1.1 设计 体外细胞实验,实验数据采用方差分析与t检验。
1.2 时间及地点 实验于2021年1月至2022年9月在协和华东干细胞基因工程有限公司实验室完成。
1.3 材料 DMEM/F-12培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(新西兰ExCell Bio公司);MSCgoTM chondrogenic成软骨诱导分化培养基、MSCgoTM Adipogenic成脂诱导分化培养基、MSCgoTM Osteogenic成骨诱导分化培养基(以色列Biological Industries公司);CCK-8试剂盒(美国Biomedical Technology公司);TRIzol(美国Introvigen公司);Prime-ScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒(日本Takara公司);实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(美国BIO-RAD公司);超净台(BCM-1300A,苏净安泰);三气细胞培养箱(Forma4131,美国Thermo公司);酶标仪(FREEDOM EVOLYZER-2,瑞士TECAN公司);全自动血液分析仪(XP-100,日本SYSMEX公司);倒置显微镜(CKX41SF,日本OLYMPUS公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 人血小板裂解液的制备与乳牙、恒牙样本的收集 采集10份年龄在22-32周岁、身体健康无病史产妇捐献的公共脐血。产妇血型相同,均为A型、RH阳性血,采集前均进行免疫4项(HBV、HCV、HIV、梅毒标志物)检测且结果为阴性,血常规检测血小板含量正常[(100-300)×109 L-1],所有捐献者均签署知情同意书。每份脐血20 mL,平均放入4个5 mL无抗凝剂玻璃管中,立即在离心机中2 700 r/min离心12 min,血样分成3层,上层为血浆层,中间层为富血小板纤维蛋白,下层为红细胞层。无菌条件下弃去下层红细胞,保留上层和中间层,经3 000 r/min离心10 min将血小板与胶原蛋白网分离,上清液在-80 ℃与37 ℃下反复冻融3次(冻24 h/次)后过0.22 μm滤器过滤除菌,去除细胞碎片,得到人血小板裂解液。将多人份的人血小板裂解液混合后使用,避免个体间差异对实验结果造成影响。
收集浙江省湖州市第一人民医院口腔颌面外科2019年1月至2020年4月因正常脱落、正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的儿童乳牙共20颗、少年(< 18周岁)恒牙10颗以及成年(≥18周岁)恒牙10颗,所有供者健康、无系统性疾病和病史,均进行免疫4项(HBV、HCV、HIV、梅毒标志物)检测且结果为阴性,且供者及其监护人均签署知情同意书。
该研究的实施符合湖州市第一人民医院的相关伦理要求。
1.4.2 牙髓干细胞分离、培养及传代 牙齿样本收集后于6 h内送往实验室,在超净台无菌条件下对牙齿表面进行清洁消毒,用医用骨科钳将牙冠与牙根分开,取出牙髓腔内的牙髓,用手术剪将牙髓组织剪碎,采用植块法移入Corning T25细胞培养瓶中,置于37.5 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中5-10 min,待组织块贴壁后,分别加入含5%,10%,15%人血小板裂解液或体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基进行原代细胞培养,待细胞增殖到铺满培养瓶底部面积75%-85%进行传代,继续培养。
1.4.3 显微镜下观察细胞形态 倒置显微镜下观察乳牙、少年恒牙及成年恒牙来源原代、第3代及第7代牙髓干细胞生长状况。
1.4.4 流式细胞术检测细胞表面抗原表达 选取第3代处于对数生长期的细胞,制备细胞悬液,细胞浓度约为1×109 L-1,装入EP管中,分别加入0.2 mg/mL的CD13、CD19、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR对应的同型抗体,4 ℃避光孵育30 min,1 350 r/min离心5 min,去上清液,PBS重悬,过滤,上流式细胞仪测定分析。
1.4.5 确定最佳培养条件 第3代乳牙、少年恒牙及成年恒牙牙髓干细胞分别在含5%,10%,15%人血小板裂解液或体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中培养3 d,采用细胞计数法检测4组细胞增殖情况,绘制生长曲线,选取最佳人血小板裂解液浓度进行后续实验。
1.4.6 细胞增殖检测
(1)细胞计数法:取对数生长期的第3代乳牙、少年恒牙及成年恒牙牙髓干细胞,以1×107 L-1细胞浓度接种于T25培养瓶(21瓶),每瓶5 mL,置于体积分数5%CO2、37 ℃细胞培养箱培养,每隔24 h取3瓶细胞,胰酶消化计数细胞,计算均值,连续计数7 d。
(2)CCK-8法:取对数生长期的第3代乳牙、少年恒牙及成年恒牙牙髓干细胞,以1×107 L-1细胞浓度接种于96孔板(100 μL/孔),置于体积分数5%CO2、37 ℃细胞培养箱培养,每隔24 h取3孔细胞,加入CCK-8溶液(10 μL/孔),在培养箱内孵育2 h后,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值,计算均值,连续测定7 d。
1.4.7 细胞体外成骨、成脂、成软骨诱导分化能力检测 选取生长良好的第3代乳牙、少年恒牙与成年恒牙牙髓干细胞,制备成浓度为5×107 L-1细胞悬液,接种于24孔板中,每孔1 mL,待细胞贴壁后进行成骨、成脂诱导分化;对照组使用含10%人血小板裂解液的DMEM/F-12培养基培养。诱导第14天进行油红O染色(成脂分化),第21天进行茜素红染色(成骨分化)。
将10%壳聚糖醋酸溶液(壳聚糖和乙酸为美国Sigma公司产品)加入到pH值为7.7且含有7% poloxamer188(美国Sigma公司)的黄原胶(美国Sigma公司)水溶液中,机械搅拌、烘干消毒后制成支架。将无菌支架放置于24孔板中,加入成软骨培养液使之充满支架内部空隙;使用注射器将制备好的第3代乳牙、少年恒牙与成年恒牙牙髓干细胞悬液分别注入不同孔的支架内部,确保细胞充满整个支架内部孔隙;放入孵箱内孵育2 h后将2 mL成软骨培养液加入24孔板内防止细胞分离;对照组使用含10%人血小板裂解液的DMEM/F-12培养基培养。诱导培养第21天进行阿尔新蓝(Alcian blue)染色。
1.4.8 RT-PCR检测EP300和成骨、成脂、成软骨相关基因的表达 第3代各组牙髓干细胞成骨诱导21 d/成脂诱导17 d后,弃去诱导液,PBS冲洗孔板,每孔中加入1 mL Trizol,反复用移液枪吹打以裂解细胞;第3代各组牙髓干细胞成软骨诱导21 d后,取出干细胞微球用PBS冲洗后放入含有液氮的无菌研钵内,充分研磨至微球碾碎成粉末,收集微球粉末,转移入1.5 mL无酶EP管内,加入1 mL Trizol试剂,吹打混匀。
将上述裂解液分别加入0.2 mL氯仿,振荡15 s,12 000×g离心后收取上清液,加入0.5 mL异丙醇混匀,静置10 min后12 000×g离心,弃上清,加入体积分数75%乙醇洗涤,7 500×g离心弃上清,自然干燥,用50 μL Rnase-free水收集RNA。提取各组细胞总RNA,所得的RNA样本经分光光度计检测,A260/A280比值在1.9-2.0之间。cDNA合成按反转录试剂盒操作说明,反应体系为20 μL,取1 μL的RNA于42 ℃ 50 min,85 ℃ 5 min PCR仪中反应。短暂离心,置于冰上冷却。
以β-actin为内参,根据PCR检测试剂盒配制反应液,总体积为20 μL,选用三步法PCR扩增程序:预变性95 ℃ 1 min,变性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 45 s,40个循环。每个标本重复3次,所得Ct值代入公式2-ΔΔCt计算各组EP300、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白2(bonemorphogenetic protein-2,BMP-2)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(peroxisome proliferator activated receptor γ2,PPAR-γ2)、Ⅱ型胶原α1(collagen type II alpha 1,COL2A1)及软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP) mRNA表达水平。各引物序列见表1。
1.5 主要观察指标 ①不同浓度血小板裂解液对牙髓干细胞增殖水平的影响;②各组牙髓干细胞形态;③各组牙髓干细胞表型与增殖能力;④各组牙髓干细胞三系分化能力及分化相关基因的表达。
1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 5软件进行数据分析,实验数据均以x±s表示,多组间比较采用方差分析(ANOVA),两组之间比较采用t检验,P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法经过湖州学院生物统计学专家审核。