机器学习联合生物信息学鉴定骨关节炎细胞衰老关键基因及验证

doi:10.12307/2024.344

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (20): 3196-3202.doi: 10.12307/2024.344

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机器学习联合生物信息学鉴定骨关节炎细胞衰老关键基因及验证

袁长深1，廖书宁2，李哲2，吴思萍2，陈乐伟2，刘晋邑2，李彦宏2，段戡1

1广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023；2广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2023-04-07 接受日期:2023-06-10 出版日期:2024-07-18 发布日期:2023-09-11
通讯作者: 段戡，博士，主任医师，广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:袁长深，男，1978年生，广西壮族自治区荔浦市人，汉族，2008年广西中医学院毕业，硕士，主要从事骨与关节疾病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82060875)，项目负责人：袁长深；国家自然科学基金(82160912)，项目负责人：段戡

Machine learning combined with bioinformatics to identify and validate key genes for cellular senescence in osteoarthritis

Yuan Changshen1, Liao Shuning2, Li Zhe2, Wu Siping2, Chen Lewei2, Liu Jinyi2, Li Yanhong2, Duan Kan1

1Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2School of Postgraduate, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-04-07 Accepted:2023-06-10 Online:2024-07-18 Published:2023-09-11
Contact: Duan Kan, MD, Chief physician, Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Yuan Changshen, Master, Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, Nos. 82060875 (to YCS) and 82160912 (to DK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨关节炎：是一种与年龄密切相关，表现为关节软骨退化、滑膜炎症的退行性关节疾病。随着老龄化社会加剧，其患病率逐步上升。
细胞衰老：是指各种因素导致细胞增殖减缓，甚至细胞周期永久性停滞状态，可引起机体内代谢变化，与人类多种疾病紧密相关。

背景：细胞衰老与骨关节炎的发生、发展密切相关，但具体作用靶点及调控机制尚不清楚。

目的：综合生物信息学和机器学习方法挖掘细胞衰老介导骨关节炎的关键基因，并利用实验加以验证，探讨细胞衰老在骨关节炎中的作用。
方法：从GEO数据库中获得骨关节炎基因表达谱以及从CellAge数据库中获得细胞衰老相关基因，二者取交集并提取交集基因表达量进行差异分析，然后对差异基因进行GO和KEGG分析，接着通过PPI网络分析和机器学习筛选骨关节炎细胞衰老关键基因，并进行体外细胞实验验证，采用qPCR方法检测关键基因的表达。

结果与结论：①获得31个骨关节炎细胞衰老差异基因，GO分析显示主要参与白细胞分化调节、单核细胞分化、T细胞分化调节等生物过程，在DNA转录因子结合、组蛋白去乙酰化酶结合、染色质DNA结合、趋化因子结合中发挥作用；②KEGG分析表明骨关节炎细胞衰老差异基因主要在JAK/STAT信号通路、PI3K/Akt信号通路、FoxO信号通路中被激活；③通过PPI网络拓扑学分析和机器学习方法筛选出骨关节炎细胞衰老关键基因MYC；④体外细胞实验结果表明，实验组骨关节炎软骨细胞中MYC mRNA表达明显低于对照组(正常软骨细胞)，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，MYC可作为骨关节炎细胞衰老的关键基因，可能通过介导免疫应答、炎症反应和转录调控等成为骨关节炎防治的新靶标。

https://orcid.org/0000-0001-5749-9859(袁长深)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 细胞衰老, 关键基因, 细胞实验, 机器学习, 生物信息学

Abstract: BACKGROUND: Cellular senescence is closely related to the development and progression of osteoarthritis, but the specific targets and regulatory mechanisms are not yet clear.
OBJECTIVE: To mine key genes in cellular senescence-mediated osteoarthritis by integrating bioinformatics and machine learning approaches and validate them via experiments to explore the role of cellular senescence in osteoarthritis.
METHODS: The osteoarthritis gene expression profiles obtained from the GEO database were intersected with cellular senescence-related genes obtained from the CellAge database and the expression of the intersected genes was extracted for differential analysis, followed by GO and KEGG analysis of the differential genes. The key osteoarthritis cellular senescence genes were then screened by protein-protein interaction network analysis and machine learning, and in vitro cellular experiments were performed. Finally, the expression of the key genes was detected by qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 31 osteoarthritis cell senescence differential genes were identified. GO analysis showed that these genes were mainly involved in the biological processes, such as regulation of leukocyte differentiation, monocyte differentiation, regulation of T cell differentiation and exerted roles in DNA transcription factor binding, histone deacetylase binding, chromatin DNA binding, and chemokine binding. KEGG analysis showed that osteoarthritis cell senescence differential genes were mainly activated in the JAK/STAT signaling pathway, PI3K/Akt signaling pathway and FoxO signaling pathway. MYC, a key gene for osteoarthritis cellular senescence, was identified by protein-protein interaction network topology analysis and machine learning methods. The results of the in vitro cellular assay showed that the mRNA expression of MYC was significantly lower in the experimental group (osteoarthritis group) than the control group (normal group) (P < 0.05). To conclude, MYC can be a key gene in the senescence of osteoarthritic cells and may be a new target in the prevention and treatment of osteoarthritis by mediating immune response, inflammatory response and transcriptional regulation.

Key words: osteoarthritis, cellular senescence, key gene, cell experiment, machine learning, bioinformatics

中图分类号:

袁长深, 廖书宁, 李哲, 吴思萍, 陈乐伟, 刘晋邑, 李彦宏, 段戡. 机器学习联合生物信息学鉴定骨关节炎细胞衰老关键基因及验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3196-3202.

Yuan Changshen, Liao Shuning, Li Zhe, Wu Siping, Chen Lewei, Liu Jinyi, Li Yanhong, Duan Kan. Machine learning combined with bioinformatics to identify and validate key genes for cellular senescence in osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(20): 3196-3202.

图/表（结果） 11

2.1 骨关节炎细胞衰老相关基因将3 个数据集进行合并去除批次效应，见图1。合并后的骨关节基因与从CellAge数据库获得的279 个细胞衰老相关基因取交集，得到203 个基因，见图2，即为骨关节炎细胞衰老相关基因。

2.2 骨关节炎细胞衰老差异基因以合并后的骨关节炎数据集为样本，提取203个交集基因表达量，以P < 0.05和|log2FC| > 1为筛选标准做差异分析，最终得到31个骨关节炎细胞衰老差异基因，包括9个上调基因和22个下调基因，热图见图3。

2.3 GO及KEGG富集分析通过对31个骨关节炎细胞衰老差异基因进行GO和KEGG富集分析，以便更好地了解其参与的生物学过程。GO富集分析表明，这些基因主要富集在白细胞分化调节、单核细胞分化、T细胞分化调节等生物过程中；在细胞成分上，主要存在于转录抑制复合物、RNA聚合酶Ⅱ转录抑制复合物；分子功能方面，主要在DNA转录因子结合、组蛋白去乙酰化酶结合、染色质DNA结合、趋化因子结合中发挥作用，见图4。KEGG富集分析结果表明，骨关节炎细胞衰老差异基因主要在JAK/STAT信号通路、PI3K/Akt信号通路、FoxO信号通路中被激活，见图5。

2.4 PPI网络及Hub基因利用STRING数据库生成蛋白质相互关系的PPI网络，剔除孤立节点后使用Cytoscape软件可视化，网络包括23个节点，61条边，见图6。对网络进行拓扑学分析，运用“Degree”“Betweenness”“Closeness”“Stress”“MNC”5种算法筛选节点重要性排名前3位基因并取交集，得到2个Hub基因：MYC、CCND1，见图7。

2.5 机器算法的确定分别绘制RF和SVM算法的残差箱线图及受试者工作特征曲线，见图8，9；通过对比2种算法的残差值和曲线下面积值，以确定算法的准确性，最终采用RF算法用于后续分析。

2.6 骨关节炎细胞衰老关键基因利用R软件的“random Forest”包对差异基因进行RF算法，并绘制基因重要性图谱，见图10，11；接着提取重要性评分> 1的基因与PPI网络中的Hub基因取交集，所得基因即为骨关节炎细胞衰老关键基因：MYC。

2.7 体外细胞实验验证结果 qPCR结果显示，与对照组相比，实验组关键基因MYC表达下调；MYC在实验组和对照组间表达存在显著差异(P < 0.05)，见图12。

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引言

材料方法

1.1 设计生物信息学分析并进行体外人软骨细胞分组实验验证。
1.2 时间及地点 2022 年4-6 月在广西中医药大学和江西中洪博元生物技术有限公司完成。
1.3 数据
1.3.1 数据收集骨关节炎基因表达探针矩阵文件及平台文件从基因表达综合数据库(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中提取，限定标准为：①Osteoarthritis；②Expre-ssion profiling by array；③Homo sapiens。通过对检索结果进一步筛选，最后纳入3 个数据集GSE55235[包含10 个健康对照及10 个骨关节炎患者数据，该数据集由GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)平台生成]、GSE12021[包含9 个健康对照及10 个骨关节炎患者数据，该数据集由GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)平台生成]、GSE1919[包含5 个健康对照及5 个骨关节炎患者数据，数据集由GPL91(Affymetrix Human Genome U95A Array)平台生成]，共包含24 个健康对照和25 个骨关节炎患者基因样本数据。此外，从CellAge数据库(https://genomics.Sene-scence.info/cells/)中获取细胞衰老相关基因[8]。
1.3.2 数据处理利用perl脚本对探针矩阵文件进行基因注释后获得基因矩阵文件，并剔除数据集中无关样本。由于样本量较少，且单个数据集分析所得差异基因存在偏差的可能性较大，因此使用perl脚本将3 个数据集合并作为研究对象；同时，考虑到3 个数据集平台来源及制造商和处理过程的差异性，利用R软件(x64 4.2.2)中的“SVA”包对合并矩阵去除批次效应。通过R软件“limma”包中的“normalize Between Arrays”函数对3 组基因表达矩阵进行常规背景校正和分位数归一化，并输出校正后的基因表达矩阵。
1.3.3 骨关节炎细胞衰老差异基因筛选通过在线分析网站(https://www.bioinformatics.com.cn/)将骨关节炎基因和细胞衰老相关基因取交集，获得骨关节炎细胞衰老相关基因，并将结果可视化；接着使用R软件的“limma”包提取交集基因的表达量进行差异分析，筛选标准为：P < 0.05和|log2FC| > 1，得到骨关节炎细胞衰老差异基因，并利用R软件中的“pheatmap”包将差异分析结果以热图的形式可视化。
1.3.4 基因本体论(gene ontology，GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析 GO富集分析及KEGG富集分析能够从多角度探索基因间的关系和潜在规律，是生物信息研究常用的富集分析方法，其中GO包括生物过程、细胞成分和分子功能3 个部分。应用R软件“cluster Profiler”包以限定条件：P value Filter=0.05，q value Filter=1，对骨关节炎细胞衰老差异基因进行GO和KEGG富集分析，再利用“ggplot2”包对富集结果可视化。
1.3.5 蛋白质与蛋白质相互作用网络(PPI网络)的构建及Hub基因的筛选将骨关节炎细胞衰老差异基因导入STRING数据库(https://www.string-db.org/)建立PPI网络，以阈值≥0.4为限定条件，排除孤立节点，导出关联文件和可视化图谱；接着利用Cytoscape软件(v3.7.2)对PPI网络进行拓扑学分析，应用“CytoHubba”插件的“Degree”“Betweenness”“Closeness”“Stress”“MNC”等5 种算法筛选PPI网络中的Hub基因(网络节点重要基因)。
1.3.6 机器算法的选择使用R软件的“randomForest”“caret”“kernlab”等对骨关节炎细胞衰老差异表达基因数据集分别进行随机森林(random forest，rf)算法和支持向量机(support vector machine，SVM)算法，通过比较2种算法对于特征基因筛选的准确性以确定最终的机器算法用于后续分析。
1.3.7 骨关节炎细胞衰老关键基因的筛选采用准确性高的机器算法，以基因重要性评分> 1为过滤标准得到筛选结果；进而将结果与PPI网络中Hub基因取交集，得到骨关节炎细胞衰老关键基因，同时将结果可视化。
1.4 体外细胞实验白细胞介素1β被广泛应用于骨关节炎软骨细胞模型的诱导[9]。将来自正常人的软骨细胞(CP-H107，普诺赛)分为实验组(骨关节炎组)和对照组(正常组)。细胞在干式恒温加热器(39 ℃)中复苏后于超净台中转移至细胞培养瓶中进行培养，细胞汇合度至80%时进行传代，待传代细胞贴壁良好后进行免疫组化鉴定。鉴定通过后，实验组加入10 ng/mL白细胞介素1β(CG93，novoprotein)处理24 h造模[10]，然后采用qPCR检测Ⅱ型胶原蛋白的表达进行模型验证[11]。
造模成功后，根据制造商说明使用Trizon试剂(CW0580S，CWBIO)从每组细胞中提取总RNA；使用紫外分光光度仪(NP80，NanoPhotometer)和RNA琼脂糖凝胶电泳对所提取的RNA进行浓度、纯度测定和质量检测；然后将RNA反转录为cDNA，50 ℃条件下保持15 min，转到85 ℃条件下保持5 s；最后使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-02，Vazyme)进行qPCR，参数设置为95 ℃ 10 min 1 个循环，95 ℃

10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 40 个循环。目标基因相对表达量使用2-ΔΔCt方法计算。以β-actin作为内参，引物信息见表1。

1.5 主要观察指标骨关节炎细胞衰老关键基因的表达差异。
1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件进行数据分析，所有实验重复3 次，数据以x±s表示，组间差异比较采用独立样本 t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。使用GraphPad Prism 8.3软件进行数据绘制。此研究统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

骨关节炎是一种以疼痛、软骨丧失和关节炎症为特征的慢性关节疾病。临床治疗主要以改善症状，提高患者生活质量为主，而手术干预可能是晚期患者不可避免的治疗方法[12]。随着年龄增长，骨关节炎发病率随之增加。因此，积极探索其发病机制就显得尤为重要。研究表明，关节组织中衰老细胞数量的增加及其分泌的衰老相关分泌表型能够导致软骨退化、细胞外基质降解[13]、炎症反应和诱发疼痛[14]，与骨关节炎的发生、发展密切相关。而靶向衰老细胞的干预策略对骨关节炎的治疗具有积极意义[15-16]，但具体作用机制尚未阐明。因此，该研究利用生物信息学及机器学习算法结合实验验证探索骨关节炎细胞衰老相关基因表达谱及其参与的生物过程并鉴定关键基因，尝试从细胞衰老角度为骨关节炎的病理机制提供新见解。
通过在GEO及CellAge数据库中获得骨关节炎与细胞衰老相关基因取交集并提取相关表达量进行差异分析后，获得31 个骨关节炎细胞衰老相关差异基因，接着对这些基因进行GO和KEGG功能富集，发现其主要参与白细胞分化调节、单核细胞分化、T细胞分化调节等生物过程。白细胞包含单核细胞、T细胞、粒细胞等多种细胞在内的免疫细胞类型。研究发现，骨关节炎患者滑膜中存在来自先天性和获得性免疫家族的一系列免疫细胞[17]，可能通过多种途径参与骨关节炎发病，引发关节炎症及软骨退化[18]。单核细胞及其分化的巨噬细胞作为一类先天性免疫细胞，它们的激活能够释放白细胞介素1和白细胞介素6，并通过自分泌和旁分泌反馈回路促进趋化因子和促炎细胞因子的产生[19]，而这些炎症递质被认为在骨关节炎的发生和进展中起着至关重要的作用[20]，因此，介导关节内单核细胞和巨噬细胞的功能活动可能是骨关节炎较有潜力的治疗方向[21]。T细胞作为骨关节炎滑膜中的主要免疫细胞之一[22]，可在早期被检测出来[23]，但滑膜内衬层主要含有CD4+和CD8+T细胞，内膜层主要含有CD4+T细胞[20]，滑膜T细胞浸润可能在骨关节炎发病机制中承担重要角色，诱发症状性骨关节炎[24]。T细胞可能还通过CD40/CD40L信号轴活化单核细胞和巨噬细胞，从而通过免疫细胞间的相互作用，影响骨关节炎的发生、发展[20]；此外，免疫应答的调节与细胞衰老亦关系密切[25]。因此，细胞衰老调控骨关节炎进程可能通过介导免疫反应完成，这值得进一步研究。
细胞成分的GO分析显示，骨关节炎细胞衰老基因主要存在于转录抑制复合物、RNA聚合酶Ⅱ转录抑制复合物中；分子功能方面，主要在DNA转录因子结合、组蛋白去乙酰化酶结合、染色质DNA结合、趋化因子结合中发挥作用。转录因子能够与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，调控基因转录和表达，从而发挥基因的生物学功能[26]。NFAT1转录因子能够调节关节软骨细胞中相关靶基因的转录，保护关节软骨免于降解，而NFAT1缺陷则会导致软骨基质分解代谢增加和诱发骨关节炎[27]。组蛋白作为染色质的组成成分，具有基因调控作用，其乙酰化修饰形式有利于转录因子的结合，促进基因的转录表达[28]；组蛋白去乙酰化酶则介导组蛋白的去乙酰化，组蛋白去乙酰化酶4上调可减少骨关节炎大鼠模型的骨赘形成和软骨损伤，增加关节软骨的合成代谢[29]。骨关节炎相关趋化因子包括单核细胞趋化蛋白1、嗜酸性粒细胞趋化因子、巨噬细胞炎症蛋白1α、巨噬细胞炎症蛋白1β等，这些趋化因子可以通过募集免疫细胞进而激活免疫应答，诱发炎症反应，加速骨关节炎进展，与骨关节炎病理学过程相关[30-31]；这与GO生物过程分析的结果保持一致性，再次证明骨关节炎细胞衰老基因可能通过介导免疫反应与骨关节炎建立关系。
KEGG分析表明，骨关节炎细胞衰老差异基因主要在JAK/STAT、PI3K/Akt、FoxO等信号通路中被激活。JAK /STAT作为经典的炎症信号通路，可能通过介导软骨干/祖细胞衰老[32]、炎症反应[33]、软骨细胞外基质降解等多种途径参与骨关节炎的发生[34]，被认为是骨关节炎治疗具有潜力的靶点[35]。PI3K/Akt/mTOR在调节细胞周期、炎症和代谢等细胞生物学过程中发挥重要作用，与骨关节炎进展有关，靶向该轴的治疗可能是一种可行方法，但目前仍存在困难[36]。FoxO是PI3K/Akt信号机制的另一下游分支转录因子[37]，随着机体衰老，其在软骨和骨关节炎中表达下降，而过表达FoxO1可减少炎症递质和软骨降解酶的分泌，防止骨关节炎软骨破坏[38]；不仅如此，FoxO1转录活性的增加同样可减轻骨关节炎软骨细胞损害[39]。上述结果表明，骨关节炎细胞衰老基因可能通过影响细胞周期变化、炎症递质释放、软骨细胞外基质降解等生物学过程作用于骨关节炎，具体调控途径值得进一步探究。
综合PPI网络拓扑学分析和RF机器学习双重筛选方法，发挥联合分析的优势，得到更为准确的骨关节炎细胞衰老关键基因：MYC。进一步通过体外细胞实验验证表明，MYC在实验组和对照组间表达存在差异(P < 0.05)，并与其他相类似骨关节炎研究中的检测结果趋势相同[40-41]。MYC基因由3 个旁系同源物C-MYC、N-MYC和L-MYC组成，其家族成员及相关代谢产物影响细胞生长、增殖、分化、代谢、生存及程序性死亡的调节，被认为是一种与长寿相关的调节基因，并与免疫应答和干细胞形成有关；在生物体生理、病理过程中处于重要地位，其功能多效性很大程度上通过控制RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，进而调控相关基因的转录而完成[42-44]。目前有关MYC的研究多聚焦于癌症治疗，是潜在抗癌靶点，其调节剂在多种临床前模型中表现出抗癌活性[43]。其中C-MYC被研究较为广泛，下调C-MYC表达能够促进细胞衰老[45-46]。关节软骨损伤被认为是骨关节炎发生的主要原因之一[47]，这与软骨细胞凋亡程度密切相关[48]。C-MYC在骨关节炎中可能是通过影响软骨细胞活力、凋亡和增殖，进而参与软骨修复和骨关节炎进展[40，49]，但具体调控机制仍有待研究。
综上所述，该研究结合生物信息学和机器学习，探究细胞衰老在骨关节炎中的作用机制，发现细胞衰老可能通过影响免疫应答、炎症反应和转录调控等过程作用于骨关节炎，并与软骨降解、滑膜炎症等紧密相关，这可以为开展后续研究提供更好的思路，而MYC有望成为其中关键的介入点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

机器学习联合生物信息学鉴定骨关节炎细胞衰老关键基因及验证

Machine learning combined with bioinformatics to identify and validate key genes for cellular senescence in osteoarthritis

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