机械穿刺结合肿瘤坏死因子α及完全弗氏佐剂构建大鼠椎间盘源性腰痛模型

doi:10.12307/2023.992

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (11): 1672-1677.doi: 10.12307/2023.992

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

机械穿刺结合肿瘤坏死因子α及完全弗氏佐剂构建大鼠椎间盘源性腰痛模型

韩忠晓1，欧雅滢1，庄薪晴1，张翔1，李彪平1，蒋智锐1，张靖怡1，杨加顺2，唐玲1，肖炜1，3

1南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515；2南方医科大学第七附属医院，广东省广州市 510630；3广东药科大学糖脂代谢病教育部重点实验室，广东省广州市 510006

收稿日期:2022-12-21 接受日期:2023-02-01 出版日期:2024-04-18 发布日期:2023-07-26
通讯作者: 肖炜，研究员，博士生导师，博士后合作导师，南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515；广东药科大学糖脂代谢病教育部重点实验室，广东省广州市 510006 唐玲，教授，硕士生导师，南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515
作者简介:韩忠晓，男，1995年生，山东省烟台市人，汉族，南方医科大学中医药学院在读硕士，主要从事中医药外用治疗椎间盘退变的实验研究工作。
基金资助:
国家中医药管理局2021年青年岐黄学者支持项目(F121290239)，项目负责人：肖炜；广东省创新团队项目(自然科学)、中西医结合慢性肾病创新团队(2019KCXTD014)，项目负责人：肖炜；2023年广东省中医药局中医药科研项目(20231177)，项目负责人：杨加顺

Mechanical puncture combined with tumor necrosis factor alpha and complete Freund’s adjuvant to construct a rat discogenic low back pain model

Han Zhongxiao1, Ou Yaying1, Zhuang Xinqing1, Zhang Xiang1, Li Biaoping1, Jiang Zhirui1, Zhang Jingyi1, Yang Jiashun2, Tang Ling1, Xiao Wei1, 3

1School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 2The Seventh Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; 3Key Laboratory of Glucose and Lipid Metabolism, Ministry of Education, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2022-12-21 Accepted:2023-02-01 Online:2024-04-18 Published:2023-07-26
Contact: Xiao Wei, Researcher, Doctoral supervisor, Postdoctoral co-supervisor, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Key Laboratory of Glucose and Lipid Metabolism, Ministry of Education, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China Tang Ling, Professor, Master’s supervisor, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Han Zhongxiao, Master candidate, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Supported by:
2021 Young Qihuang Scholars Support Project of the State Administration of Traditional Chinese Medicine, No. F121290239 (to XW); Guangdong Innovation Team Project (Natural Science), Chronic Kidney Disease Innovation Team of Integrative Chinese and Western Medicine, No. 2019KCXTD014 (to XW); 2023 Chinese Medicine Research Project of Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine, No. 20231177 (to YJS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

椎间盘源性腰痛：是指随着年龄的增长，腰椎间盘在自然老化、退化的生理病理过程中表现出椎间隙高度降低、纤维环出现裂隙或断裂、髓核胶原蛋白和水分的丢失、椎体终板的钙化等结构的改变，继而在相应部位出现腰痛的临床表现。
肿瘤坏死因子：也称为恶病质素和TNFSF1A，是一种脂肪因子，参与了全身炎症，同时也是刺激急性期反应的细胞因子之一。
完全弗氏佐剂：是一种油包水的乳浊液，可刺激高且持久的抗体应答，其活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应，被广泛用于制作慢性疼痛模型。

背景：椎间盘退变是导致下腰痛的重要原因。目前国内外对于椎间盘退变的造模方法众多，但缺乏一个针对椎间盘退变引起下腰痛的模型。

目的：对比机械穿刺结合肿瘤坏死因子α+完全弗氏佐剂注射与传统仅机械穿刺下建立的大鼠椎间盘源性腰痛模型的效果。
方法：将18只成年SD雄性大鼠，按照随机数字表法分3组，每组6只，空白组不进行任何操作；对照组大鼠L4-5椎间盘建立传统机械穿刺椎间盘退变模型；实验组在机械穿刺基础上，以微量注射器向L4-5椎间盘内注入肿瘤坏死因子α+完全弗氏佐剂建立机械穿刺结合炎症因子诱导的椎间盘退变模型。术后4周，热板法测大鼠痛阈值用于评估椎间盘退变大鼠对热伤害感受；MRI观察各组大鼠椎间盘退变情况； ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、前列腺素E2水平；苏木精-伊红和番红O固绿染色观察椎间盘形态变化。

结果与结论：①在疼痛上，与对照组相比，实验组大鼠的行为学痛阈值持续降低，血清学各炎症因子指标显著增高；②在形态上，与对照组相比，实验组大鼠的MRI L4-5髓核信号完全消失；组织病理学染色显示：对照组大鼠髓核完整，可见较多脊索细胞，部分纤维环破裂；实验组大鼠的脊索细胞稀少，髓核与纤维环结构紊乱，边界消失；③结论：大鼠椎间盘机械穿刺结合肿瘤坏死因子α+完全弗氏佐剂注射可成功建立椎间盘源性腰痛模型，该操作方法简单、经济，模型退变及腰痛明显，明显缩短椎间盘退变成模周期，可作为研究椎间盘源性腰痛模型的参考。

https://orcid.org/0000-0003-4588-2759(韩忠晓)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘退变, 大鼠, 腰痛, 肿瘤坏死因子α, 完全弗氏佐剂, 动物模型, 穿刺

Abstract: BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration is an important cause of low back pain. At present, there are many modeling methods for disc degeneration in China and abroad, but there is not a model for low back pain due to disc degeneration.
OBJECTIVE: To compare the effect of mechanical puncture combined with tumor necrosis factor α and complete Freund’s adjuvant with a conventional disc mechanical puncture alone.
METHODS: A total of 18 male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups, with 6 animals in each group. No treatment was given in the blank group. Animal models of intervertebral disc degeneration were made in the L4-5 segments of rats in the control using conventional mechanical puncture. In the experimental group, on the basis of mechanical puncture, tumor necrosis factor α+complete Freund’s adjuvant was injected into the L4-5 intervertebral discs using a microinjector to establish a model of disc degeneration induced by mechanical puncture combined with inflammatory factors. Four weeks after surgery, the pain threshold of rats was measured by the hot plate method for assessing the perception of heat injury in rats with intervertebral disc degeneration. MRI examination was performed to observe the disc degeneration in each group. ELISA was used to detect the levels of serum tumor necrosis factor α, interleukin 1β, interleukin 6 and prostaglandin E2. Hematoxylin-eosin and Safranin O-fast green staining were used to observe the morphological changes of the disc.
RESULTS AND CONCLUSION: In terms of pain, the behavioral pain threshold of the experimental group was continuously decreased, and the levels of serum inflammatory factors were significantly higher compared with the control group. In terms of morphology, the MRI results showed that the L4-5 nucleus pulposus signal completely disappeared in the experimental group. Histopathological results showed that in the control group, the nucleus pulposus was intact, more notochord cells were visible, and some fiber rings were ruptured, while in the experimental group, there are fewer notochord cells and the structure of the nucleus pulposus and fibrous ring is disturbed, with the boundary disappearing. To conclude, mechanical puncture combined with tumor necrosis factor alpha and complete Freund’s adjuvant can successfully establish a discogenic low back pain model in rats. This operation is simple and economical to achieve obvious disc degeneration and low back pain, with greatly shortened molding cycle. This model can be used as a reference for studying discogenic low back pain models.

Key words: intervertebral disc degeneration, rat, low back pain, tumor necrosis factor α, complete Freund’s adjuvant, animal model, puncture

中图分类号:

韩忠晓, 欧雅滢, 庄薪晴, 张翔, 李彪平, 蒋智锐, 张靖怡, 杨加顺, 唐玲, 肖炜. 机械穿刺结合肿瘤坏死因子α及完全弗氏佐剂构建大鼠椎间盘源性腰痛模型[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(11): 1672-1677.

Han Zhongxiao, Ou Yaying, Zhuang Xinqing, Zhang Xiang, Li Biaoping, Jiang Zhirui, Zhang Jingyi, Yang Jiashun, Tang Ling, Xiao Wei. Mechanical puncture combined with tumor necrosis factor alpha and complete Freund’s adjuvant to construct a rat discogenic low back pain model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(11): 1672-1677.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析经过椎间盘穿刺结合TNF-α+CFA注射造模的大鼠都能很好地耐受脊柱损伤手术。在术前和术后第1，2，3，4周5个时间点SD大鼠体质量分别为(295±42)，(352±51)，(383±52)，(444±53)，(505±53) g，在各时间点3组间大鼠体质量差异均无显著性意义。对大鼠一般体检未发现术中并发症或明显的压力或不适，用于实验的18只大鼠全部进入结果分析。
2.2 纤维环穿刺结合TNF-α+CFA注射对椎间盘退变大鼠疼痛行为的影响各组大鼠标准化的后爪退缩阈值的持续变化，以及退缩阈值比较记录了纤维环穿刺结合TNF-α+CFA连续造模4周的数据，见图2。将每只动物的拔爪阈值标准化为术前水平。在研究的4周期间，空白组动物的后爪退缩阈值没有显著变化，见图2A。对照组(仅机械穿刺)椎间盘退变大鼠爪收回阈值与空白组相比降低(P < 0.05)。实验组(机械穿刺+TNF-α+CFA)椎间盘退变大鼠爪子收回阈值显著降低，并在整个4周研究期间保持不变，与手术前相比，所有时间点均P < 0.05，见图2A。在3，4周，实验组大鼠爪收回阈值均显著低于空白组和对照组(P < 0.001)，见图2B，C。

2.3 各组大鼠MRI检查结果为了评估各组大鼠的椎间盘退化程度，术后4周，18只大鼠接受了MRI检查，选出具有代表性的MRI图像如图3。术后4周，空白组大鼠L4-5椎间盘髓核呈白色，高信号强度，见图3A；对照组大鼠L4-5椎间盘髓核面积显著降低，MRI信号强度呈现低信号，见图3B；实验组大鼠L4-5椎间盘髓核面积和MRI信号强度完全消失，见图3C；术后4周各组大鼠平均MRI指数见图3D。与空白组相比，MRI计算的对照组椎间盘退变大鼠显示出较高的信号强度(P < 0.01)；实验组椎间盘退变大鼠的信号强度显著降低(P < 0.000 1)。

2.4 各组大鼠血清中炎症因子的水平术后4周，各组椎间盘退变大鼠血清内炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6、TNF-α、前列腺素E2水平，见图4。与空白组相比，实验组椎间盘退变大鼠血清内的炎症因子质量浓度显著增加(P < 0.01)，与对照组相比，实验组椎间盘退变大鼠血清中各炎症因子质量浓度显著增加(P < 0.05)。

2.5 各组大鼠椎间盘病理形态观察结果
2.5.1 苏木精-伊红染色结果 ①空白组大鼠椎间盘结构正常，髓核组织呈完整椭圆形，结构规整，边缘平滑整齐，髓核细胞呈卵圆空泡状，均一弥漫分布，髓核组织面积占据椎间盘总面积的75%左右，椭圆形髓核组织和纤维环的边界清楚；②对照组大鼠髓核组织椭圆形结构消失，正常髓核组织占据椎间盘面积25%左右，边缘相对平滑整齐，分布相对均匀；纤维环排列相对整齐，纤维环和髓核组织边界部分结构清晰；③实验组椎间盘结构呈明显退行性改变，髓核组织椭圆形结构消失，髓核细胞卵圆空泡状减少甚至消失，且分布不均一；纤维环排列紊乱，纤维环和髓核组织边界完全中断，结构不清晰；④椎间盘退变病理组织评分结果显示，模型组病理组织评分明显升高，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.000 1)，见图5。
2.5.2 番红O染色结果空白组髓核结构完整，髓核与纤维环边界清晰，着色深；对照组髓核结构遭到破坏，髓核与纤维环边界模糊，着色变浅；实验组髓核结构被完全破坏，不能区分髓核与纤维环边界，着色浅，见图5。

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引言

下腰痛是指下背、腰骶部及臀部的疼痛，是骨科门诊中最常见的健康问题之一[1]。轻的腰肌劳损、腰部过劳会导致下腰部的疼痛，严重的椎间盘突出、椎管狭窄等也可以引起下腰部疼痛[2]。调查研究发现，下腰部疼痛最多见的是L4-5和L5S1部位腰椎退行性病变引起的疼痛[3]。但不是所有椎间盘退变患者都有下腰痛症状[4]，临床许多有椎间盘变性磁共振成像证据的患者没有报告下腰痛，椎间盘退化严重但无腰痛的比例随着年龄的增长而增加[5-7]。因此建立一种手术操作简单、椎间盘退变明显、疼痛效果稳定的腰源性疼痛的椎间盘退化动物模型，对于研究椎间盘退变引起下腰痛的具体病理机制是必不可少的。
在已报道的诸多椎间盘退变动物模型中，灵长类动物在进化、椎间盘结构以及脊柱生物力学特性上与人类最相近，是研究人类椎间盘退变的产生机制及病理进展的最佳选择，但由于实验动物价格昂贵，饲养环境要求较高以及实验动物伦理等因素未能得到广泛应用[8]。体内啮齿类动物模型以其成本低、来源充足、易于饲养等优点在椎间盘退变的潜在病理生理学方面发挥着越来越重要的作用，且大鼠以其体型大、生命力强、对椎间盘退变手术耐受性好的优点，相较于小鼠更具有优势[9]。
在干预方式方面，经SD大鼠腰椎腹侧入路的机械穿刺法具有操作简单、重复性高的优点，可以模拟疾病自然状态下的缺血和营养供应不足，但却存在无法区分是疼痛性和非疼痛性椎间盘退变的缺点。有报道显示纤维环穿刺结合椎间盘内注射完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)会在椎间盘退变基础上产生疼痛行为[10]，但无法模拟自然环境下，人退变椎间盘内的细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor
necrosis factor，TNF-α)表达增高的重要病理生理学特征[11]。TNF-α在椎间盘变性相关疼痛的发展中起重要作用[12]，而纤维环穿刺结合尾椎间盘内注入TNF-α虽会增加机械穿刺基础上的慢性炎症疼痛行为[13]，但尾椎机械穿刺不足以反映病理状态下，腰源性椎间盘退变引起下腰痛的过程，且整个造模周期过长(6周)[14]。
因此，此次研究拟在传统的机械穿刺基础上，结合外源性TNF-α+CFA椎间盘内注射的方法，构建大鼠L4-5椎间盘退变腰痛模型，并采用行为学、放射学、血清学及组织学等方法评价椎间盘退变情况，以期建立一种稳定、可重复、成模周期短，且与人类椎间盘退变引起下腰痛具有类似表现的动物模型。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2021年12月至2022年1月在南方医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物从南方医科大学动物中心购买18只3月龄、体质量(220±20) g的雄性SD大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证：SYXK[粤]2020-0056。所有大鼠都被饲养在南方医科大学的SPF动物设施里，给予60Co辐射灭菌饲料及纯净水喂养。实验室正常温度在21-24 ℃，稳定在22 ℃，空气相对湿度在40%-70%，稳定在50%，噪声37-45 dB，梯度压差20.0-31.0 Pa，换气次数和空气洁净度均达标，光照以12 h明/12 h暗循环。
该实验方案由南方医科大学动物护理和使用委员会审查和批准，动物伦理审批号：NFYY-2021-1213。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂和仪器戊巴比妥钠(上海国药集团化学试剂有限公司)；TNF-α(国药化学试剂有限公司)；完全弗氏佐剂CFA(上海麦克林试剂有限公司)；前列腺素E2 (货号EK306/3-96，联科生物)；白细胞介素6(货号88-7064-88，赛默飞生物)；TNF-α检测试剂盒(货号EK382/3，联科生物)；白细胞介素1β(编号SEA563Ra，优儿生生物)；ZH-YLS-6B智能热板仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；7.0T安捷伦磁共振扫描仪(安捷伦科技，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组将实验动物标号后，按照随机数字法分为实验组(机械穿刺+TNF-α+CFA)、对照组(机械穿刺)、空白组，每组6只，标准条件下适应性饲养1周。

1.4.2 实验造模及术后处理所有动物术前2 h禁食。各组大鼠测量基础体质量及热敏性疼痛阈值后，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠。麻醉成功后，实验组大鼠仰卧位固定四肢，腹部中线为中心剪毛备皮3 cm×5 cm，清洁手术区域，碘伏消毒铺巾。通过腹部中线切口经前路进入腰椎。通过触诊和放射学确定L4-L5之间椎间盘的具体位置。采用左侧经腹腔脊柱入路暴露L4-5腰椎间盘的左侧腹外侧。注意不要损伤腰椎附近的主要血管。暴露L4-5椎间隙，选用21G穿刺针，由纤维环前外侧方平行软骨终板，与脊柱矢状面呈约45°角方向进针，以自制针头帽为保护装置，控制针刺深度约3 mm(如图1)，进行全层针刺，当穿刺针进至椎间盘中心后，以微量注射器向L4-5椎间盘内注入TNF-α(10 ng/μL)25 μL与CFA 10 μL[10，15]，停留10 min后拔出穿刺针。然后用生理盐水冲洗手术区域，以冲洗椎间盘外部可能残留的TNF-α和CFA。用3-0丝绸缝合线缝合腹膜和腹壁，用4-0尼龙缝合线缝合皮肤，注意逐层缝合。对大鼠进行密切监测，以确保没有术中并发症。对照组大鼠不注射TNF-α+CFA，其余操作皆同实验组。空白组大鼠不做任何处理。造模后大鼠继续在SPF动物房饲养，笼内自由活动，正常饮食；术后连续3 d肌注80万U/(kg·d)青霉素，预防伤口感染；术后每周用热板智能仪进行热敏性疼痛行为学评估。

1.4.3 热敏性(热板)评估椎间盘退变大鼠疼痛相关行为在造模前与造模后每周将大鼠置于恒温热板上，室温20 ℃记录大鼠自足底接触热板至出现斯叫的时间(即痛阈值)。通过每周1次、持续28 d的热板试验评估各组大鼠对热敏性疼痛行为的影响。热板试验过程中热板温度维持在(55.0±0.5) ℃。
实验者一手抓握大鼠颈背部，另一手环绕在大鼠待测后肢，将大鼠后肢放置热板表面(每次放置在热板表面的位置相同)，保证其足底面与热板表面充分接触，从接触时开始计时，当出现后爪从盘子中缩回、退缩、舔或跳跃行为时停止计时，此为其对热伤害性刺激的疼痛阈值。以15 s为测试截止时间，避免大鼠烫伤。测量3次取平均值。正式实验前，大鼠进行3 d适应性训练，使大鼠孰悉测试环境。实验期间，将大鼠放置在(55.0±0.5) ℃恒温的金属表面上。一旦观察到热伤害反应，或如果在55 ℃下未观察到防止组织损伤的反应，则在15 s的切断时间后，将大鼠从热板表面移除。每只动物测试3次，间隔30 min。停止计时的时间越短，代表大鼠对疼痛越敏感，痛阈值越低。
1.4.4 MRI T2图像检测各组大鼠椎间盘退变情况术后4周，用2%的异氟烷与氧气的混合气体麻醉大鼠。使用7.0T安捷伦磁共振扫描仪双调谐体积射频线圈扫描大鼠L4-5区域。使用自旋回波序列获得覆盖整个椎间盘区域的矢状位T2加权图像，参数如下：脂肪饱和度；重复时间/有效回波时间，2 500/27 ms；视野50 mm×50 mm；矩阵320×320；层厚0.5 mm；层间距0 mm；切片数16；总扫描次数1(总扫描时间16.24 min)。
最后使用ParaVision software Bruker Version 6.0软件对前面描述的程序获得的图像切片进行定量分析。从切片图像中分割区域，以生成体积图像，从而计算每个椎间盘体积。将这些值乘以平均信号强度从而确定MRI指数[16]。椎间盘指数越高表示椎间盘退变的严重程度越低。
1.4.5 ELISA法检测各组大鼠血清中炎症因子水平 MRI检查后大鼠腹主动脉取血5 mL，以3 500 r/min离心15 min，吸取上清液分装，-80 ℃保存备用。根据试剂盒说明书所示步骤实施操作，检测炎性细胞因子前列腺素E2、白细胞介素6、TNF-α和白细胞介素1β的水平。
1.4.6 椎间盘组织学分析形态学和半定量变性分级术后4周麻醉后处死各组大鼠，对大鼠L4-5椎间盘进行解剖，在体积分数4%的甲醛缓冲液中固定48 h，并在10%EDTA(pH 7.4)中脱钙4周，将脱钙好的组织包埋在石蜡中，并切成厚度为5 μm的病理切片。用苏木精和伊红以及番红O固绿染色中矢状截面以评估髓核和纤维环的形态学，并使用亮场显微镜进行评估。使用根据MASUDA等[17]和RUTGES等[18]提出的分级量表改编的半定量椎间盘退化分级量表评估每个节段的椎间盘退化程度。综合退化量表由5类组成：①纤维环；②纤维环和髓核之间的边界；③髓核的细胞性；④髓核基质；⑤终板。每个类别的得分为0-2，正常形态得分为0，特征性严重退化得分为2；因此，每个部分的总体退行性评分在0-10之间。所有实验部分由2名对实验组不知情的研究人员进行评估，测量结果取平均值进行统计分析；根据纤维环和髓核区的细胞、形态和结构对组织学评分进行评分。
1.5 主要观察指标 ①热板法测大鼠痛阈值用于评估椎间盘退变大鼠对热伤害感受；②影像学指标用于观察各组大鼠椎间盘退变情况；③血清生化指标用于观察各组大鼠体内TNF-α、白细胞介素1β、白细胞介素6、前列腺素E2水平；④苏木精-伊红和翻红O固绿染色观察椎间盘形态变化。
1.6 统计学分析记录实验数据所用工具为Microsoft Excel，数据表示为x±s；借助软件SPSS 20.0以及Graphpadprism 8.0开展数据分析与数据图像化处理工作；在不同时间点获得的痛觉过敏结果归一化为手术前获得的结果，以最小化动物间变异性。对于各指标组间差异分析借助单因素方差分析(ANOVA)完成；P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义，P < 0.001表示差异有极显著性意义。以上统计学方法已经过南方医科大学卫生统计学专家审核。

讨论

椎间盘退变导致下腰痛是老年人群中常见的现象，其病因复杂[19]。持续性炎症被认为是椎间盘源性腰痛发生的重要因素[20]。此次实验采用SD大鼠腹腔入路前椎间盘穿刺法向大鼠L4-5椎间盘内注射炎症因子破坏椎间盘结构，结合经典的纤维环机械穿刺法构建椎间盘源性腰痛模型，综合行为学、MRI及椎间盘病理染色结果，发现机械穿刺的L4-5椎间盘MRI髓核信号及行为学后爪退缩疼痛阈值均有降低，注射炎症因子的机械穿刺组降低更为明显。此外，炎症因子注射的穿刺组椎间盘病理结构呈明显退行性改变，纤维环排列紊乱，髓核组织椭圆形结构完全消失。上述改变提示，穿刺造模都能引起不同程度的椎间盘退变和疼痛改变，但炎症因子注射的机械穿刺组退变和疼痛更加明显。
虽然腰痛通常与椎间盘退变有关，但由于个体差异，并非所有椎间盘退变患者都存在腰痛症状[21]，除MRI影像学评估椎间盘退变，还应对患者其他症状体征进行评估，而且临床对椎间盘退变治疗以改善症状、提高生活质量为主要目标。因此急需模拟一个与临床椎间盘源性腰痛患者相似的动物模型，以更好地反映人体椎间盘退变的机制。
目前椎间盘退变模型选择多样，诸如机械损伤模型、应力改变模型、敲除特定基因模型、自发性椎间盘退变模型等[22-23]。机械穿刺模型是通过椎间盘的后部或前部损伤建立的，其操作难度不高，结构单一且术中创伤性小，实验动物存活率高。相比于前椎间盘穿刺，后椎间盘穿刺将不可避免地损伤后脊柱结构，导致动物脊柱后凸，并不可避免刺激临近神经根[24]。因此前椎间盘穿刺在文献报道中广泛使用[25]。
通过KIM等[26]通过SD大鼠前椎间盘穿刺手术，在手术后9周，椎间盘退变大鼠下背部出现了以压力痛觉过敏为代表的疼痛行为。LEE等[10]通过SD大鼠前椎间盘穿刺手术并向成年大鼠腰椎间盘注射10 μL CFA后，在术后7周，椎间盘退行性变化和痛觉过敏行为明显增加。后来LAI等[15]和EVASHWICK‐ROGLER等[27]通过SD大鼠前椎间盘穿刺手术并向成年大鼠腰椎间盘注射TNF-α，发现在术后6周，椎间盘退行性变化和痛觉过敏行就明显增加。因此TNF-α和CFA可以被用来诱导炎性疼痛。研究表明，炎性微环境可以通过改变疼痛相关离子通道、痛觉突触传递效能等导致疼痛传递通路结构发生变化，进而降低放电阈值使感觉神经元敏感，诱发慢性疼痛[28-29]。
因此此次研究基于纤维环穿刺基础上，通过向椎间盘内联合注射TNF-α+CFA，增强椎间盘内炎症破环，诱导疼痛性椎间盘退变，有效弥补了机械穿刺下椎间盘退变周期长且疼痛不明显的缺点。先前的研究表明，椎间盘退变的病理机制是一个多因素相互作用的复杂过程，其中多种细胞因子参与椎间盘退变的病理进展。例如白细胞介素1β、TNF-α、白细胞介素6[30]。近年来，人们发现在神经根周围发生的炎症反应可能是产生腰痛的重要原因，其中TNF-α是细胞因子网络中的重要因子，在椎间盘退变导致下腰痛的发病中起重要作用且能刺激增加疼痛介质前列腺素E2的合成[31]，导致局部疼痛的敏感度增加，从而进一步加重腰部疼痛[32]。
在此次研究中，向大鼠L4-5椎间盘联合注射TNF-α+CFA可以通过增加椎间盘退变大鼠血清中炎性细胞因子(白细胞介素1β、TNF-α和白细胞介素6)的释放来增强炎性反应，提高疼痛介质前列腺素E2的合成，其为敏化感觉神经元以维持痛觉过敏的介质。而行为学热板实验结果也表明，经联合注射TNF-α+CFA的实验组椎间盘退变大鼠，明显降低了爪收回阈值，且保持急性和长期持续的疼痛行为发展。在动物实验中，椎间盘退变程度的客观评价指标主要包括影像学评价和组织病理学评价。通过MRI定性评估方法可见椎间隙高度丢失、椎间盘信号的减低、Schmorl结节形成、终板异常等。椎间隙高度丢失是临床上最常用的诊断椎间盘退变的影像学特征。组织病理学评价结果中，最经典的苏木精-伊红染色和番红O固绿染色为MRI检查结果提供进一步依据。此次研究从切片图像中分割区域，生成体积图像，从而计算每个椎间盘体积。将这些值乘以平均信号强度从而确定MRI指数可以更加公正客观地评价椎间盘退变程度。病理染色结果显示，前穿刺结合TNF-α+CFA组大鼠椎间盘结构呈明显退行性改变，髓核组织椭圆形结构消失，髓核细胞卵圆空泡状减少甚至消失，且分布不均一。纤维环排列紊乱，纤维环和髓核组织边界完全中断，结构不清晰。
综上所述，前椎间盘穿刺联合TNF-α+CFA注射可建立稳定的、具有疼痛症状的体内椎间盘退变导致下腰痛模型，模拟临床患者椎间盘退变的病理生理进程。术后4周影像学MRI和组织病理学染色结果均证实椎间盘明显退变，包括椎间隙狭窄甚至消失以及组织病理结构紊乱，使用行为学表征了椎间盘源性腰痛表型，作为评估椎间盘疼痛程度和进展的间接证据。这种模型构建方式复制了人类椎间盘源性腰痛临床表现的关键特征，为后续椎间盘源性腰痛病理机制研究奠定了基础。
然而这项研究有一些局限性。首先，研究未具体阐明炎症和椎间盘源性腰痛之间具体分子机制；其次，椎间盘是一个完整的组织，由3个部分紧密相互作用，研究仅集中于髓核和纤维环，而较少关注透明软骨板和软骨下骨；最后，由于四足动物与两足动物的脊柱生物力学不同，大鼠椎间盘受负重影响较小，且椎间盘退变模型仅在L4-5腰部椎间盘中建立，应评估不同椎间盘源性腰痛之间的比较。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

机械穿刺结合肿瘤坏死因子α及完全弗氏佐剂构建大鼠椎间盘源性腰痛模型

Mechanical puncture combined with tumor necrosis factor alpha and complete Freund’s adjuvant to construct a rat discogenic low back pain model

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