复合压电薄膜生物相容性及电输出性能与兔骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2024.139

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (13): 1969-1975.doi: 10.12307/2024.139

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复合压电薄膜生物相容性及电输出性能与兔骨髓间充质干细胞的成骨分化

王桢1，2，3，许顺恩1，2，3，汤耿4，罗四维2，3，滕建祥2，3，谢孟利2，3，何佳林2，3，叶川1，2，3

1贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；3组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004； 4贵州师范大学机械与电气工程学院，贵州省贵阳市 550025

收稿日期:2023-02-27 接受日期:2023-04-14 出版日期:2024-05-08 发布日期:2023-08-28
通讯作者: 叶川，主任医师，贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004
作者简介:王桢，男，1996年生，湖南省娄底市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事组织工程支架、生物材料、干细胞研究。
基金资助:
贵州省科技厅资助项目(黔科合平台人才 [2020]6013，黔科合支撑项目[2020]4Y137)，项目负责人：叶川

Biocompatibility and electrical output performance of composite piezoelectric film and osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Wang Zhen1, 2, 3, Xu Shunen1, 2, 3, Tang Geng4, Luo Siwei2, 3, Teng Jianxiang2, 3, Xie Mengli2, 3, He Jialin2, 3, Ye Chuan1, 2, 3

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 3Research Center of Tissue Engineering and Stem Cell Technique, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 4College of Mechanical and Electrical Engineering, Guizhou Normal University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China

Received:2023-02-27 Accepted:2023-04-14 Online:2024-05-08 Published:2023-08-28
Contact: Ye Chuan, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Research Center of Tissue Engineering and Stem Cell Technique, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Wang Zhen, Master candidate, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Research Center of Tissue Engineering and Stem Cell Technique, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
Guizhou Provincial Department of Science and Technology Project, No. Talents of Qiankehe Platform [2020]6013, Qiankehe Support [2020]4Y137 (to YC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

锡钛酸钡钙：是钛酸钡压电陶瓷的固溶体，其压电常数高达460 pC/N，具有良好的生物相容性。
3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrateco/4-hydroxybutyrate，P34HB)：含有3-羟基丁酸酯与4-羟基丁酸酯的嵌段共聚物，是一种由微生物发酵而成的天然高分子材料，可应用于可吸收缝线合成、生物敷料、食品包装、污水处理等领域。

背景：可控的压电效应能促进组织的再生与修复，压电材料在负重组织工程领域应用广泛。

目的：制备一种可促进骨组织再生的压电薄膜材料，探究其结构表征、电输出性能、生物相容性及其电输出对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：以聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrateco/4-hydroxybutyrate，P34HB)为原料，加入质量比分别为0%，5%，10%，15%，20%的锡钛酸钡钙(Ba0.94Ca0.06Sn0.08Ti0.92O3，BCST)粉末，以二氯甲烷为溶剂，通过真空干燥方法制得150-200 μm厚度BCST/P34HB压电薄膜材料，经油浴极化后，检测其表面形貌、物相组成、压电系数和开路电压，以及BCST/P34HB在110 Hz、0.25 N力幅度下的电输出对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。

结果与结论：①扫描电镜、X射线衍射、水接触角、压电系数检测及电输出性能测试显示，当BCST质量比增加至20%时，BCST/P34HB压电薄膜有着良好的压电性能(d33=5.9 pC/N)及电输出性能(180 mV)，更接近500 mV的合适电刺激成骨范围；②活死染色显示，与兔骨髓间充质干细胞共培养第1天，15%组与20%组显示出较少的红色荧光；当培养到第5天时，各组绿色荧光数量较第1天明显增多，10%组、15%组和20%组未见红色荧光，仅0%组和5%组有少量的红色荧光；③阿尔玛蓝染色显示，与兔骨髓间充质干细胞共培养第1，3，5天，随着时间的增加，各组细胞都呈现出增长的趋势，当培养到第5天时，20%组的细胞量明显高于0%组(P < 0.05)；④成骨诱导第10天，碱性磷酸酶染色结果显示20%组的染色阳性率明显高于0%组(P=0.000 1)；成骨诱导第21天，茜素红染色和钙结节定量分析显示出了与碱性磷酸酶染色相似的趋势，与0%组相比，15%组和20%组均显示出明显的差异(P < 0.01，P < 0.000 1)；⑤结果表明，20%BCST/P34HB薄膜具有良好的压电性能、电输出性能、生物相容性及促骨髓间充质干细胞成骨分化能力。

https://orcid.org/0000-0003-2325-1761 (王桢)；https://orcid.org/0000-0001-5670-6289 (叶川)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨组织工程, P34HB, 压电材料, 薄膜材料, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Adjustable piezoelectric effect can promote tissue regeneration and repair. Piezoelectric materials are widely used in weight-bearing tissue engineering.
OBJECTIVE: To prepare a piezoelectric film material that can promote bone regeneration, and to explore its structural characterization, electrical output performance, biocompatibility, and effect of electrical output on osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Using poly-3-hydroxybutyrateco/4-hydroxybutyrate (P34HB) as raw material, barium calcium stannate titanate powder (Ba0.94Ca0.06Sn0.08Ti0.92O3, BCST) was added according to mass ratios of 0%, 5%, 10%, 15%, and 20%. Dichloromethane was added to solve P34HB, and the thickness of 150-200 μm BCST/P34HB piezoelectric film was prepared by vacuum drying method. After polarization in the oil bath, the surface morphology, crystal phase composition, piezoelectric coefficient and open circuit voltage were tested. The effect of BCST/P34HB electrical output at 110 Hz and 0.25 N force on the proliferation and osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells was tested.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy, X-ray diffraction, water contact angle, piezoelectric coefficient and electrical output performance tests showed that when the mass ratio of BCST increased to 20%, the BCST/P34HB piezoelectric film had good piezoelectric properties (d33=5.9 pC/N) and electrical output performance (180 mV), which was closer to the suitable range of 500 mV for electrical stimulation. (2) Live and dead staining showed that on the first day of co-culture, 15% group and 20% group showed less red fluorescence. On the 5th day of culture, the number of green fluorescence in each group was significantly higher than that on the first day, and the red fluorescence was not observed in the 10%, 15% and 20% groups, and only a small amount of red fluorescence was observed in the 0% and 5% groups. (3) On the 1st, 3rd and 5th days of co-culture with rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, Almar blue staining exhibited that the number of cells in each group showed an increasing trend with the increase of time. On the 5th day of culture, the number of cells in the 20% group was significantly more than that in the 0% group (P < 0.05). (4) On day 10 of osteogenic induction, alkaline phosphatase staining results showed that the positive rate of the 20% group was significantly higher than that of the 0% group (P=0.000 1). On day 21, alizarin red staining and quantitative analysis of calcium nodules showed a similar trend to alkaline phosphatase staining. Compared with the 0% group, the 15% group and 20% group showed significant differences (P < 0.01, P < 0.000 1). (5) The results showed that 20% BCST/P34HB films had good piezoelectric properties, electrical output properties, biocompatibility and the ability of promoting osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: bone tissue engineering, P34HB, piezoelectric material, film material, osteogenic differentiation

中图分类号:

王桢, 许顺恩, 汤耿, 罗四维, 滕建祥, 谢孟利, 何佳林, 叶川. 复合压电薄膜生物相容性及电输出性能与兔骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(13): 1969-1975.

Wang Zhen, Xu Shunen, Tang Geng, Luo Siwei, Teng Jianxiang, Xie Mengli, He Jialin, Ye Chuan. Biocompatibility and electrical output performance of composite piezoelectric film and osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(13): 1969-1975.

图/表（结果） 7

2.1 各组压电薄膜的表面微观形貌图2A显示，当BCST含量依次增加时，可以看到长条形或方形的颗粒均匀镶嵌在P34HB薄膜上；当含量达到20%时，颗粒出现聚团现象；图2B显示，加入BCST后，能谱的颗粒出现Ba，Ca，Sn及Ti元素所对应的峰，说明颗粒为加入的BCST压电陶瓷。

2.2 各组压电薄膜的X射线衍射结果图3中下部是钛酸钡四方晶系的标准图谱(PDF 79-2264)，随着BCST含量的增加，P34HB峰的强度减小，压电陶瓷峰的强度增加，20%组样品中几乎未见P34HB的峰。

2.3 各组压电薄膜的水接触角测量结果 0%组，5%组，10%组，15%组及20%组薄膜的水接触角分别为(65.9±2.4)°，(67.8±1.8)°，(64.4±4.5)°，(64.3±3.1)°，(67.7±1.8)°，组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.4 各组压电薄膜的压电常数当BCST含量在0%，5%和10%时，BCST/P34HB压电薄膜几乎测不出d33；当BCST含量增加至15%，d33为(1.0±0.37) pC/N；继续提升BCST含量至20%，d33有了明显提升(P < 0.000 1)，d33为(5.9±1.23) pC/N，见图5。

2.5 各组压电薄膜的电输出结果在110 Hz、0.25 N的机械震动下，0%，5%，10%组未显示压电的电压波动，当BCST含量提升到15%时，显示出与力频(110 Hz)相似的电压波动，约80 mV；继续提升BCST含量到20%时，示波器记录到明显的压电电压波动，峰值最高约为180 mV，见图6。

2.6 各组BCST/P34HB压电薄膜的生物相容性在活死染色实验中，与rBMSCs共培养第1天，各组BCST/P34HB压电薄膜均出现红色荧光(死细胞)，随着BCST含量的提升，15%组与20%组显示出较少的红色荧光；当培养到第5天时，各组绿色荧光(活细胞)数量较第1天明显增多，且细胞舒展，10%组、15%组和20%组未见红色荧光，仅0%组和5%组有少量的红色荧光，见图7A。在Alamar Blue染色第1，3，5天，随着时间的增加，各组细胞都呈现出增长的趋势，当培养到第5天时，20%组的细胞量明显高于0%组(P < 0.05)，见图7B。

2.7 各组BCST/P34HB压电薄膜电输出对rBMSCs成骨分化的影响碱性磷酸酶染色结果显示，培养第10天时，各组均出现不同数量的碱性磷酸酶染色阳性细胞，见图8A；通过Image J统计分析碱性磷酸酶阳性区域面积与细胞面积比值，20%组的阳性率明显高于0%组(P=0.000 1)，其余组与0%组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8B。第21天的茜素红染色和钙结节定量分析中，显示出了与碱性磷酸酶染色相似的趋势，与0%组相比，15%组和20%组均显示出明显的差异(P < 0.01，P < 0.000 1)，见图8C，D。

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引言

高分子材料聚羟基脂肪酸酯类材料降解后不产生酸性产物，其较聚乳酸类高分子材料在成骨性能方面更具优势[1-3]。第4代聚羟基脂肪酸酯类材料3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrateco/4-hydroxybutyrate，P34HB)具有良好的生物相容性、生物降解性和成骨能力。P34HB静电纺丝薄膜有着良好的生物相容性和成骨能力，可修复SD大鼠颅骨缺损[4-5]。然而，较长的骨修复时间(16周)也提示其成骨活性具有较大的提升空间。
压电材料能将机械能和电能互相转换，其中压电陶瓷因制备工艺简单、成本低廉、性能优异等特点，已被广泛应用于科技、工业、军事、医学以及日常生活中[6-9]。基于钛酸钡压电陶瓷的固溶体具有较高的介电、压电和铁电性能，基于钛酸钡的器件已用于电容器、场效应晶体管和机电器件等产品[10]。该系列产品具有良好的生物相容性，其在生物领域也广泛应用，包括用于生物医学成像的血管内超声换能器、可穿戴传感器和用于骨再生的生物相容性复合材料[11-13]。
人体的皮肤、骨骼及神经组织等本身就是一个压电体，其在受力的情况下会释放出电荷，故将压电材料应用在组织工程尤为适合[14-17]。WANG等[18]通过静电纺丝方法将聚偏氟乙烯三氟乙烯[P(VDF-TrFE)]制成微纳米纤维薄膜，该薄膜在0.5 N、1 Hz机械震动作用下可产生约20 nA的短路电流和500 mV的开路电压，细胞增殖率提高1.6倍，在大鼠皮肤缺损模型中有效促进了创面的愈合。JIN等[19]通过将一种新型的摩擦/压电混合纳米发生器与纳米多孔神经导管集成在一起，产生一种生理自我调节的电信号(physiologically self-regulated electrical signal，PSR-ES)，以构建一个完全植入式神经电刺激(fully implantable neural electrical stimulation，FI-NES)系统，用于修复体内长段周围神经损伤(peripheral nerve injury，PNI)。LIU等[20]将聚左旋乳酸制成压电纤维薄膜，植入股骨内侧髁处有软骨缺损的兔膝关节内，兔膝关节透明软骨再生良好，但是聚左旋乳酸降解的酸性产物不利于成骨分化碱性微环境的形成，这限制了聚左旋乳酸压电纤维薄膜在骨组织工程的应用。
锡钛酸钡钙(Ba0.94Ca0.06Sn0.08Ti0.92O3，BCST)压电陶瓷是在BaTiO3基体中掺入Ca和Sn原子的固溶体系材料，压电常数得到提升，高达460 pC/N。前期研究中已证实BCST在体外具有良好的生物相容性，支撑材料见图1。研究发现在复合材料中掺入高压电系数材料可以获得压电性能[21]。受此启发，将压电性能优异的BCST与P34HB制成压电薄膜，以期赋予P34HB电生物活性从而获得更好的成骨效应。以P34HB为主材料，通过掺入不同质量分数的BCST，研究BCST/P34HB的表面微观形貌、亲水性及压电系数。研究者通过超声方式激发压电效应[22-25]，考虑到生物机械能产生的压电成骨效应可能对指导患者术后运动有更重要的意义，通过改装的YE2730A准静态d33测量仪施加类生物机械力激发BCST/P34HB的压电效应，探究其电输对兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)成骨分化的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计基于浇铸法制备BCST/P34HB压电薄膜，体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年12月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验室完成。
1.3 材料 P34HB( MW 350 000，珠海麦得发生物科技股份有限公司，中国)；BCST粉末(贵州大学材料与冶金学院，中国)。
实验动物：1只4 周龄新西兰幼兔，体质量1.0 kg左右，雌雄不拘，由贵州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(黔)2018-0001。动物实验获贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：2201606。
实验主要试剂及仪器：二氯甲烷(天津富宇化学试剂公司)；胎牛血清(上海卡迈舒生物科技有限公司)；激光共聚焦显微镜 LSM5 Excitor(Carl Zeiss)；接触角测试仪(DropMaster，DMo-501)；示波器(TBS1102X，tektronix，USA)；YE2730A准静态d33测量仪(上海双旭电子有限公司，中国)；油浴极化(PZT-FJH20/3复合压电极化装置，中国)；多功能酶标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)；Alamar Blue测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；rBMSCs成骨诱导液(江苏海星生物科技有限公司)；十六烷基吡啶(上海麦克林生化科技股份有限公司)；超声分散仪 (Scientz-2400F，宁波)；扫描电镜(Sigma 300，ZISS，Germany)；X射线衍射仪(Miniflex600，理学Rigaku Ultima IV，Japan)；其他分析级化学试剂和溶剂均来自细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室(贵州医科大学，贵阳，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 BCST/P34HB压电薄膜制备根据薄膜材料BCST与P34HB质量比不同分为5组(n=4)：0%组，BCST/P34HB=0/100；5%组，BCST/P34HB=5/95；10%组，BCST/P34HB=10/90；15%组，BCST/P34HB=15/85；20%组，BCST/P34HB=20/80。
将5份质量为0.6 g的P34HB粉末溶于5份10 mL二氯甲烷中得到6% P34HB溶液，磁力搅拌溶解2 h，按照上述比例加入质量分别为0，0.031 6，0.067，0.106，0.150 g BCST粉末，均匀分散于上述6% P34HB溶液中，低温避光超声分散3 h，功率为2 400 W。采用溶液浇铸法将混合溶液浇铸于洁净的模具(20 mm×20 mm)中，真空干燥12 h自然成膜，得到BCST/P34HB压电薄膜，厚度为150-200 μm。使用油浴极化装置对各组复合薄膜材料进行油浴极化，以铜片(d=0.2 mm，R=10 mm)为电极，极化电压为0.9 kV，极化时间为30 min。
1.4.2 BCST/P34HB压电薄膜表面形态学检测将薄膜裁剪成边长为15 mm的方片，采用扫描电镜观察薄膜材料的表面微观形貌(加速电压为0.02-30 kV)并进行能谱分析(energy spectrum analysis，EDS)。
1.4.3 X射线衍射分析将薄膜裁剪成边长为15 mm的方片，采用X射线衍射仪(X-Ray Diffraction，XRD)分析材料的物相组成，测试条件如下：Cu靶Kα辐射(λ=1.540 6 Å，1 Å=0.1 nm)，管电压为40 kV，管电流为40 mA，扫描模式为2θ，扫描范围为10°-80°，0.02 (°)/步及2 (°)/min，衍射图由origin Pro 2016绘制。
1.4.4 BCST/P34HB压电薄膜亲水性能检测采用接触角测量仪分析材料的亲水性能，将薄膜固定于载玻片上，通过下压微量注射器推杆使得3 μL去离子水落在薄膜上，等水滴稳定后拍照，利用Image J中Contact angle模块测量其接触角，每个样品取5个点测量，每组取3个重复样。
1.4.5 BCST/P34HB压电薄膜d33系数检测用准静态d33测试仪直接测试各组薄膜的压电常数，每个样品取5个点进行测量，记录范围，取平均数。

1.4.6 BCST/P34HB压电薄膜电输出性能检测将各组薄膜分别通过铜导线接入示波器，使用绝缘胶布固定如图1，利用改装的YE2730A准静态d33测量仪对薄膜施加110 Hz、0.25 N的压力，测试薄膜的开路电压。

1.4.7 rBMSCs的分离培养将幼兔注射过量麻药行安乐死，分离股骨、胫骨及肱骨，剔除表面多余软组织浸泡于体积分数为75%医用乙醇内3-5 min，转移至超净工作台内部操作。用无菌PBS反复清洗幼兔骨，去除表面残余乙醇，骨头分离后将一侧骨骺剪断，用5 mL注射器吸取一定量的无菌PBS，将骨髓冲洗至无菌培养皿中，将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，去上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，获得 rBMSCs，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养扩增至第3代。
1.4.8 薄膜的细胞相容性实验
细胞增殖实验：将5组薄膜裁剪成15 mm×15 mm大小置于24孔Transwell板小室中，每孔板底接种1×104个rBMSCs(2.5×107 L-1)，培养1，3，5 d后，根据Alamar Blue试剂盒说明书，将测定溶液与细胞培养基以体积比 1∶10 混合后，每孔加入200 μL混合液体，37 ℃孵育2 h。取每个样品的混合液体100 μL放入96孔板中，使用多功能酶标仪在544 nm/590 nm 的激发/发射波长下测量荧光强度。
Live/Dead染色：标本制备、细胞种植过程与增殖实验相同，分别在1，3，5 d时用Live/Dead染色剂室温染色1 h；PBS冲洗2次，每次5 min；在共聚焦激光显微镜下观察，红色荧光为死细胞，绿色荧光为活细胞。
1.4.9 细胞成骨分化能力检测
碱性磷酸酶染色：压电激发方式与电输出性能测试相同，取6孔板，每孔分别赋予2条铂电极，与铜线连接形成闭合电路，见图1E，每孔接种5×104个(1×108 L-1)rBMSCs，每孔加入2 mL成骨诱导液，同时对薄膜施加110 Hz、0.25 N压力，每天刺激30 min，培养10 d后进行碱性磷酸酶染色。采用光学显微镜观察染色情况，随机选取视野进行图像采集，并以 Image pro 6.0 (Rockville，MD，USA) 计算其染色区域面积。
茜素红染色：干预方式与碱性磷酸酶染色相同，在诱导第21天时，40 g/L多聚甲醛固定，每孔加入2 mL茜素红S溶液染色3 min，PBS清洗3次，光学显微镜观察染色情况。
茜素红染色定量分析：待茜素红染色结果观察结束后，每孔加入500 μL 10%十六烷基吡啶，室温置于摇床1 h，取上清液 100 μL 放入96孔板中，用酶标仪在波长570 nm处测定样本吸光度值。
1.5 主要观察指标 5组压电薄膜的表面特征、压电系数、电输出、生物相容性及促成骨特性。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 26.0软件进行处理，所有实验至少进行3次，定量数据以x±s表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行多重比较。该文统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

骨是人类主要的负重结缔组织，也是人类最易变性的结缔组织。近年来，由于交通事故、创伤和疾病等造成的人体骨组织创伤和缺损日益增多，骨缺损修复材料的需求不断加大，再生和修复是一个挑战。随着组织工程的快速发展，日益增多的研究致力于组织工程支架。目前，用于人工骨合成的组织工程支架材料包括了天然生物材料、合成有机高分子材料、生物陶瓷材料等。天然生物材料具有良好的生物相容性，可广泛应用于再生医学领域。合成有机高分子材料如聚羟基脂肪酸酯，虽具备良好的生物相容性和降解性能，但较差亲水性及力学性能不可控等弊端限制了其在生物医学领域的应用。第4代聚羟基脂肪酸酯产品P34HB具有更出色的力学性能、更佳的生物相容性和可降解性，因而在骨与软骨组织工程中备受关注[26]。
压电材料是一种可将能量进行转换的功能材料，将其植入骨缺损处后，通过机体的运动能将机械能转化为电效应，产生的微电流可刺激骨与软骨再生和修复。值得注意的是，骨在剪切模式下压电常数高达0.7 pC/N[27]，大多情况下压电支架的d33系数明显高于0.7 pC/N，即压电支架比骨要产生更多的电荷。然而，如果发现这些电荷不足以引起有益的细胞反应，就需要改进支架的压电特性[21]。LIU等[28]制备了聚偏二氟乙烯和氧化石墨烯的核-壳结构复合亚微米纤维，与纯聚偏二氟乙烯纤维相比，压电常数增加了426%，这提示了不同材料的掺入能调节骨压电材料的压电性能。P34HB暂未被检测出压电属性，掺入BaTiO3(d33=150-170 pC/N)仍未能显示出有效的压电性能，因此提高BaTiO3压电性能有望解决这一问题。BaTiO3陶瓷粉末掺杂Sn及Ca类元素后得到BCST，其压电性能明显提升(d33=460 pC/N)。然而，并不是压电性能越高就越好，LEWIS等[29]研究表明较高的压电性能所产生的电荷值可导致细胞死亡，因此 BCST在复合材料中的掺入比例也是值得注意的问题。
将具成骨分化潜力的P34HB高分子材料与压电性能优异的BCST陶瓷粉末制成薄膜。扫描电镜及能谱分析结果表明成功制备了BCST/P34HB薄膜，BCST含量增加到20%时出现聚团现象，这可能与BCST粉末较小的直径导致表面能增大有关。X射线衍射结果显示5%，10%，15%及20%组样品中压电陶瓷相的衍射峰与BCST的四方晶系铁电相符合，铁电相是具有自发极化的压电相，说明复合材料具备压电性能的特征相。此外，压电陶瓷的加入会减小P34HB的结晶度，这一变化可能会使BCST/P34HB压电薄膜的力学性能发生改变[30]。随着不同质量BCST的加入，各组BCST/P34HB的水接触角差异均无显著性意义，因此认为BCST不会显著改变P34HB的亲水性。
当BCST含量增加时，BCST/P34HB压电薄膜的压电系数d33开始呈现逐步上升的趋势，这是因为压电复合材料的性能主要与压电陶瓷的含量与性能相关。陶瓷介电性能一般与压电性能呈正相关，BCST具有较高的压电性能，因而提高BCST含量可以增加复合物的介电常数，从而增加极化效应，同时增加的压电陶瓷含量相当于在复合物中提升了压电陶瓷的联通度，进而提升压电性能[31]。这种在陶瓷/聚合物复合材料增加压电陶瓷含量提升压电系数的趋势也与其他报道相一致[8，32]。把BCST/P34HB压电薄膜组装成检测单元进行开路电压检测时，可以观察到0%，5%，10%组几乎没有压电电压波动，根据压电陶瓷开路电压方程U0=F0*d33/Cp(U0表示开路电压，F0为压电陶瓷表面所受力，Cp为理想条件下的压电陶瓷电容)，这可能与其较低的压电系数d33有关；当BCST含量增加至15%时，可观察到与震动频率(110 Hz)一致的压电电压波动，当继续增加BCST含量至20%时，可观察到显著的压电电压波动，峰值约为180 mV，这与YAN等[33]报道的500 mV电刺激有利于MC3T3-E1细胞成骨更为接近。
各组压电薄膜在与rBMSCs共培养的情况下， Alamar Blue染色结果表明，随着BCST含量的增加，BCST/P34HB压电薄膜的细胞相容性得到提升，这说明了BCST的加入可以改善P34HB的生物相容性。在成骨诱导培养中，碱性磷酸酶染色、茜素红S染色及定量分析结果都说明了当rBMSCs受到压电刺激时，一定程度上可以促进其向成骨细胞分化，这或许是电刺激干预的情况下，rBMSCs通过激活钙敏感受体和/或增加钙离子流入，上调更多的胞质钙离子，从而激活rBMSCs的成骨分化有关[34-36]。
综上所述，此次实验基于高分子可降解材料P34HB和压电陶瓷BCST粉末，采用共混、真空和干燥的方法制备得到不同质量分数的BCST/P34HB薄膜，经油浴极化后得到BCST/P34HB压电薄膜，该制备方法具有简单性、有效性，制得的压电薄膜具有良好的生物相容性和压电刺激成骨特性，实现了P34HB从惰性向压电生物活性的转变。此次实验的不足之处在于未能在模拟动物体活动时探讨应力传导下BCST/P34HB压电薄膜的压电效应对rBMSCs成骨分化的影响和未验证压电效应促进rBMSCs成骨分化的具体机制；此外，还缺乏体内实验进一步证明BCST/P34HB薄膜的成骨性能。尽管存在以上的不足，但是不影响该研究的主要结论。此次实验均在体外进行，受其在体外良好的压电性能、生物相容性及成骨分化能力的鼓励，后续研究将通过动物实验进一步证明其良好的生物相容性和成骨效果，为BCST/P34HB压电薄膜在骨组织工程的应用提供科学依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

复合压电薄膜生物相容性及电输出性能与兔骨髓间充质干细胞的成骨分化

Biocompatibility and electrical output performance of composite piezoelectric film and osteogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

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