纳米二氧化锆对鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨分化的影响

doi:10.12307/2024.409

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (15): 2346-2350.doi: 10.12307/2024.409

• 纳米生物材料 nanobiomaterials • 上一篇下一篇

纳米二氧化锆对鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨分化的影响

卞璐1，夏丹丹2，钱源2，史雯1，阙云端1，吕龙1，徐爱花1，史文涛1

1江苏大学附属高淳医院中心实验室，江苏省南京市 211300；2江南大学附属医院骨科，江苏省南京市 211300

收稿日期:2023-06-06 接受日期:2023-08-04 出版日期:2024-05-28 发布日期:2023-09-19
通讯作者: 史文涛，主治医师，江苏大学附属高淳医院中心实验室，江苏省南京市 211300
作者简介:卞璐，女，1993年生，江苏省南京市人，汉族，江南大学无锡医学院在读硕士，主要从事骨外科研究。
基金资助:
南京市卫生科技发展专项资金项目(重点项目：ZKX21063)，项目负责人：阙云端，史文涛；南京市卫生科技发展专项资金项目(YKK19129)，项目负责人：史文涛

Effects of nano-zirconium dioxide on osteogenic differentiation of ectomesenchymal stem cells in nasal mucosa

Bian Lu1, Xia Dandan2, Qian Yuan2, Shi Wen1, Que Yunduan1, Lyu Long1, Xu Aihua1, Shi Wentao1

1Central Laboratory of Gaochun Hospital Affiliated to Jiangsu University, Nanjing 211300, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Jiangnan University, Nanjing 211300, Jiangsu Province, China

Received:2023-06-06 Accepted:2023-08-04 Online:2024-05-28 Published:2023-09-19
Contact: Shi Wentao, Attending physician, Central Laboratory of Gaochun Hospital Affiliated to Jiangsu University, Nanjing 211300, Jiangsu Province, China
About author:Bian Lu, Master candidate, Central Laboratory of Gaochun Hospital Affiliated to Jiangsu University, Nanjing 211300, Jiangsu Province, China
Supported by:
Special Fund Project of Nanjing Health Science and Technology Development, No. ZKX21063 (to QYD, SWT); Special Fund Project of Nanjing Health Science and Technology Development, No. YKK19129 (to SWT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

外胚间充质干细胞：是分布于头面部黏膜内的特殊类型的干细胞，在胚胎发育过程中由神经嵴细胞迁移增殖分化而来，该细胞仍保留向神经细胞分化的潜能。
二氧化锆：生物医学级二氧化锆被认为是继钛之后最常用的材料之一，尤其在骨科和牙科。由于其良好的机械强度和生物相容性，锆被广泛用于制造假肢装置，研究还发现二氧化锆与钛具有同样的生物相容性。

背景：纳米二氧化锆在骨组织修复领域表现出良好的应用潜力，研究纳米二氧化锆对成骨分化的影响将有助于推广纳米二氧化锆治疗骨缺损的临床应用。

目的：探究纳米二氧化锆对鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：分离培养大鼠鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞，使用CCK-8法检测纳米二氧化锆的细胞毒性，根据细胞毒性选择生物安全浓度，然后将细胞随机分为对照组、纳米二氧化锆组和纳米羟基磷灰石组，定向诱导各组细胞成骨分化。在诱导分化第7天进行碱性磷酸酶染色，采用qRT-PCR和Western blot检测早期成骨标志物(Runx2和Osx)的表达水平，在诱导分化第21天进行茜素红染色，采用qRT-PCR和Western blot检测中晚期成骨标志物(OPN和OCN)的表达水平。

结果与结论：①纳米二氧化锆对鼻黏膜外胚层间充质干细胞的半数致死质量浓度为0.6 mg/mL，该实验选择质量浓度为200 μg/mL进行干预，二氧化锆对细胞增殖无明显影响；②与对照组相比，纳米二氧化锆组细胞碱性磷酸酶染色更明显且细胞矿化水平更高，但与纳米羟基磷灰石组对比无明显差异；③与对照组相比，纳米二氧化锆组成骨相关基因和蛋白的表达均明显增多，但与纳米羟基磷灰石组对比无明显差异；④结果表明：纳米二氧化锆具有良好的生物安全性，且能对鼻黏膜外胚层间充质干细胞的成骨分化产生促进作用，这种促进效果与纳米羟基磷灰石相当。

https://orcid.org/0000-0001-8451-5850(史文涛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 鼻黏膜, 外胚层间充质干细胞, 二氧化锆, 羟基磷灰石, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Nano-zirconium dioxide has good application potential in the field of bone tissue repair. Studying the effect of nano-zirconium dioxide on osteogenic differentiation will help to promote the clinical application of nano-zirconium dioxide in the treatment of bone defects.
OBJECTIVE: To explore the effect of nano-zirconium dioxide on the osteogenic differentiation of ectomesenchymal stem cells in the nasal mucosa.
METHODS: Ectomesenchymal stem cells derived from rat nasal mucosa were isolated and cultured, and the biotoxicity of nano-zirconium dioxide to the cells was detected by CCK-8 assay. The biosafety concentration was selected according to the cytotoxicity, and the cells were randomly divided into a control group, a nano-zirconium dioxide group, and a nano-hydroxyapatite group. Osteogenic differentiation of cells was directionally induced in each group. On day 7 of induced differentiation, alkaline phosphatase staining was performed. qRT-PCR and western blot assay were used to detect the expression of early osteogenic markers (Runx2 and Osx). On day 21 of induced differentiation, alizarin red staining was conducted. qRT-PCR and western blot assay were utilized to determine the expression levels of late osteogenic markers (OPN and OCN).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The median lethal concentration of nano-zirconium dioxide on ectomesenchymal stem cells in nasal mucosa was 0.6 mg/mL. In the experiment, the mass concentration of 200 μg/mL was selected for intervention. Zirconium dioxide had no significant effect on the proliferation of the cells. (2) Compared with the control group, the alkaline phosphatase staining of the cells in the nano-zirconium dioxide group was more obvious and the level of cell mineralization was higher, but there was no significant difference compared with the nano-hydroxyapatite. (3) Compared with the control group, the expression of bone-related genes and proteins increased significantly, but there was no significant difference compared with nano-hydroxyapatite. (4) The results show that nano-zirconium dioxide has good biological safety and can promote the osteogenic differentiation of ectomesenchymal stem cells in the nasal mucosa. This promoting effect is equivalent to that of nano-hydroxyapatite.

Key words: nasal mucosa, ectomesenchymal stem cell, zirconium dioxide, hydroxyapatite, osteogenic differentiation

中图分类号:

卞璐, 夏丹丹, 钱源, 史雯, 阙云端, 吕龙, 徐爱花, 史文涛. 纳米二氧化锆对鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2346-2350.

Bian Lu, Xia Dandan, Qian Yuan, Shi Wen, Que Yunduan, Lyu Long, Xu Aihua, Shi Wentao. Effects of nano-zirconium dioxide on osteogenic differentiation of ectomesenchymal stem cells in nasal mucosa[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(15): 2346-2350.

图/表（结果） 6

2.1 EMSCs鉴定结果光学显微镜下观察贴壁的EMSCs为长梭形成纤维样细胞，细胞呈鱼群样。免疫荧光染色观察EMSCs表面标志物，图1观察到EMSCs表面标志物CD133主要表达在细胞膜，呈颗粒状分布；而Nestin主要表达在细胞质内，呈明显绿色荧光。

2.2 HAP和ZrO2的表征透射电镜观察到HAP和ZrO2的表面粗糙，粒径分别为(23.5±2.6) nm，(25.2±3.4) nm，两者粒径大小无明显统计学意义，见图2。

2.3 HAP和ZrO2对EMSCs增殖的影响 CCK-8检测2种纳米颗粒对EMSCs增殖和细胞毒性的影响，HAP和ZrO2对EMSCs的半数致死质量浓度分别为1 mg/mL和0.6 mg/mL，见图3A。据此，选择2种纳米颗粒质量浓度为200 μg/mL，在该质量浓度下，观察到2种纳米颗粒对EMSCs增殖没有明显差异，均在第3天细胞增殖达到增殖平台期，与对照组比较差异也无显著性意义，见图3B；同时，对2种纳米颗粒刺激后的EMSCs行Ki-67染色，结果显示Ki-67阳性率在各实验组之间无差异，这些数据表明2种纳米颗粒在生理安全浓度下对EMSCs的增殖无明显影响。

2.4 HAP和ZrO2对EMSCs成骨分化的影响将200 μg/mL HAP和200 μg/mL ZrO2添加在成骨诱导培养基中作用于EMSCs，第7天时提取mRNA和蛋白，检测早期成骨标志物Osx和Runx2的表达，结果显示HAP和ZrO2均可以提高Osx和Runx2的表达量，与对照组比较差异有显著性意义；早期成骨标志物碱性磷酸酶染色也提示HAP和ZrO2染色程度均优于对照组，碱性磷酸酶、Osx和Runx2在HAP组和ZrO2组之间未观察到明显的差异表达，见图4。

诱导分化第21天，用茜素红S染色观察形成的钙结节大小，发现HAP组和ZrO2组钙结节阳性面积均大于对照组。同时，成骨分化晚期指标OPN和OCN的表达量均高于对照组。HAP组和ZrO2组茜素红染色和成骨晚期指标无统计学意义，见图5。

诱导分化第21天，用油红O染色观察在成骨分化过程中EMSCs自发向成脂分化的水平。HAP组和ZrO2组EMSCs自发向成脂分化水平低于对照组，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，多个样本均值间比较采用ANOVA 单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于 2022年2月至2023年2月在江苏大学附属高淳医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 10只Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量100 g，雌雄不限，购自苏州昭衍新药研究中心有限公司，动物合格证号：NO. 202209597；机构许可证号：SCXK(苏)2023-0004。
实验方案经江苏大学附属高淳医院动物实验伦理委员会批准，审批号为GCHP.2022082401。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 试剂与耗材 HAP和ZrO2(Sigma，美国)；DMEM/F12培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Hyclone，美国)；间充质干细胞成骨诱导分化培养基(普诺赛，上海)；CCK-8试剂盒(碧云天，上海)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天，上海)；BCA蛋白质定量试剂盒(索来宝，背景)；茜素红染液(碧云天，上海)；RNA sample Total RNA kit(DP430，北京TIANGEN公司)；Prime ScriptTM RT Master Mix(RR036A)、TB GreenTM premix EX TaqTMⅡ(Takara公司，日本)。一抗包括Osx、Runx2、OPN、OCN，均购自武汉三鹰生物科技公司；荧光二抗和免疫印迹二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；荧光定量PCR仪(Quant studio 7，ABI公司，美国)。
1.4 实验方法

1.4.1 分离培养EMSCs 根据以往的报道，采用贴壁法分离培养大鼠鼻黏膜来源EMSCs[14]。具体方法如下：在无菌操作台内将大鼠鼻中隔取出，漂洗，去除红细胞，充分剪碎鼻黏膜组织，然后使用胰酶消化10 min，终止消化后离心，将鼻黏膜组织置于培养瓶中培养，每隔3 d半量换液1次。待细胞从组织中爬出，并长满瓶底面积的80%时，开始消化，并进行传代培养。取第3代EMSCs进行免疫荧光染色鉴定并用于后续实验。

1.4.2 细胞毒性检测第3代EMSCs以5×104密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，8 h后换成含不同质量浓度(100，200，400，800，1 000 μg/mL)HAP或ZrO2纳米颗粒的培养基，以不含纳米颗粒的培养基为对照组，24 h后吸弃孔内培养基，加入CCK-8工作液，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育2 h后，采用微孔板分光光度计在450 nm处读取吸光度值。
1.4.3 细胞增殖检测第3代EMSCs以2 500个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，8 h后换成含质量浓度为200 μg/mL HAP或ZrO2纳米颗粒的培养基，在培养8，16 h及1，2，3，4 d时吸弃孔内培养基，加入CCK-8工作液，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育2 h后，采用微孔板分光光度计在450 nm处读取吸光度值。
1.4.4 免疫荧光检测将第3代EMSCs按5 000个/孔密度接种于48孔板，待细胞铺满板底后，PBS清洗3次，用40 g/L多聚甲醛溶液4 ℃固定过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，用0.1% Triton X-100溶液室温下渗透15 min，PBS洗涤3次，每次5 min，室温下用3% BSA封闭1 h，加入对应一抗(CD133，Nestin，Ki-67，稀释比例为1∶200)，4 ℃孵育8 h，PBS洗涤3次，每次5 min，加入488荧光标记的二抗，室温下孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，加入DAPI核染色后封固，在荧光显微镜下观察并拍摄图片。
1.4.5 成骨诱导将第3代EMSCs以 2.5×105/孔接种于6孔板(用于提取细胞mRNA和蛋白)，以5×105/孔接种在24孔板(用于免疫荧光、茜素红S、油红O和碱性磷酸酶染色)，置于CO2 孵箱中培养24 h待细胞贴壁后，分为对照组、HAP处理组和ZrO2处理组，每组6个复孔，加入含质量浓度为200 μg/mL HAP或ZrO2纳米颗粒的成骨诱导培养基。成骨诱导培养基成分为：体积分数10%胎牛血清，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L抗坏血酸溶于α-MEM培养基。每3 d半量换液，根据实验需要分别在成骨诱导第7天和第21天时，收集各组细胞mRNA和细胞蛋白。
1.4.6 Western blot检测成骨相关蛋白的表达将待测蛋白质经过电泳分离后转移到PVDF膜上，将膜放入1%的脱脂奶粉溶液中室温下封闭1 h，将特定的一抗(Runx2，Osx，OCN和OPN，稀释比例为1∶500)加到膜上，4 ℃孵育8 h，用TBST漂洗去除非特异性结合的抗体，将特异性的二抗[HRP goat anti-mouse IgG (1∶5 000)和HRP goat anti-rabbit IgG(1∶5 000)]加到膜上，室温孵育30 min，漂洗PVDF膜，去除非特异性结合的二抗，使用化学发光法检测二抗结合的信号。以β-actin为内参，结果用目的蛋白的吸光度与相应的内参β-actin吸光度比值作为蛋白表达的相对量。

1.4.7 qRT-PCR检测成骨相关基因的表达依据细胞总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，使用PCR扩增仪，以反转录反应液进行反转录反应，检测早期成骨标志物Osx和Runx2，以及中晚期成骨标志物OPN和OCN 的转录水平。引物序列见表1。

1.4.8 矿化检测成骨诱导培养7 d后，弃去诱导培养基，PBS冲洗3次，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，按BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒说明书所示方法配置染色液，每孔加入500 μL，室温下避光染色30 min，最后用双蒸水漂洗细胞3次，于显微镜下观察并拍摄图片。成骨诱导培养21 d后，吸弃诱导培养基，双蒸水清洗细胞3遍，体积分数80%乙醇固定30 min后行茜素红S染色。
1.4.9 自发成脂分化水平成骨诱导培养21 d后，吸弃诱导培养基，双蒸水清洗细胞3遍，体积分数80%乙醇固定30 min后行0.5%油红O染色，观察成骨分化过程中EMSCs自发成脂分化水平。
1.5 主要观察指标 ①纳米HAP和ZrO2的EMSCs毒性作用；②纳米HAP和ZrO2对EMSCs分化的影响。
1.6 统计学分析所有实验至少进行3次重复，实验数据用x±s表示，使用GraphPad 7.0进行统计，多组间比较采用ANOVA，两组之间比较采用成组配对t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经由江苏大学和江南大学专家审核。

讨论

ZrO2是一种耐火耐高温陶瓷，目前已在生物医疗器械(包括植入物、关节内假体和牙科材料)中广泛应用[15]。以往的研究内容主要集中在将ZrO2作为多孔支架材料应用于药物输送，以及将ZrO2作为涂层材料以增强内植物的骨整合能力。HAP作为无机骨的主要成分之一，已被应用于各类生物骨材料替代品的开发研究[16-17]。体外实验中，研究人员发现HAP具有较强的促进成骨分化功能，因此，该研究将HAP作为阳性对照，用于观察ZrO2对EMSCs增殖、生物毒性和成骨分化的影响。
鼻黏膜来源EMSCs与其他干细胞相比，有着取材方便且没有伦理问题的优点，体外分离培养的EMSCs纯度较高且保持较好的增殖能力，被视为理想的种子细胞[18]。该研究首先研究了不同质量浓度的2种纳米颗粒对EMSCs生物学毒性的影响，结果发现即使使用较高浓度的2种纳米颗粒刺激EMSCs，细胞毒性仍在安全范围内，这说明2种纳米颗粒具有较好的生物安全性。但是，相比较HAP，ZrO2仍然具有一定的毒性，因此在使用ZrO2作为生物材料填充剂搭载EMSCs移植治疗骨缺损时，应该注意其安全性。
根据细胞毒性，选定了200 μg/mL 2种纳米颗粒干预EMSCs，观察2种纳米颗粒对EMSCs增殖的影响。CCK-8以及Ki-67染色结果均显示2种纳米颗粒对EMSCs增殖无明显差异，这可能由于EMSCs本身增殖较快的因素导致，2种纳米颗粒对EMSCs增殖的影响不足以体现。碱性磷酸酶是成骨分化过程中增强钙结节形成的酶，其表达于大部分矿化组织中，在成骨分化早期表达于细胞内[19]。碱性磷酸酶不仅可以增强无机磷酸盐在细胞外基质的局部沉积，同时还可以减少焦磷酸盐的矿化抑制作用[20-21]。2种纳米颗粒均可以促进EMSCs表达碱性磷酸酶，这表明2种纳米颗粒均可在早期促进EMSCs成骨分化，同时发现早期成骨分化标志物Osx和Runx2表达也增高，Runx2和Osx是成骨核转录因子，参与和调控成骨分化过程，在成骨细胞的发育早期阶段十分关键[22-23]。
对于成骨分化中晚期，形成矿化钙结节被认为是公认的金标准[24]，因此对成骨分化21 d的细胞进行茜素红S染色，结果发现经过2种纳米颗粒处理的细胞形成的矿化结节均多于对照组，同时晚期成骨分化标志物OPN和OCN在ZrO2组和HAP组中高表达，OPN和OCN是成骨分化中晚期的标志性蛋白[25-26]，这2种蛋白高表达表明2种纳米颗粒在中晚期也能促进EMSCs成骨分化。另外，观察到EMSCs在成骨分化过程中存在自发向脂肪细胞分化的现象，但这种现象并没有被HAP和ZrO2逆转。
目前，各种纳米颗粒作为骨科内植入物填充剂已被广泛使用，包括纳米HAP、MnO2、ZrO2和MgO等[27-28]，这些纳米颗粒具有不同的理化性质，因此具有不同的生物学功能，例如MnO2能清除损伤环境中氧自由基，调节炎症从而促进骨再生；利用3D打印技术将MgO掺入聚己内酯支架可有效促进骨折区域血管再生，从而加速骨愈合[29-30]。有研究表明，将ZrO2填充在水凝胶以及内植入物中，可明显提高这些材料的机械强度，从而能更好地适应各种骨折内环境的需求[31]，但其中的分子机制仍然未知且缺乏体内实验的验证，后续研究也会继续深入，弥补目前实验研究的不足之处。
综上，该研究证明了ZrO2对EMSCs的成骨分化有促进作用，且这种促进作用在一定程度上与HAP相当。因此，纳米级ZrO2可用于生物支架的填充材料用于进一步提高生物材料的骨诱导性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

纳米二氧化锆对鼻黏膜外胚层间充质干细胞成骨分化的影响

Effects of nano-zirconium dioxide on osteogenic differentiation of ectomesenchymal stem cells in nasal mucosa

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