进软骨细胞肥大分化。该研究使用GDF5诱导BMSCs培养14 d，结果表明GDF5促进了Ⅱ型胶原、Sox9以及β-catenin的表达，加入Wnt通路抑制剂XAV939后β-catenin表达下调，软骨相关基因Ⅱ型胶原、Sox9表达降低。Sox9是一种高迁移率族蛋白转录因子，软骨细胞分化和软骨形成的关键调节因子，也是间充质干细胞成软骨分化早期阶段的标志[44]。综上，GDF5可能在早期通过激活Wnt/β-catenin通路参与BMSCs向软骨分化。Wnt/β-catenin信号通路参与调控软骨分化的多个过程以及许多疾病的调控，在不同阶段、不同环境下具有不同的正调控或负调控作用。GDF5在后期促进软骨细胞肥大分化，而软骨细胞肥大分化是软骨修复的一大障碍，如何在后期抑制软骨细胞肥大分化仍是今后需进一步探讨的问题。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

生长分化因子5诱导兔骨髓间充质干细胞的软骨分化

Chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by growth differentiation factor 5

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