白细胞介素1β调控信号素3A表达诱发椎间盘退变的机制

doi:10.12307/2024.397

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (23): 3680-3685.doi: 10.12307/2024.397

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白细胞介素1β调控信号素3A表达诱发椎间盘退变的机制

黄杰1，2，蒋强2，韩嘉恒1，2，刘江2，张燕2，卢正操2，丁宇1，2

1华南理工大学医学院，广东省广州市 510006；2解放军总医院第六医学中心中医医学部骨伤科，北京市 100048

收稿日期:2023-05-26 接受日期:2023-07-08 出版日期:2024-08-18 发布日期:2023-09-13
通讯作者: 丁宇，教授，主任医师，博士生导师，华南理工大学医学院，广东省广州市 510006；解放军总医院第六医学中心中医医学部骨伤科，北京市 100048
作者简介:黄杰，男，1998年生，汉族，湖南省怀化市人，华南理工大学医学院在读硕士，主要从事脊柱外科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82274637)，项目负责人：丁宇

Mechanism by which interleukin-1beta regulates the expression of Semaphorin 3A to induce intervertebral disc degeneration

Huang Jie1, 2, Jiang Qiang2, Han Jiaheng1, 2, Liu Jiang2, Zhang Yan2, Lu Zhencao2, Ding Yu1, 2

1Department of Orthopedics, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 2Orthopedics of TCM Senior Department, The Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China

Received:2023-05-26 Accepted:2023-07-08 Online:2024-08-18 Published:2023-09-13
Contact: Ding Yu, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Orthopedics of TCM Senior Department, The Sixth Medical Center of PLA General Hospital, Beijing 100048, China
About author:Huang Jie, Master candidate, Department of Orthopedics, School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82274637 (to DY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

信号素3A：属于信号素蛋白家族，是一类分泌蛋白或跨膜蛋白，N端由神经素1和神经丛蛋白A耦合组成复合受体，通过胞内信号传导通路发挥其生物学作用。
盘源性腰痛：指由椎间盘本身的原因引起的腰痛，不伴有椎间盘突出和神经根受压，这种疼痛是由于纤维环破裂、血管肉芽组织长入椎间盘等因素诱发而来。

背景：信号素3A是重要的神经血管生长抑制因子，目前尚不清楚信号素3A是如何参与盘源性腰痛发病的，研究信号素3A在椎间盘退变中的潜在机制可为防治盘源性腰痛提供新的靶点和理论依据。

目的：通过激活核因子κB信号通路影响信号素3A的表达，探讨白细胞介素1β诱导大鼠椎间盘退变的机制。
方法：采用RT-qPCR检测人未退变与退变髓核组织内的信号素3A mRNA表达。分离培养SD大鼠髓核细胞，传代至第3代时分3组培养：空白对照组常规培养48 h，退变组加入10 ng/mL白细胞介素1β干预48 h，退变+抑制剂组加入5 µmol/L核因子κB信号通路特异性抑制剂BAY11-7082干预1 h后加入白细胞介素1β干预48 h。干预结束后，采用CCK-8法检测细胞活力，Annexin V/FITC染色法检测细胞凋亡，RT-qPCR检测细胞基质、血管、神经标志物及信号素3A的mRNA 表达，Western blot检测标志蛋白、核因子κB信号通路蛋白p65及p-p65的蛋白表达。

结果与结论：①RT-qPCR检测显示，人退变髓核组织内的信号素3A mRNA表达低于未退变髓核组织(P < 0.05)；②CCK-8检测与Annexin V/FITC染色显示，与空白对照组比较，退变组髓核细胞活力降低、凋亡率增加(P < 0.05)；与退变组比较，退变+抑制剂组髓核细胞活力升高、凋亡率降低(P < 0.05)；③RT-qPCR检测显示，与空白对照组比较，退变组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A的mRNA表达降低(P < 0.05)，CD31、神经丝蛋白200的mRNA表达升高(P < 0.05)；与退变组比较，退变+抑制剂组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A的mRNA表达升高(P < 0.05)，CD31、神经丝蛋白200的mRNA表达降低(P < 0.05)；④Western blot检测显示，与空白对照组比较，退变组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A的蛋白表达降低(P < 0.05)，CD31、神经丝蛋白200、p65及p-p65的蛋白表达升高(P < 0.05)；与退变组比较，退变+抑制剂组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A的蛋白表达升高(P < 0.05)，CD31、神经丝蛋白200、p65及p-p65的蛋白表达降低(P < 0.05)；⑤结果表明，白细胞介素1β通过激活核因子κB信号通路抑制信号素3A的表达，同时促进细胞外基质的降解和椎间盘内血管神经的长入，可能为椎间盘退变及相关盘源性腰痛的诱发因素之一。

https://orcid.org/0000-0002-2097-9645(黄杰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 白细胞介素1β, 核因子κB信号通路, 信号素3A, 椎间盘退变, 盘源性腰痛

Abstract: BACKGROUND: Semaphone 3A (Sema3A) is an important neurovascular growth inhibitor. It is not clear how Sema3A is involved in the pathogenesis of discogenic low back pain. Exploring the potential mechanism of Sema3A in intervertebral disc degeneration can provide a new target and theoretical basis for the prevention and treatment of discogenic low back pain.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of interleukin-1β inhibiting the expression of Sema3A by activating the nuclear factor-κB signaling pathway to induce intervertebral disc degeneration in rats.
METHODS: RT-qPCR was used to detect the expression of Sema3A mRNA in normal and degenerative human nucleus pulposus tissues. Nucleus pulposus cells of Sprague-Dawley rats were isolated, cultured, and passaged to the 3rd generation. Then, passage 3 cells were divided into three groups: the blank control group was routinely cultured for 48 hours, the degeneration group was intervened with 10 ng/mL interleukin 1β for 48 hours, and the degeneration+inhibitor group was treated by 5 µmol/L nuclear factor-κB signaling pathway-specific inhibitor BAY11-7082 for 1 hour, followed by interleukin-1β for 48 hours. At the end of the intervention, cell viability was detected by cell counting kit-8, cell apoptosis was detected by Annexin V/FITC staining, mRNA expression of cellular matrix, vascular and neural markers and Sema3A was detected by RT-qPCR, and protein expression of marker proteins, p65 and p-p65 was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: RT-qPCR assay showed that the expression of Sema3A mRNA was lower in degenerative human nucleus pulposus tissue than in normal human nucleus pulposus tissue (P < 0.05). Compared with the blank control group, the nucleus pulposus cell viability decreased and the apoptotic rate increased in the degeneration group (P < 0.05); compared with the degeneration group, the nucleus pulposus cell viability increased and the apoptotic rate decreased in the degeneration + inhibitor group (P < 0.05). Compared with the blank control group, mRNA expression of type II collagen, polyproteoglycan, and Sema3A was decreased in the degeneration group (P < 0.05), while mRNA expression of CD31 and neurofilament 200 was increased (P < 0.05). Compared with the degeneration group, mRNA expression of type II collagen, polyproteoglycan, and Sema3A was elevated in the degeneration+inhibitor group (P < 0.05) and mRNA expression of CD31 and neurofilament 200 decreased (P < 0.05). Compared with the blank control group, the protein expression of type II collagen, polyproteoglycan, and Sema3A was decreased in the degeneration group (P < 0.05), and the protein expression of CD31, neurofilament protein 200, p65, and p-p65 was elevated (P < 0.05); compared with the degeneration group, the protein expression of type II collagen, polyproteoglycan, and Sema3A was elevated in the degeneration+inhibitor group (P < 0.05), and protein expression of CD31, neurofilament 200, p65, and p-p65 was decreased (P < 0.05). To conclude, interleukin-1β does inhibit the expression of Sema3A by activating the nuclear factor-κB signaling pathway, which can also increase the degradation of extracellular matrix, promote the innervation and angiogenesis in degenerative intervertebral disc, and may be one of potential factors that contribute to intervertebral disc degeneration and discogenic low back pain.

Key words: interleukin-1β, nuclear factor-κB signaling pathway, Sema3A, intervertebral disc degeneration, discogenic low back pain

中图分类号:

黄杰, 蒋强, 韩嘉恒, 刘江, 张燕, 卢正操, 丁宇. 白细胞介素1β调控信号素3A表达诱发椎间盘退变的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3680-3685.

Huang Jie, Jiang Qiang, Han Jiaheng, Liu Jiang, Zhang Yan, Lu Zhencao, Ding Yu. Mechanism by which interleukin-1beta regulates the expression of Semaphorin 3A to induce intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3680-3685.

图/表（结果） 5

2.1 人退变与未退变髓核组织信号素3A的基因表达差异如图1所示，人退变髓核组织内信号素3A的mRNA表达量低于未退变髓核组织(1.12±0.14，0.57±0.05，P < 0.05)。

2.2 各组髓核细胞活力检测结果如图2所示，空白对照组髓核细胞形态清晰，数量饱满；给予白细胞介素1β后，髓核细胞皱缩，细胞形态不规整，呈凋亡样改变，且细胞数量明显减少；给予BAY11-7082干预后，髓核细胞数量增多，细胞损伤情况较退变组得到改善。与空白对照组相比，白细胞介素1β显著降低了髓核细胞活力，核因子κB信号通路特异性抑制剂BAY11-7082可显著逆转白细胞介素1β诱导髓核细胞的退变作用，增强髓核细胞的活力(P < 0.05)。

2.3 各组髓核细胞凋亡检测结果如图3所示，与空白对照组[(4.94±0.53)%]相比，白细胞介素1β显著诱导髓核细胞凋亡[(25.18±0.45)%]，BAY11-7082可显著逆转白细胞介素1β诱导髓核细胞的退变作用，显著降低髓核细胞的凋亡率[(16.41±0.73)%](P < 0.05)。

2.4 各组髓核细胞内基因表达检测结果 RT-qPCR检测结果见图4所示，与空白对照组相比，退变组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖和信号素3A的mRNA表达降低，CD31、神经丝蛋白200的mRNA表达升高(P < 0.05)；与退变组相比，退变+抑制剂组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖和信号素3A的mRNA表达升高，神经丝蛋白200、CD31的mRNA表达降低(P < 0.05)。

2.5 各组髓核细胞内目标蛋白表达检测结果各组髓核细胞相关蛋白检测结果见图5，6所示，与空白对照组相比，退变组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A的蛋白表达降低(P < 0.05)，CD31、神经丝蛋白200、p65及p-p65的蛋白表达升高(P < 0.05)；与退变组比较，退变+抑制剂组Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A的蛋白表达升高(P < 0.05)，CD31、神经丝蛋白200、p65及p-p65的蛋白表达降低(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对实验数据进行分析。
1.2 时间及地点实验于2022年7-11月在北京百奥思科生物技术有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 临床样本临床样本来源于16例行椎间盘髓核摘除患者的术中摘除髓核，男女各8例，年龄18-65岁。供者对研究知情同意并签署了知情同意书。该研究得到中国人民解放军总医院第六医学中心伦理委员会批准(HZKY-PJ-2023-4)。
1.3.2 实验动物 6只SPF级雄性SD大鼠，6-8周龄，体质量180-220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0008，饲养环境为SPF级环境，温度21.5 ℃，湿度为55%。动物实验已通过康泰医学检验服务河北有限公司实验动物伦理委员会批准，批准号为MDL2022-11-07-01。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下完成实验操作，并最大限度地减少其疼痛和死亡。
1.3.3 实验试剂和仪器 DMEM/F12培养基(Gibco)；白细胞介素1β(PEPRO TECH)；核因子κB信号通路抑制剂BAY11-7082 (美仑)；Ⅱ型胶原蛋白抗体、聚蛋白多糖抗体、信号素3A抗体(Affinity)；CD31抗体、神经丝蛋白200抗体(Proteintech)；p65抗体、p-p65抗体(ZEN BIO)；Goat anti-rabbit IgG(H+L)(ab150078)；CCK-8试剂盒(FIUORESCENCE)；Annexin V/FITC凋亡检测试剂盒(四正柏生物)；胎牛血清(四季清生物)；ECL试剂盒(艾德莱生物)；FC500流式细胞仪、倒置相差显微镜、移液枪、细胞培养箱、酶标仪、化学发光成像系统(Bio-rad)。
1.4 实验方法
1.4.1 人髓核组织收集根据术前影像学Pfirmann分级，6例纳为未退变组(Pfirmann ˂Ⅲ级)，10例纳为退变组(Pfirmann≥Ⅲ级)。严格无菌操作，收集腰椎间盘突出髓核摘除术中摘除的髓核组织，用无菌生理盐水冲洗5遍，置于标本袋中，冰盒保存带回实验室，采用RT-qPCR检测未退变与退变髓核组织的信号素3A的mRNA表达。
1.4.2 原代髓核细胞分离培养取SD大鼠置于无菌操作台上，使用无菌手术器械获取运动节段椎间盘髓核组织，以PBS清洗后转置于离心管中，加入0.25%胰酶及0.2%Ⅱ型胶原酶于 37 ℃环境下消化4 h，以分离出髓核细胞。消化完毕后，弃去胰酶，加入等体积DMEM/F12以终止消化，再经100 μm 细胞滤过膜过滤，取细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃去上清，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液重悬细胞。将髓核细胞接种至25 cm2培养瓶中，置于体积分数为5% CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中培养。定期观察髓核细胞贴壁生长情况，两三天更换培养液确保满意的细胞生长环境。当细胞密度饱和后胰酶消化传代，取P3代细胞进行后续实验。
1.4.3 实验分组及髓核细胞退变模型建立将髓核细胞分3组干预：①空白对照组：仅用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(DMEM/F12∶胎牛血清=9∶1)干预48 h；②退变组：加入含白细胞介素1β(10 ng/mL)、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基干预48 h，诱导髓核细胞发生退变；③退变+抑制剂组：加入含核因子κB信号通路特异性抑制剂BAY11-7082(5.0 µmol/L)、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基干预1 h，然后加入白细胞介素1β(10 ng/mL)干预48 h[11]。
1.4.4 CCK-8法检测髓核细胞活力取P3代髓核细胞重悬，以2×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔100 µL，共设置3个复孔，培养24 h后，按照实验分组换液并添加相应干预因素，每孔培养基体积为10 µL，干预48 h。干预结束后，每孔加入10 µL CCK-8溶液继续培养2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值，吸光度值与细胞增殖能力呈正比。
1.4.5 Annexin V/FITC染色法检测髓核细胞凋亡取P3代髓核细胞，接种于6孔板上，每孔细胞数量为5×105，培养24 h后，按照实验分组换液并添加相应干预因素干预48 h。干预结束后，收集细胞培养液于离心管内备用，胰酶消化。1 200 r/min离心3 min沉淀细胞，弃去上清。加入1 mL 4 ℃预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀细胞，弃去上清。用4 mL 4×结合缓冲液和12 mL去离子水配制稀释结合缓冲液，加入1×结合缓冲液重新悬浮细胞，调节细胞浓度为1×109 L-1。取100 µL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 µL Annexin V/FITC混匀后于室温下避光孵育5 min，加入10 µL 20 µg/mL的碘化丙啶溶液和400 µL PBS，立即进行流式检测。

1.4.6 RT-qPCR检测目的基因表达 ①利用Trizol裂解液提取人髓核组织的总RNA，反转录合成cDNA，通过SYBR Green 实时荧光定量PCR分析mRNA，检测未退变与退变髓核组织中信号素3A的表达差异。②取P3代大鼠髓核细胞，以2×108 L-1的细胞浓度接种于6孔板中，每孔2.5 mL，培养24 h后，按照实验分组换液并添加相应干预因素，干预48 h。干预结束后，利用Trizol裂解液从髓核细胞中提取总RNA，然后进行反转录合成cDNA，通过SYBR Green 实时荧光定量PCR分析mRNA，检测样本中Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A、CD31及神经丝蛋白200的mRNA表达差异。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。相对表达量通过 2-ΔΔCt公式计算。目的基因引物设计见表1。

1.4.7 Western blot检测目标蛋白表达取P3代髓核细胞，以2×108 L-1的细胞浓度将其接种于6孔板中，每孔2.5 mL，培养24 h后，按照实验分组换液并添加相应干预因素，干预48 h。干预结束后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解髓核细胞，制备BCA工作液以测定蛋白浓度。总蛋白于丙烯酰胺凝胶中电泳后，转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温下封闭 2 h，与Ⅱ型胶原蛋白(1∶3 000)、聚蛋白多糖(1∶3 000)、信号素3A(1∶1 000)、CD31(1∶1 000)、神经丝蛋白200(1∶1 000)、p65(1∶1 000)及p-p65(1∶1 000)抗体结合，于4 ℃下反应过夜。经TBST洗膜5次后，与二抗(1∶1 000)室温下孵育1 h。使用ECL试剂盒，化学发光成像系统成像。以β-actin(1∶1 000)作为内参，使用ImageJ软件对条带进行定量分析。
1.5 主要观察指标人未退变与退变髓核组织信号素3A的基因表达差异；各组大鼠髓核细胞的活力、凋亡率以及Ⅱ型胶原蛋白、聚蛋白多糖、信号素3A、CD31、神经丝蛋白200、p65及p-p65的表达。
1.6 统计学分析使用Graphpad Prism 9分析实验数据，绘制图表。计量数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多样本间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05说明差异有显著性意义。文章统计学方法已经中国人民解放军总医院第六医学中心生物统计学专家审核。

讨论

椎间盘退变可引起椎间盘突出、盘源性腰痛、椎管狭窄及椎体不稳等疾病，是引起慢性腰痛最常见的原因之一，但其病理生理机制尚不明确[12-13]。椎间盘退变是多因素共同作用的结果，其病理表现包括髓核细胞凋亡、纤维环破裂、炎性反应、血管神经长入及细胞外基质成分降解等，因此抑制髓核细胞凋亡、促进髓核细胞增殖、抑制椎间盘内炎症反应、促进Ⅱ型胶原蛋白及聚蛋白多糖等细胞外基质成分合成、抑制血管神经向髓核内部生长是延缓椎间盘退变的主要研究方向[14-15]。大量研究证实，血管神经长入退变的椎间盘是引起盘源性腰痛的重要原因，因此寻找抑制退变椎间盘内血管神经生长的靶点对于盘源性腰痛的治疗手段具有重要的探索意义。
正常的椎间盘是乏血管神经组织，因其基质成分中的聚蛋白多糖具有抑制血管生长的作用，仅纤维环的外层及软骨终板有少量血管神经，为椎间盘提供营养和氧气并排泄代谢废物。髓核细胞是椎间盘内最重要的细胞成分，可分泌Ⅱ型胶原蛋白及聚蛋白多糖等细胞外基质成分[16]，Ⅱ型胶原蛋白构成细胞骨架，使髓核细胞及聚蛋白多糖在椎间盘内部维持相对稳定状态；而聚蛋白多糖则具有吸水性，维持髓核含水量。当椎间盘发生退变时，合成代谢与分解代谢之间的动态平衡被打破，细胞外基质成分降解，Ⅱ型胶原蛋白向Ⅰ型胶原蛋白转化，聚蛋白多糖含量下降，髓核含水量下降，新生的毛细血管自纤维环外层向椎间盘内部生长，同时伴随着传导痛觉的神经纤维向退变椎间盘的髓核深处入侵，这是引起慢性腰痛的主要原因[17-18]。慢性腰痛的常见原因有腰椎间盘突出症、腰肌劳损、腰椎压缩性骨折及盘源性腰痛等[19]。盘源性腰痛是源自于椎间盘本身，不伴有椎间盘软性突出压迫硬膜囊及神经根，在影像学上表现为HIZ，其发生机制与纤维环的炎症、纤维环撕裂和血管神经长入密切相关[20]。研究表明，背根神经节的神经纤维伴随着逆行的新生血管长入退变的椎间盘内成为疼痛受体，诱发外周神经产生“痛觉超敏”进而引起盘源性腰痛[17-18，21]。在临床中有不少因腰椎间盘突出症行手术治疗患者在其手术过程中取出的突出椎间盘中带有血管翳，且该类患者腰痛症状大多数比较严重，因其疼痛症状的产生为椎间盘软性突出压迫硬膜囊及神经根引起的根性症状与椎间盘源性疼痛的叠加效应。血管神经向退变椎间盘内长入是引起椎间盘退变及盘源性腰痛的重要机制，与血管内皮生长因子、神经营养因子及信号素3A等调控血管神经生长的细胞因子密切相关。信号素3A属于跨膜蛋白家族，通过与神经素1/神经丛蛋白A受体结合抑制背根神经节神经元轴突生长、拮抗血管内皮生长因子活性、抑制血管神经向纤维环内层和髓核内部生长[6]。研究表明，信号素3A与血管内皮生长因子共享神经素1受体，通过与a1/a2结构域结合参与椎间盘退变病理性神经疼痛的发生机制。信号素3A是重要的轴突生长抑制因子，具有调控神经导向及血管生成的作用，该因子通过影响血管神经在退变椎间盘中的分布，在椎间盘退变过程中发挥重要作用[9，22]。此次研究结果表明，白细胞介素1β可通过活化核因子κB信号通路显著抑制信号素3A的表达，进而促进退变椎间盘内血管神经的生长，从而加剧椎间盘的退变，引起盘源性腰痛。
国外研究报道，信号素3A在正常的椎间盘组织中高表达，但在退变的椎间盘组织中的表达量明显下降[5，23]。信号素3A具有多种不同的生物学功能，尤其在神经发育、血管生成等过程中具有重要的化学趋化和导向作用，但其具体的作用机制尚不明确[23-25]。此次研究根据RT-qPCR实验结果分析发现，人退变髓核组织信号素3A的基因表达显著低于未退变髓核组织，结果与既往研究报道一致。白细胞介素1β、白细胞介素8及肿瘤坏死因子α等众多细胞因子参与椎间盘退变，其中白细胞介素1β是参与椎间盘退变的重要促炎性细胞因子，具有降解细胞外基质、诱发炎症级联反应、促进血管神经增殖等作用。研究表明，白细胞介素1β可以通过调控信号素3A的表达影响退变椎间盘内部血管神经的分布[26-27]。此次研究通过对血管生长标志物CD31及神经生长标志物神经丝蛋白200进行检测，观察白细胞介素1β对血管神经的调控作用，结果显示：利用白细胞介素1β诱导大鼠髓核细胞发生退变，可明显地观察到信号素3A的表达量下降，而血管生成标志CD31及神经生长标志神经丝蛋白200蛋白表达显著增加，说明白细胞介素1β可以通过调控信号素3A的表达量影响退变椎间盘内血管神经的生长。既往的研究报道，促炎性因子能够调控髓核细胞中信号素3A基因表达，与此次研究结果相一致。虽然其调控机制不明，但有研究表明在促炎性因子的作用下，信号素3A在髓核细胞中的表达可能受核因子κB信号通路的调控[26]。
核因子κB是介导炎症反应的重要转录因子，该细胞通路活化后可调节细胞因子刺激退变椎间盘组织血管神经的生成，加剧椎间盘退变[28]。国内外大量研究表明，核因子κB信号通路的活性与椎间盘退变程度呈正相关，即随着椎间盘退变程度的增加该通路的活性也随之升高，细胞外基质成分明显减少、血管生成和神经发育的标志物的表达显著增加，说明促炎性因子白细胞介素1β可能通过调控核因子κB信号通路的活性影响椎间盘内血管神经的生成，进而参与椎间盘退变[29-32]，其具体机制见图7。此次研究结果表明，白细胞介素1β激活核因子κB信号通路后，髓核细胞的细胞外基质降解增加、信号素3A表达量显著下降。为进一步探讨白细胞介素1β调控信号素3A表达的深层机制是否与核因子κB信号通路相关，此次研究在诱导髓核细胞发生退变之前预先添加核因子κB通路的特异性抑制剂BAY11-7082处理大鼠髓核细胞[8]，结果显示在施加通路抑制剂后，白细胞介素1β对核因子κB通路的异常活化以及对信号素3A的调控作用发生显著逆转，导致细胞外基质成分的增加、血管神经标志物水平的下降。上述实验结果初步表明，核因子κB通路在椎间盘退变中发挥重要作用，通过调控核因子κB-p65信号通路可以调节髓核细胞中信号素3A的表达；同时，该通路的激活引起细胞外基质成分的降解及血管神经的生长，在椎间盘退变过程中可能起着关键作用。

综上所述，促炎性因子白细胞介素1β通过诱导核因子κB信号通路的活化抑制信号素3A的表达；信号素3A的表达量下降在细胞外基质降解及诱导血管神经在退变椎间盘的分布过程中发挥关键作用，加剧椎间盘的退变；核因子κB通路抑制剂可以上调信号素3A的表达，进而有效延缓椎间盘退变的进程，为防治盘源性腰痛提供新的靶点和理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

白细胞介素1β调控信号素3A表达诱发椎间盘退变的机制

Mechanism by which interleukin-1beta regulates the expression of Semaphorin 3A to induce intervertebral disc degeneration

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