2.1   脂肪间充质干细胞的鉴定结果   见图1。从大鼠腹股沟区皮下或附睾周围的脂肪组织中提取脂肪间充质干细胞，培养传代后，光学显微镜观察显示第3代脂肪间充质干细胞形态均一，呈典型的鱼群样、成纤维状、漩涡式排列生长，无明显蝉翼样变宽分化现象。流式细胞仪鉴定第3代脂肪间充质干细胞的表面抗原，结果显示高表达CD90，CD44，阳性率分别为99%，94.7%；低表达CD45，阳性率为1.58%。经成脂诱导14 d后，可见细胞形态逐渐由长梭形变为多边形或圆形，胞浆内积聚了大小不等的脂肪滴，经油红O染色后脂肪滴呈鲜艳深红色。经成骨诱导21 d后，可见细胞逐渐由长梭形变为多边形，呈聚集样、铺路石样多层生长，表面有大小不等的黑色小颗粒，局部有矿化样的结晶物，经茜素红染色后可见“蘑菇样”散落分布、大小不等的深红色球形结节。经成神经干诱导分化3 d后，经神经干细胞表面标记蛋白Nestin及SOX2荧光染色后鉴定具有神经干细胞特性。以上结果说明已成功分离出大鼠脂肪间充质干细胞。



2.2   ADMSC-Exo的鉴定结果   透射电子显微镜观察显示所提取纳米粒子具有典型的杯状形态，见图2A，符合外泌体的一般形态。激光粒度仪检测显示，所提取纳米粒子直径较均一，分布在50-140 nm范围内，见图2B，符合外泌体粒径分布在30-150 nm范围内的特征。此外，Western blot检测结果显示所提取纳米粒子表达外泌体表面特异性标志膜蛋白Alix、CD63及TSG101，见图2C。以上结果证明外泌体已成功分离。



2.3   ADMSC-Exo的细胞摄取实验结果    为了检测外泌体的细胞内化性能，使用DiI(红色)亲脂性染料标记ADMSC-Exo，并与PC12细胞共孵育12 h，荧光显微镜观察结果显示，外泌体可进入PC12细胞胞质，主要分布在细胞核周围，结果证明PC12细胞可摄取外泌体，见图3。



2.4   脂肪间充质干细胞及ADMSC-Exo转染效率   首先向脂肪间充质干细胞转染miR-29b-3p mimic及miR-29b-3p inhibitor，RT-qPCR检测转染后脂肪间充质干细胞中miR-29b-3p的转染效率，统计结果显示miR-29b-3p mimic转染的脂肪间充质干细胞中miR-29b-3p的表达显著上调，而miR-29b-3p inhibitor转染的脂肪间充质干细胞中miR-29b-3p的表达显著下调，见图4A；随后从细胞培养上清中提取外泌体，RT-qPCR检测外泌体中miR-29b-3p的表达水平，结果显示转染miR-29b-3p mimic的ADMSC-Exo中miR-29b-3p的表达上调，而转染miR-29b-3p inhibitor的ADMSC-Exo中miR-29b-3p的表达下调，见图4B。




2.5   过氧化氢处理PC12细胞半数致死浓度的确定   CCK-8法检测结果显示过氧化氢处理PC12细胞24 h的半数致死浓度为30 μmol/L，见图5，并以此浓度进行后续的实验。



2.6  ADMSC-Exo miR-29b-3p预处理减轻过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡  与对照组相比，30 μmol/L过氧化氢处理PC12细胞24 h后，细胞突起严重受损，细胞存活率显著降低；与过氧化氢组相比，ADMSC-Exo预处理后PC12细胞突起受损程度减轻，且存活率高于过氧化氢组；过表达miR-29b-3p的ADMSC-Exo 预处理后可进一步增强外泌体的保护作用；反之，抑制miR-29b-3p的表达则减弱了外泌体的神经保护作用，见图6A，B。TUNEL染色结果显示，与过氧化氢组相比，ADMSC-Exo预处理后PC12细胞的凋亡率明显下降；过表达miR-29b-3p的ADMSC-Exo预处理后细胞的凋亡率低于ADMSC-Exo预处理的PC12细胞，敲低miR-29b-3p的ADMSC-Exo预处理后细胞的凋亡率明显高于ADMSC-Exo预处理的PC12细胞，见图6C，D。Western blot进一步证实，过表达miR-29b-3p的ADMSC-Exo预处理可上调PC12细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，下调凋亡蛋白Bax的表达；相反，敲低miR-29b-3p表达的ADMSC-Exo预处理可下调PC12细胞中Bcl-2的表达，而上调Bax的表达，见图6E-G。

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脊髓损伤是一种复杂的病理过程，常发生于机械性损伤后，临床预后较差，给患者家庭和社会带来了巨大的负担[1-2]。统计数据显示，全世界约有250万名脊髓损伤患者，每年报告的新增诊断病例约为13万例[3]。目前，临床上尚无有效治疗脊髓损伤的方法，手术治疗、药物治疗、康复治疗等均不能有效重构受损脊髓的形态结构与神经纤维连接[4]。因此仍然迫切需要新的方法促进脊髓损伤的修复。
研究表明，干细胞移植可以减少脊髓空洞、改善脊髓损伤局部微环境、减轻胶质瘢痕的增生和促进神经再生，成为脊髓损伤修复研究的热点[5]。其中，间充质干细胞作为一种成体多能干细胞，具有多向分化潜能和微环境调控功能，同时由于易获取和可体外扩增的特点，已经被广泛用于骨修复、神经系统等疾病治疗的相关研究中[6-8]。有研究指出，间充质干细胞可通过分泌生长因子和细胞因子、分化为神经细胞、发挥免疫调节作用等促进脊髓损伤的修复[9]。然而，随着研究的深入，发现移植的干细胞往往存活率较
低[10-11]，并且有研究发现移植的干细胞往往并不能直接分化为神经元，而是通过外泌体(Exosome)等旁分泌成分发挥治疗作用[12]。间充质干细胞来源外泌体不仅具有与间充质干细胞相似的脂质膜结构，还具有间充质干细胞的归巢性、促血管生成、神经营养、免疫调节等性能[13]，同时应用外泌体治疗又可以避免直接移植干细胞时出现的一些不良反应[14]。研究表明，间充质干细胞外泌体可以通过减轻损伤后神经元凋亡、抑制炎症反应及A1星形胶质细胞的活化促进脊髓损伤的恢复[13，15-17]，但间充质干细胞外泌体在脊髓损伤中发挥治疗作用的具体机制仍有待阐明。
研究认为，外泌体主要依赖其内容物如RNA、miRNA、蛋白质、细胞因子及脂质等在脊髓损伤等疾病中发挥治疗作用。其中miRNAs可通过调节受体细胞的基因表达从而在多种疾病模型中发挥着至关重要的作用[18]。研究显示，大鼠脑缺血缺氧损伤后脑组织中miR-29b-3p的表达降低，并且骨髓间充质干细胞外泌体miR-29b-3p可以通过激活PTEN介导的Akt信号通路进而抑制凋亡及促进血管再生，从而预防大鼠缺氧缺血性脑损伤[19]；在小鼠肠缺血再灌注损伤模型中，miR-29b-3p表达降低，上调miR-29b-3p可以通过靶向TNF受体相关因子3抑制炎症及凋亡从而减轻肠缺血再灌注损伤[20]；同时miR-29b-3p是待鉴定的miR-29b家族成员之一，在心脏代谢性疾病[21]、血吸虫诱导的肝纤维化[22]、心肌纤维化等疾病中显示出治疗潜力[23]。作为其中众多的内容物之一，miR-29b-3p在脂肪间充质干细胞外泌体(adipose derived mesenchymal stem cell derived exosomes，ADMSC-Exo)治疗脊髓损伤中的作用尚未被完全阐明。
PC12细胞是一种常用的神经细胞株，研究中常用经诱导处理的PC12细胞模拟神经细胞损伤模型[24-25]，从而为脊髓损伤的治疗提供新的方法与手段。在继发性脊髓损伤阶段，氧化应激可通过引起脂质过氧化、改变蛋白和DNA氧化/氧化还原的状态，进而促进神经细胞的继发性凋亡[26]。在体外实验研究中，常应用过氧化氢处理细胞，模拟构建氧化应激损伤模型。因此，该研究通过过氧化氢处理PC12细胞模拟神经细胞氧化应激损伤模型，体外探索ADMSC-Exo对氧化应激引起神经细胞损伤的保护作用机制，旨在为脊髓损伤治疗提供新的思路及靶点。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   随机对照动物实验。不同处理组间的比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2021年5月至2022年6月在滨州医学院解剖教研室实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   实验选用SPF级雌性SD大鼠20只，体质量220-250 g，8-10周龄，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK(鲁)2019 0003。大鼠分笼饲养于滨州医学院神经生物学研究所动物房，在滨州医学院实验动物饲养中心标准条件下饲养，人工控制光照 (12∶12光/暗周期)，温度为(22±2) ℃，相对湿度为(55±10)%，提供可供大鼠自由摄取的水和食物，所有大鼠在实验前至少适应新环境7 d。
   所有动物实验方案均获得滨州医学院实验动物伦理委员会批准，审批号为2018-27。
1.3.2   实验细胞   PC12细胞株(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。
1.3.3   实验用主要仪器和试剂   戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)；流式细胞仪(BD公司)；倒置荧光显微镜(蔡司)；超速离心机(Himac CP80WX)；透射电子显微镜(电子株式会社)；马尔文zata电位及纳米粒度分析仪(英国马尔文)；电泳仪、基因扩增仪(BIO-RAD)；紫外分光光度计(Thermo scientific)；荧光定量PCR仪(Applied Biosysterms)；洁净工作台(苏净安泰)；多功能酶标仪(BioTek)；Anti-Nestin (Affinity)；Anti-SOX2 (Proteintech)；FITC anti-rat CD44(BioLegend公司)；PE anti-rat CD45(BioLegend公司)；APC anti-rat CD90(BioLegend公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio)；Anti-CD63(Proteintech)；Anti-Alix(Abcam)；Anti-TSG101(Abcam)；DiI细胞膜荧光探针橙红色(美仑生物)；Anti-Bax(Proteintech)；Anti-Bcl-2(Proteintech)；Anti-GAPDH (Proteintech)；Trizol试剂(TAKARA)；GP-transfect-Mate(吉玛基因)；山羊抗兔IgG/辣根酶标记(中杉金桥)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、细胞增殖及毒性检测试剂盒(美仑生物)。
1.4   实验方法   
1.4.1   脂肪间充质干细胞的分离培养及鉴定
(1)分离培养：采用230 mg/kg戊巴比妥钠对SD大鼠实施安乐死，将大鼠剃毛后经体积分数75%乙醇浸泡除菌，于无菌条件下提取大鼠腹股沟区皮下或附睾周围的脂肪组织，将脂肪组织充分剪碎后加入PBS以2 000 r/min的转速离心10 min，取上层脂肪后加入PBS后再重复离心，以两三倍体积加入0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃细胞培养箱消化45 min-1 h，加等体积完全培养基(DMEM/F12基础培养基+体积分数10%胎牛血清+1%双抗)终止消化，过75 μm滤网，将过滤液以2 000 r/min的转速离心10 min，离心后弃上清，加适量的红细胞裂解液，常温裂解2 min，加PBS终止裂解，以450×g离心力离心5 min，离心后加入适量的完全培养基，过75 μm滤网，将滤过液移入细胞培养瓶中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的细胞培养箱中进行培养，每隔3 d换液1次；待细胞生长至融合度达80%-90%时，即可进行胰酶消化传代    处理。
(2)流式细胞术鉴定：取第3代脂肪间充质干细胞使用胰酶消化后，在4 ℃条件下以1 000 r/min转速离心5 min，离心后弃去上清，加入适量PBS重悬细胞，随后加入抗大鼠的CD44、CD45、CD90抗体，于避光条件下孵育30 min，离心，经PBS重悬洗涤后上流式细胞仪进行检测。
(3)多向分化性鉴定：①成脂诱导分化鉴定：取第3代脂肪间充质干细胞接种于6孔板中，完全培养基培养至细胞融合度达到100%或过融合时，加入成脂诱导培养液(G-DMEM、体积分数为10%胎牛血清、10 μmol/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松)继续培养，每间隔3 d更换1次诱导液，诱导2周后在光镜下可观察到细胞形态改变，胞质中出现大量脂滴时，使用油红O染液对脂滴进行染色，最后使用倒置显微镜观察脂滴染色情况。②成骨诱导分化：取第3代脂肪间充质干细胞接种于6孔板中，完全培养基培养至细胞融合度达到60%-70%，加入成骨诱导培养液(完全培养液、50 μmol/L抗坏血酸、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠)继续培养，每间隔3 d更换1次诱导液，待成骨诱导3周后，视细胞的形态改变及产生钙结节数量，用茜素红染液对细胞进行染色，最后使用光学显微镜观察染色效果。③成神经干诱导分化：取第3代脂肪间充质干细胞接种于6孔板中，加入神经诱导培养液(含20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2% B27的DMEM/F12)培养，待视野中出现桑葚状细胞球时，使用40 g/L多聚甲醛固定细胞，Triton对细胞进行破膜，用体积分数10%山羊血清室温封闭30 min；同时加入适量一抗(兔抗大鼠Nestin抗体，1∶200；小鼠抗大鼠SOX2抗体，1∶500)，于4 ℃条件下孵育过夜；玻片经PBS清洗3次，每次10 min，同时滴加二抗(Alexa Fluor 488 山羊抗兔，1∶200及Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠，1∶200)，室温避光孵育2 h；玻片经PBS 清洗3次，每次10 min，滴加DAPI复染，室温孵育8 min；PBS清洗3次，每次10 min，滴加抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封固，荧光显微镜拍摄。
1.4.2   外泌体的提取及鉴定
(1)外泌体的提取：当脂肪间充质干细胞达到80%融合时，用含无外泌体血清的培养液继续培养48 h，收集细胞培养上清液，在4 ℃条件下首先以300×g离心力离心10 min以去除活细胞、死细胞；取上清以3 000×g离心力离心10 min去除细胞碎片，离心后取上清，以10 000×g离心力离心30 min以去除较大的细胞囊泡，离心后取上清，以100 000×g离心力在4 ℃下持续离心90 min，弃去上清，留下的沉淀加入适量PBS重悬，再次以100 000×g离心力离心90 min以去除沉淀中的蛋白杂质，最后将所得沉淀溶于适量PBS中。
(2)外泌体的鉴定：①首先将外泌体溶液充分稀释后滴在封口膜洁净面，把铜网膜面放在外泌体液滴上，悬浮10 min后用滤纸缓慢吸干，转移铜网到3%戊二醛固定液液滴上，悬浮5 min，用滤纸吸干，转移铜网到蒸馏水液滴上，10次，每次2 min，每次均用滤纸吸干；转移铜网到4%醋酸双氧铀染液液滴上，悬浮10 min，用滤纸吸干，转移铜网到1%甲基纤维素液滴上，悬浮5 min，用滤纸吸干，自然晾干后使用透射电子显微镜观察记录。②吸取10 μL提取的外泌体样本，用PBS稀释为1 mL，并用旋涡混合器混合均匀，然后使用注射器将样品缓慢注入到马尔文zeta电位及纳米粒度分析仪样品池，测定外泌体的粒径大小，并记录检测结果。③最后使用Micro BCA蛋白质定量检测试剂对外泌体进行蛋白定量，采用Western blot检测外泌体表面特异性标记蛋白CD63、TSG101及Alix的表达。
1.4.3   外泌体的标记及细胞摄取实验   为了进一步探讨ADMSC-Exo的特性和潜在功能，使用DiI红色亲脂性染料标记ADMSC-Exo。取适量的DiI染料，加入二甲基亚砜配制成质量浓度为2 mg/mL储存液，储存液于-20 ℃保存，使用时用无血清培养基将储存液继续稀释1 000倍即2 μg/mL的工作液。
   ADMSC-Exo 的染色孵育条件为37 ℃，5 min，然后转移至4 ℃，15 min，之后通过2次超速离心去除未结合染料，从而完成对外泌体的标记染色。将DiI标记的ADMSC-Exo与PC12细胞共孵育12 h，用40 g/L多聚甲醛固定PC12细胞30 min，PBS洗涤2次，使用DAPI于室温下染色8 min，经PBS充分洗涤后通过荧光显微镜检测外泌体的细胞内化作用。
1.4.4   脂肪间充质干细胞转染   大鼠miR-29b-3p mimic，miR-29b-3p inhibitor，miR mimics negative control (mimic NC)，miR inhibitor negative control (inhibitor NC)及转染试剂GP-transfect-Mate均购自上海吉玛基因。当脂肪间充质干细胞达60%-80%融合度时，按照制造商的说明，使用GP-transfect-Mate转染试剂向脂肪间充质干细胞中分别转染miR-29b-3p mimic，miR-29b-3p inhibitor，miR NC，inhibitor NC。转染后，37 ℃静置培养细胞，4-6 h更换为完全培养基，24-72 h检测mRNA表达。然后细胞继续在无外泌体血清的培养基中培养48 h，收集细胞培养上清，按1.4.2(1)方法提取外泌体。
1.4.5   RT-qPCR检测miR-29b-3p的表达   用Trizol试剂分别从脂肪间充质干细胞、ADMSC-Exo中提取总RNA；根据miRNAs定量试剂盒(上海吉玛基因)说明，对细胞及外泌体中miR-29b-3p进行定量分析。
1.4.6   PC12细胞的培养   首先取出冻存的PC12细胞，37 ℃快速融化，移入15 mL离心管中，加入5 mL完全培养液(1640培养基+体积分数10%胎牛血清+1%双抗)稀释冻存液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入完全培养液重悬，以1×109 L-1的细胞浓度接种于T25培养瓶中，每2 d更换1次培养基，待细胞融合度达70%-80%时进行胰酶消化传代处理，应用第5代PC12细胞进行后续实验。
1.4.7   细胞分组   细胞实验分为5组：①对照组：未处理的PC12细胞；②过氧化氢组：过氧化氢处理PC12细胞24 h；③外泌体组：先用外泌体预处理PC12细胞24 h后再用过氧化氢继续处理24 h；④Exo-miR-29b-3p mimic组；先用高表达miR-29b-3p的外泌体预处理PC12细胞24 h后再用过氧化氢继续处理24 h；⑤Exo-miR-29b-3p inhibitor组：先用敲低miR-29b-3p表达的外泌体预处理PC12细胞24 h后再用过氧化氢继续处理24 h。
1.4.8   过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型的建立   取生长状态良好的PC12细胞，经胰酶消化处理后以每孔约1×104个的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分别使用以10，20，30，40，50 μmol/L过氧化氢处理24 h以诱导PC12细胞损伤。采用CCK-8法通过测定细胞存活率以确定细胞的半数致死浓度，并以此浓度进行后续实验。
1.4.9   细胞增殖活性检测   将生长状态良好的PC12细胞以每孔1×104的细胞密度接种于96孔板，待细胞贴壁后分别加入终质量浓度为1 µg/µL的正常外泌体、高表达miR-29b-3p的外泌体及低表达miR-29b-3p的外泌体10 µL，预处理PC12细胞24 h，继续用半数致死浓度的过氧化氢继续处理24 h，每孔加入 10 μL CCK-8 增强型溶液或者直接配置含10% CCK-8增强型溶液的培养基，以换液的形式加入，放于细胞培养箱内培养0.5-1 h。采用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度值，实验分别设置对照孔、实验孔和空白孔，以各组细胞存活率与对照组细胞存活率的比值作为统计数值。
1.4.10   TUNEL染色   将无菌的细胞爬片放于24孔板中，取第5代PC12细胞以每孔5×104个的细胞数量接种于24孔板中，待细胞贴壁后分别加入终质量浓度为1 µg/µL的正常外泌体、高表达miR-29b-3p的外泌体及低表达miR-29b-3p的外泌体50 µL，预处理PC12细胞24 h，然后用半数致死浓度的过氧化氢继续处理24 h进行细胞凋亡染色。首先在室温条件下使用40 g/L多聚甲醛固定30 min，经PBS洗涤后，使用终质量浓度为20 μg/mL的Proteinase K室温通透5 min，充分洗涤后在样本上滴加适量TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，经PBS充分洗涤后用DAPI在室温下染色8 min，经充分洗涤后加入适量抗荧光衰减封片剂封固，荧光显微镜观察。根据荧光显微镜下观察到的阳性细胞百分率计算细胞凋亡指数。
1.4.11   Western blot检测   用RIPA裂解液分别从各组细胞及外泌体中提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，将膜与下列一抗在4 ℃下孵育过夜：anti-CD63(1∶5 000)、anti-Alix(1∶1 000)、anti-TSG101(1∶2 000)、anti-Bax(1∶5 000)、anti-Bcl-2(1∶2 000)、anti-GAPDH(1∶5 000)，第2天聚偏二氟乙烯膜用含吐温的Tris-Buffer生理盐水于摇床上清洗3次，每次15 min，在室温下与二抗孵育2 h，然后用TBST清洗3次。最后，使用Bio-Rad图像实验室系统(Hercules，CA，USA)可视化蛋白质条带，并使用ImageJ软件进行吸光度分析。
1.5   主要观察指标   ①脂肪间充质干细胞和ADMSC-Exo的鉴定结果；②ADMSC-Exo的细胞摄取情况；③脂肪间充质干细胞及ADMSC-Exo的转染效率；④ADMSC-Exo miR-29b-3p预处理对过氧化氢诱导的PC12细胞的影响。
1.6   统计学分析   使用IBM SPSS 22.0 软件对所得实验数据进行统计分析，使用Shapiro-Wilk正态性检验方法判断所得实验数据是否符合正态分布。数据符合正态性，以x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，并采用Least-Significant Difference检验进行事后两两比较；P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过滨州医学院生物统计学专家审核。

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统疾病，疾病发生后会出现损伤平面以下感觉/运动功能的部分或全部丧失，甚至导致截瘫或四肢瘫的发生，同时还会产生一些并发症，如感染、心脏功能减退、呼吸、膀胱和肠道功能障碍，对脊髓损伤患者的生活产生了巨大影响，并给社会带来了沉重的负担[27]。脊髓损伤可分为原发性和继发性损伤，因原发性损伤具有不可预测性，目前临床前研究多旨在减轻脊髓损伤后的继发性损伤，其中抑制继发性损伤后氧化应激所导致的神经细胞继发性凋亡，是针对脊髓损伤治疗的研究重点。研究显示，干细胞疗法在脊髓损伤中展现了一定的治疗效果[28]，随着对脊髓损伤研究的深入，人们发现与干细胞疗法相比，外泌体作为细胞旁分泌的重要成分，在发挥干细胞治疗作用的同时又可以避免直接干细胞移植出现的一些不良反应，如免疫排斥、细胞去分化、肿瘤形成及伦理学争议等，成为当前治疗脊髓损伤等神经系统疾病的研究热点[29]。研究表明，间充质干细胞外泌体可以通过减轻损伤后神经元凋亡、抑制炎症反应及A1星形胶质细胞的活化促进脊髓损伤的恢复[13，17，30]，但其发挥作用的机制尚未被完全阐明，而miRNA作为外泌体的内容物，在外泌体发挥神经保护作用中扮演着重要的角色。因此为了研究ADMSC-Exo及其内容物miR-29b-3p的神经保护作用，该实验通过对ADMSC-Exo进行基因表达处理，研究ADMSC-Exo miR-29b-3p对氧化应激导致的神经细胞凋亡的影响，旨在为进一步的脊髓损伤治疗提供新思路与新靶点。
在间充质干细胞众多来源中，脂肪来源间充质干细胞备受关注，不仅具有多能性和可塑性，而且数量丰富，在临床应用中可以通过微创手术技术获得[31]。有研究指出，脂肪间充质干细胞可通过减轻胶质瘢痕增生、促进神经细胞存活、抗炎及促进轴突生长进而促进脊髓损伤的修复[32]。该研究通过胶原酶消化法提取了大鼠脂肪间充质干细胞，流式细胞术及多向分化鉴定结果提示细胞已成功提取。外泌体是一种由细胞分泌的直径在30-50 nm的细胞外囊泡，其脂质膜结构可以保护其内容物不被降解，从而介导携带的生物信息的远程传递[33]。有研究表明，脂肪间充质干细胞产生的外泌体量最大[34]，ADMSCs-Exo可通过分泌miRNA发挥神经保护作用，抑制细胞凋亡途径，调节细胞周期，促进细胞增殖[35]。ADMSC-Exo可以通过减轻炎症反应进而促进脊髓损伤的恢复[30，36]，而外泌体发挥作用的相关机制仍需进一步探索。该研究首先采用超速离心法从细胞培养上清中提取外泌体，并对其进行鉴定。透射电镜观察显示所提取纳米粒子具有典型的杯状结构，激光粒度仪检测结果显示所提取纳米粒子直径较均一，分布在50-140 nm范围内，Western blot检测结果显示所提取纳米粒子表达外泌体表面特异性标志膜蛋白，这些结果表明外泌体已成功分离。该研究使用亲脂性染料标记外泌体并与PC12细胞共孵育，免疫荧光显示外泌体可成功被细胞摄取，这可能与外泌体是纳米级的细胞外囊泡及具有脂质膜结构相关，结果进一步提示外泌体可通过作用于受体细胞发挥相应效应以进行细胞间通讯。研究发现外泌体可以将miRNA等分子信号传递给邻近细胞，并改变受体细胞的转录活性[37]。一些研究采用向细胞转染miRNA模拟物或抑制物然后进一步分离细胞外泌体，从而达到过表达或敲低外泌体中某一miRNA含量的目的[19，38-39]。为了研究ADMSC-Exo及其内容物miR-29b-3p对氧化应激导致的细胞损伤的影响，该研究分别向脂肪间充质干细胞转染miR-29b-3p模拟物与抑制物，然后进一步提取外泌体，RT-qPCR结果显示，与对照组相比，转染后ADMSC-Exo中miR-29b-3p表达显著升高或降低，表明用此种方法可以有效调节ADMSC-Exo中的特定miRNA的含量，用于调高或调低外泌体中miRNA，进行实验研究或临床应用。
研究认为，在脊髓损伤发生早期，损伤区域会发生严重的炎症反应，同时氧化应激水平显著升高，进而会造成神经元的大范围损伤和凋亡[40]，因此抑制脊髓损伤早期引起的神经细胞凋亡对脊髓损伤预后具有重要意义。PC12 细胞是从可移植的大鼠嗜铬细胞瘤中克隆而来，具有交感神经元的生理、生化特征，研究常用过氧化氢干预诱导PC12细胞产生氧化应激损伤[24，41]。因此，该研究选用过氧化氢处理的PC12细胞模拟脊髓损伤后神经细胞的氧化应激损伤，结果显示，以半数致死浓度过氧化氢处理PC12细胞后，细胞存活率降低，细胞凋亡率增加，细胞促凋亡相关蛋白表达增加、抗凋亡蛋白表达减少，进一步说明该研究构建的体外模型与脊髓损伤后脊髓组织细胞相关凋亡指标变化具有相似性[42]。该研究发现，ADMSC-Exo对氧化应激诱导的神经细胞损伤具有保护作用。ADMSC-Exo可通过携带miR-29b-3p减轻过氧化氢干预的PC12细胞的破坏程度，增加细胞存活率，降低细胞凋亡率，降低促凋亡蛋白Bax的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而发挥抗凋亡作用。
综上所述，ADMSC-Exo miR-29b-3p 预处理可减轻过氧化氢诱导PC12细胞引起的细胞凋亡。实验为ADMSC-Exo治疗脊髓损伤提供了依据，同时研究结果也提示高表达miR-29b-3p可增强ADMSC-Exo的抗凋亡作用，为进一步提高外泌体的治疗作用提供了借鉴；但该研究仅在体外对ADMSC-Exo的作用及发挥作用的机制进行了初步探索，仍需要进一步的体内研究进一步验证，这将是下一步研究的内容。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

外泌体：来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到细胞外基质中，通过作用于受体细胞而发挥作用。
miR-29b-3p：是一种非编码微小RNA，由23个核糖核苷酸组成，可以通过调节不同靶基因的表达，在减少细胞凋亡、促进血管新生及轴突再生等方面发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脊髓损伤是一种复杂的病理过程，减轻脊髓损伤后氧化应激水平进而抑制继发性神经细胞凋亡是目前针对脊髓损伤治疗的研究重点。在脊髓损伤的治疗方法中，外泌体疗法以其独特的优势成为了目前研究的热点，其中间充质干细胞外泌体在脊髓损伤中展现了一定的治疗效果，但其发挥作用的具体机制尚未被完全阐明。本研究通过构建了脊髓损伤后细胞氧化应激损伤模型，对间充质干细胞外泌体发挥作用相关机制进行了初步探索，旨在为脊髓损伤的治疗提供新的思路及靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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