枸杞多糖经自噬抑制烧伤创面角质细胞凋亡的作用机制

doi:10.12307/2024.390

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (23): 3686-3691.doi: 10.12307/2024.390

• 皮肤粘膜组织构建 skin and mucosal tissue construction • 上一篇下一篇

枸杞多糖经自噬抑制烧伤创面角质细胞凋亡的作用机制

朱永朝，房超，赵芳，张庆，赵丹

宁夏医科大学总医院，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2023-05-05 接受日期:2023-06-28 出版日期:2024-08-18 发布日期:2023-09-13
通讯作者: 赵丹，研究实习员，宁夏医科大学总医院，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:朱永朝，男，1981年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，博士，副研究员，主要从事细胞自噬及组织修复方向研究。房超，男，1987年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，主治医师，主要从事皮肤组织修复方向研究。
基金资助:
宁夏回族自治区自然科学基金项目(2020AAC03412)；项目负责人：赵丹

Mechanism by which lycium barbarum polysaccharides inhibit keratinocyte apoptosis in burn wounds via autophagy

Zhu Yongzhao, Fang Chao, Zhao Fang, Zhang Qing, Zhao Dan

General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-05-05 Accepted:2023-06-28 Online:2024-08-18 Published:2023-09-13
Contact: Zhao Dan, Research assistant, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Zhu Yongzhao, MD, Associate researcher, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Fang Chao, Attending physician, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2020AAC03412 (to ZD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

创面愈合：皮肤创面愈合是指皮肤创面通过上皮重新铺设和伤口收缩而闭合。一般认为可分为止血、炎症、增殖和重建4个阶段，涉及许多不同组织和细胞谱系的相互作用。在人皮肤中，角质细胞是皮肤损伤的第一反应者，也是皮肤愈合的最后一个步骤。角质细胞以尽可能快的速度重新增殖、分化、迁移，关闭伤口，达到皮肤愈合状态。
自噬：是真核生物中一个复杂的分解代谢过程，通过自噬体形成和溶酶体降解来降解和回收细胞质成分，自噬对于维持细胞稳态至关重要。然而，越来越多的证据表明，自噬在细胞存活和细胞死亡中起着双重作用，异常的自噬能够促进神经元凋亡级联反应的激活，且在多种疾病模型中，自噬能够促进细胞凋亡。

背景：枸杞多糖具有多种生物活性，研究发现其具有促进创面愈合的潜在效用。

目的：探讨枸杞多糖在肿瘤坏死因子α介导角质细胞凋亡中的作用以及对烧伤创面愈合的作用。
方法：①体外实验：将角质细胞分4组培养，正常组加入含体积分数15%胎牛血清及1%谷氨酰胺的α-MEM培养基(完全培养基)，阳性对照组加入含枸杞多糖的完全培养基，模型组加入含肿瘤坏死因子α的完全培养基，实验组加入含枸杞多糖与肿瘤坏死因子α的完全培养基。培养24 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot检测凋亡蛋白Cleaved caspase-8、TNF R1、FADD及自噬蛋白LC3的表达。在正常组、模型组、实验组的基础上，再增加自噬抑制剂组(加入含 3-甲基腺嘌呤的完全培养基)、自噬抑制剂+枸杞多糖组(加入含枸杞多糖、肿瘤坏死因子α与3-甲基腺嘌呤的完全培养基)，培养24 h后，采用流式细胞术检测角质细胞凋亡情况。②体内实验：采用随机数字表法将6只SD大鼠分为对照组与实验组，每组3只。在每只大鼠背部制作4个直径2 cm的深Ⅱ度烧伤创面模型，造模24 h后，对照组与实验组小鼠创面分别涂抹生理盐水、枸杞多糖溶液，1次/d。治疗后定期观察创面愈合情况，治疗后28 d取材，观察创面病理形态。

结果与结论：①体外实验：单独加入枸杞多糖不影响角质细胞的增殖、凋亡与凋亡及自噬蛋白的表达；加入肿瘤坏死因子α后，角质细胞增殖受到抑制、凋亡率增加、凋亡及自噬蛋白的表达升高，枸杞多糖可拮抗肿瘤坏死因子α介导的上述作用；枸杞多糖联合自噬抑制剂组可进一步降低角质细胞的凋亡率；②体内实验：实验组大鼠治疗后12，16，20，24，28 d的创面愈合率均高于对照组(P < 0.05，P < 0.01)；治疗后28 d的苏木精-伊红染色显示，与对照组相比，实验组大鼠创面表皮完整、清晰；③结果表明：枸杞多糖通过抑制角质细胞的自噬及凋亡来保护皮肤表皮组织的完整性，促进创面的愈合。

https://orcid.org/0000-0003-3834-0142(赵丹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 角质细胞, 肿瘤坏死因子α, 枸杞多糖, 凋亡, 自噬, 创面愈合

Abstract: BACKGROUND: Lycium barbarum polysaccharide has many biological activities and has been found to have potential effects on promoting wound healing.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of lycium barbarum polysaccharide in tumor necrosis factor-α-mediated keratinocyte apoptosis and its effect on the healing of burn wounds.
METHODS: (1) In vitro experiment: Keratinocytes were divided into four groups: cells were cultured in the α-MEM medium (complete medium) containing 15% fetal bovine serum and 1% glutamine in normal group, cultured in the complete medium containing lycium barbarum polysaccharide in positive control group, cultured in the complete medium containing tumor necrosis factor-α in model group, and cultured in the complete medium containing lycium barbarum polysaccharide and tumor necrosis factor-α in experimental group. After 24 hours of culture, cell proliferation was detected using cell counting kit-8 assay; Cleaved caspase-8, TNF R1, FADD, and LC3 were detected using western blot. Then an autophagy inhibitor group (the complete medium containing 3-methyladenine) and an autophagy inhibitor+lycium barbarum polysaccharide group (the complete medium containing lycium barbarum polysaccharide, tumor necrosis factor-α, and 3-methyladenine) were set up. After 24 hours of culture, keratinocyte apoptosis was detected by flow cytometry. (2) In vivo experiment: Six Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group and an experimental group, with three rats in each group. Four deep II degree burn wounds with a diameter of 2 cm were made on the back of each rat. At 24 hours after modeling, mice in the control and experimental groups were coated with normal saline and lycium barbarum polysaccharide solution, respectively, once a day. Wound healing was observed regularly after treatment. Samples were taken 28 days after treatment and the pathologic pattern of the wound was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment: Addition of lycium barbarum polysaccharide alone did not affect cell proliferation and apoptosis and the expression of apoptotic and autophagic proteins in keratinocytes. After the addition of tumor necrosis factor α, the proliferation of keratinocytes was inhibited, the apoptotic rate increased, and the expression of apoptotic and autophagic proteins was elevated, while lycium barbarum polysaccharide could antagonize the above effects of tumor necrosis factor-α. Lycium barbarum polysaccharide combined with autophagy inhibitors further reduced the apoptotic rate of keratinocytes. (2) In vivo experiment: The wound healing rate of rats in the experimental group was higher than that of the control group at 12, 16, 20, 24, and 28 days after treatment (P < 0.05, P < 0.01). Hematoxylin-eosin staining results at 28 days after treatment showed an intact and well-defined epidermis of the wound in the experimental group compared with the control group. To conclude, lycium barbarum polysaccharide protects the integrity of skin epidermal tissue and promotes wound healing by inhibiting autophagy and apoptosis of keratinocytes.

Key words: keratinocyte, tumor necrosis factor-α, lycium barbarum polysaccharide, apoptosis, autophagy, wound healing

中图分类号:

朱永朝, 房超, 赵芳, 张庆, 赵丹. 枸杞多糖经自噬抑制烧伤创面角质细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3686-3691.

Zhu Yongzhao, Fang Chao, Zhao Fang, Zhang Qing, Zhao Dan. Mechanism by which lycium barbarum polysaccharides inhibit keratinocyte apoptosis in burn wounds via autophagy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3686-3691.

图/表（结果） 6

2.1 体外实验结果
2.1.1 各组角质细胞增殖情况 CCK-8检测结果显示，与正常组(100%)比较，阳性对照组细胞存活率无明显变化[(104.60±3.25)%，P > 0.05]，模型组细胞存活率明显降低[(41.42±2.90)%，P < 0.01]；与模型组比较，实验组细胞存活率升高[(70.61±4.12)%，P < 0.01]，见图2，说明枸杞多糖能够保护角质细胞，减少肿瘤坏死因子α对角质细胞增殖的抑制作用。

2.1.2 各组角质细胞凋亡情况流式细胞术检测结果显示，正常组、阳性对照组、模型组与实验组的细胞凋亡率分别为(6.87±0.27)%，(6.25±0.32)%，(38.50±0.16)%，(23.89±0.23)%，见图3A。与正常组相比，肿瘤坏死因子α干预的角质细胞发生明显凋亡(P < 0.05)；与模型组比较，实验组细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)。
为了进一步确认枸杞多糖能够抑制肿瘤坏死因子α介导角质细胞的凋亡作用，利用Western blot检测细胞凋亡蛋白Cleaved caspase-8、TNF R1、FADD的蛋白水平，结果见图3B、C。与正常组比较，阳性对照组细胞内Cleaved caspase-8、TNF R1、FADD的蛋白表达均无明显变化(P > 0.05)，模型组细胞内Cleaved caspase-8、TNF R1、FADD的蛋白表达均升高(P < 0.01)；与模型组比较，实验组细胞内Cleaved caspase-8、TNF R1、FADD的蛋白表达均降低(P < 0.01)。

为了进一步确认枸杞多糖通过抑制自噬保护炎性微环境下角质细胞凋亡，利用Western blot检测自噬蛋白LC3的表达水平，结果见图4。与正常组比较，阳性对照组细胞内LC3的蛋白表达均无明显变化(P > 0.05)，模型组细胞内LC3的蛋白表达升高(P < 0.01)；与模型组比较，实验组细胞内LC3的蛋白表达降低(P < 0.01)。

为了进一步确定自噬在角质细胞凋亡中的作用，使用自噬抑制剂进行干预，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况。流式细胞术检测结果显示，正常组、自噬抑制剂组、模型组、实验组、自噬抑制剂+枸杞多糖组的细胞凋亡率分别为(7.83±0.29)%，(7.33±0.28)%，(43.00±0.24)%，(24.96±0.12)%，(15.90±0.19)%，见图5。与正常组比较，自噬抑制剂组细胞凋亡率无明显变化(P > 0.05)，模型组细胞凋亡率升高(P < 0.01)；与模型组比较，实验组细胞凋亡率降低(P < 0.01)；与实验组比较，自噬抑制剂+枸杞多糖组细胞凋亡率降低(P < 0.01)。

综上所述，枸杞多糖能够抑制肿瘤坏死因子α介导的角质细胞自噬。
2.2 体内实验结果
2.2.1 实验动物数量分析对照组3只与实验组3只大鼠全部进入结果分析。
2.2.2 两组大鼠创面愈合率比较随着治疗时间的延长，两组大鼠创面面积缩小，创面愈合率升高；与对照组相比，实验组治疗后12，16，20，24，28 d时的创面面积缩小明显(P < 0.05，P < 0.01)，创面愈合率升高明显(P < 0.05，P < 0.01)，见图6。

2.2.3 两组大鼠创面病理形态观察造模后24 h的苏木精-伊红染色显示，正常皮肤组织完整、形态正常；烧伤后的皮肤表皮坏死、真皮层组织受损，提示造模成功(图7A)。治疗后28 d的苏木精-伊红染色显示，与对照组相比，实验组大鼠创面表皮完整、清晰(图7B)。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，体内动物实验，多组间比较采用方差分析，两组间比较使用配对t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年2月至2023年4月在宁夏医科大学总医院外科学研究室与宁夏医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要材料角质细胞购自于中国细胞库；谷氨酰胺、α-MEM培养基、胎牛血清购自于赛默飞世尔科技有限公司；枸杞多糖购自宝鸡辰光生物技术有限公司；肿瘤坏死因子α、3-甲基腺嘌呤、Cleaved caspase-8、FADD、β-Tubulin、TNF R1、LC3抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；CCK-8购自碧云天生物技术有限公司；AV-PI试剂盒购自兰杰柯科技有限公司；戊巴比妥钠购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3.2 实验动物选取雌性SD大鼠7只，六七月龄，体质量250-350 g，购自宁夏医科大学总医院实验动物中心，许可证号：SCXK(宁)2020-0001。动物实验获宁夏医科大学总医院科研伦理委员会批准；批准号为2020-114。
1.4 实验方法
1.4.1 体外实验
角质细胞培养：加入含体积分数15%胎牛血清及1%谷氨酰胺的α-MEM培养基(完全培养基)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。
CCK-8法检测角质细胞增殖：将角质细胞以1×103/孔的密度种到96孔板中，分4组培养：正常组加入完全培养基，阳性对照组加入含100 μg/mL枸杞多糖的完全培养基，模型组加入含10 ng/mL肿瘤坏死因子α的完全培养基[23]，实验组加入含100 μg/mL枸杞多糖与10 ng/mL肿瘤坏死因子α的完全培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。培养24 h后，向每个孔中加入CCK-8溶液(50 µL)继续孵育1 h，利用酶标仪在450 nm处测定吸光度值。每组实验重复3次。
Western blot检测相关蛋白表达：实验分组及干预同细胞增殖检测。培养24 h后，利用Western blot检测凋亡蛋白Cleaved caspase-8、TNF R1、FADD及自噬蛋白LC3的表达。用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，用BCA蛋白含量检测试剂盒检测并计算蛋白浓度。随后，在12%SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上后封闭。将膜与Cleaved caspase-8、TNF R1、FADD、β-Tubulin、LC3抗体(稀释比均为1∶1 000)在4 ℃条件下孵育过夜。将膜与相应的二抗孵育1 h，使用多功能成像仪曝光(Amersham Imager 680)，采用Image-J软件对Western blot数据进行分析。
流式细胞术检测角质细胞凋亡：①实验分组及干预同细胞增殖检测，培养24 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡。②将角质细胞以1×103/孔的密度种到96孔板中，分5组培养：正常组加入完全培养基，模型组加入含10 ng/mL肿瘤坏死因子α的完全培养基，实验组加入含100 μg/mL枸杞多糖与10 ng/mL肿瘤坏死因子α的完全培养基，自噬抑制剂组(加入含5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤的完全培养基)、自噬抑制剂+枸杞多糖组(加入含100 μg/mL枸杞多糖、10 ng/mL肿瘤坏死因子α与5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤的完全培养基)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。培养24 h后，收集角质细胞。按照厂家说明书使用Annexin V/PI凋亡分析试剂盒进行染色，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.4.2 体内实验

建立深Ⅱ度烧伤创面模型[24]：腹腔注射1%戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉7只SD大鼠，将加热棒(直径2 cm、高3 cm、质量200 g)的温度加热至100 ℃，敷在背部皮肤上6 s，产生深Ⅱ度烧伤创面，每只大鼠制作4个深Ⅱ度烧伤创面，创面之间间隔3 cm(图1)。为了保证创面的一致性，由一人操作所有创面。造模24 h后取1只大鼠，麻醉后处死，取烧伤创面中间及未烧伤部位皮肤组织，浸泡在甲醛中，进行苏木精-伊红染色证实造模成功。随后采用随机数字表法将剩余的6只大鼠分为对照组与实验组，每组3只，对照组大鼠创面涂抹生理盐水，实验组大鼠创面涂抹枸杞多糖溶液(100 mg/mL，溶剂为角质细胞培养液)，1次/d，使用纱布覆盖、弹力绷带围绕固定。

创面愈合情况观察：治疗后4，8，12，16，20，24 d，观察大鼠进食及活动是否正常、创面面积是否减小，并对创面进行拍照，使用Image-J软件测量创面面积，计算创面愈合率。
创面病理形态观察：治疗后28 d，麻醉后处死大鼠，切取创面组织，使用体积分数10%缓冲中性甲醛液固定48 h，脱水后使用石蜡包埋、切片，染色前将蜡块进行脱蜡和水化，使用苏木精染色4-6 min，温水返蓝1 min左右，使用伊红染色30 s-1 min后，水洗、脱水，最后使用中性树胶封固，显微镜下观察。
1.5 主要观察指标体外细胞实验与体内动物实验结果。
1.6 统计学分析使用SPSSAU 18软件进行统计分析，多组间比较采用方差分析，两组间比较使用配对t检验，当P < 0.05时差异有显著性意义。文章统计学方法已经由宁夏医科大学总医院赵芳审核。

讨论

细胞凋亡是烧伤创面进展的促成因素之一，抑制细胞凋亡减少持续的组织损失能够促进烧伤创面愈合[24-26]。研究表明，由于体表皮肤角质细胞损伤，烧伤患者创面浸润大量肿瘤坏死因子α等炎性因子，导致细胞活力显著下降[27]。因此，此次研究利用AV/PI细胞流式法和Western blot检测了细胞凋亡相关蛋白表达，结果显示，当使用枸杞多糖处理角质细胞时，凋亡蛋白减少、细胞凋亡减弱。有意思的是，结果显示单独使用枸杞多糖对细胞凋亡并无明显变化，表明枸杞多糖并不能直接影响角质细胞的凋亡，而是对肿瘤坏死因子α介导的细胞凋亡具有抑制作用。可以推测，在创面愈合过程中枸杞多糖能够抑制肿瘤坏死因子α诱导的角质细胞凋亡。
肿瘤坏死因子α同时参与细胞的凋亡与自噬，且自噬在细胞存活和细胞死亡中起着双重作用[28-29]。CAO等[29]发现异常的自噬能够促进神经元凋亡级联反应的激活，且可以通过 3-甲基腺嘌呤等自噬抑制剂缓解。然而，YOUNG等[30]发现自噬通过抑制肿瘤坏死因子α诱导的细胞凋亡来保护肿瘤免受T细胞介导的细胞毒性。为此，此次研究通过探究枸杞多糖对角质细胞自噬的影响，从而探究其抑制角质细胞凋亡的作用机制，研究结果显示：在肿瘤坏死因子α模拟的炎性微环境中，角质细胞内自噬蛋白LC3的蛋白表达显著升高，并伴随凋亡信号Cleaved caspase-8和FADD蛋白表达的升高，表明自噬诱导的细胞凋亡导致了角质细胞损伤；枸杞多糖介入后，细胞自噬和凋亡蛋白同时减弱。为了证实自噬在细胞凋亡中的作用，此次研究使用3-甲基腺嘌呤抑制自噬，流式细胞术检测额结果显示，与正常组相比，3-甲基腺嘌呤可有效抑制肿瘤坏死因子α介导的细胞凋亡。这些结果表明自噬参与了肿瘤坏死因子α诱导的角质细胞凋亡，并且枸杞多糖通过抑制自噬有效减弱角质细胞的凋亡。此外有文献报道，在槟榔碱诱导的口腔黏膜细胞凋亡模型中，自噬能够促进细胞凋亡，与此次研究结果一致[31-32]。
最后，此次研究建立了SD大鼠深Ⅱ度烧伤模型，以确定枸杞多糖促进创面愈合的能力。深Ⅱ度烧伤是指烧伤深度累及皮肤表皮及真皮乳头层以下的损伤，苏木精-伊红染色结果证实此次研究烧伤模型构建成功。此次研究证实，使用枸杞多糖溶液涂抹创面后，创面的愈合速度和效率明显高于对照组，且在28 d时创面完全愈合，此时对照组的创面还未愈合。
虽然，此次研究发现枸杞多糖在炎性环境下具有促进创面愈合的作用，并揭示了肿瘤坏死因子α介导的角质细胞自噬和凋亡过程参与了创面愈合的作用机制，但该研究仍存在一些局限性。大量证据已经证实，自噬并不一定能保护细胞，相反，它可能会产生负面影响并诱导细胞凋亡[33]。此次研究发现，枸杞多糖能够抑制自噬标志物LC3的形成和凋亡受体Casepase-8、TNF R1、FADD的蛋白水平，这提示枸杞多糖可能参与了肿瘤坏死因子α介导的角质细胞自噬与凋亡相互作用。外在途径诱导的细胞凋亡由肿瘤坏死因子受体家族成员跨膜死亡受体触发，肿瘤坏死因子α与TNF R1结合后，FADD将被募集并与配体-受体复合物结合，激活Caspase-8启动细胞凋亡级联反应[34-35]。同时，肿瘤坏死因子α可以通过激活核因子κB-mTOR通路依赖性Beclin 1过表达促进细胞自噬[28，36]。已有文献报道，高级氧化蛋白产物通过 mTOR-Beclin-1 通路诱导细胞自噬介导的人角质形成细胞凋亡[37]。作者猜测枸杞多糖可能通过抑制角质细胞的凋亡和自噬来促进创面愈合。此外，烧伤可引起不同程度的内质网应激，引起活性氧生成，长时间不缓解则会导致细胞凋亡[38]。
FERNANDO等[39]报道，橙皮苷通过抑制氧化应激和自噬保护角质细胞免受颗粒物2.5诱导的细胞凋亡。枸杞多糖通过调节氧化应激保护皮肤细胞免受毒性作用。IRE1-JNK-Hog1和CHOP-钙-钙蛋白酶信号通路是参与细胞凋亡和自噬过程的共同信号通路，在氧化应激下，内质网应激可通过 caspase-2/12和IRE1α-JNK/p38-p53-PUMA 途径导致自噬和细胞凋亡[28，40]。此次研究结果显示，枸杞多糖可能通过调节内质网应激作用调节角质细胞自噬和凋亡、促进创面愈合。接下来的工作将利用代谢组学和蛋白质组学技术，进一步探究枸杞多糖在肿瘤坏死因子α介导的角质细胞凋亡和自噬中的作用机制。
综上所述，枸杞多糖可以抑制肿瘤坏死因子α介导的角质细胞的自噬，并减少角质细胞凋亡，有效保护皮肤表皮组织的完整性。此次研究证实，枸杞多糖能够加快烧伤创面的愈合时间和效率、促进创面愈合，为临床治疗烧伤创面的药物开发提供基础理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

枸杞多糖经自噬抑制烧伤创面角质细胞凋亡的作用机制

Mechanism by which lycium barbarum polysaccharides inhibit keratinocyte apoptosis in burn wounds via autophagy

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