白细胞介素4调控巨噬细胞极化及骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2024.189

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 3960-3966.doi: 10.12307/2024.189

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

白细胞介素4调控巨噬细胞极化及骨髓间充质干细胞的成骨分化

张洁1，2，肖天骄2，李丽2，康佳兵2，湛济帆2，韦艳2，田艾2，3

1贵州中医药大学第一附属医院，贵州省贵阳市 550001；2贵州医科大学口腔医学院，贵州省贵阳市 550001；3贵州医科大学附属口腔医院修复种植科，贵州省贵阳市 550001

收稿日期:2023-05-04 接受日期:2023-08-16 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 田艾，博士，副教授，副主任医师，贵州医科大学口腔医学院，贵州省贵阳市 550001；贵州医科大学附属口腔医院修复种植科，贵州省贵阳市 550001
作者简介:张洁，女，1996年生，贵州省贵阳市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事巨噬细胞影响骨替代材料修复骨缺损的分子机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81760192，82260193)，项目负责人：田艾

Interleukin-4 regulates macrophage polarization and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Jie1, 2, Xiao Tianjiao2, Li Li2, Kang Jiabing2, Zhan Jifan2, Wei Yan2, Tian Ai2, 3

1First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; 2School of Stomatology, Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; 3Department of Restoration and Implant, Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China

Received:2023-05-04 Accepted:2023-08-16 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Tian Ai, MD, Associate professor, Associate chief physician, School of Stomatology, Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; Department of Restoration and Implant, Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
About author:Zhang Jie, Master candidate, First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; School of Stomatology, Guizhou Medical University, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81760192, 82260193 (to TA)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

巨噬细胞极化：巨噬细胞会受到微环境中多种因子的调节与诱导，从而可以产生不同的功能状态。这种功能可塑性称为巨噬细胞极化，炎性巨噬细胞被称为经典激活的或M1巨噬细胞，而活跃于组织再生的巨噬细胞为交替激活的或M2巨噬细胞。
JAK1/STAT6信号通路：此信号通路的信号传递包括JAK和STATs的磷酸化、STAT蛋白二聚化移位到细胞核。在炎症相关疾病中，以JAK/STAT6依赖的方式发挥抗炎、抗凋亡和神经保护作用，同时是骨髓间充质干细胞生理活动的决定性调节因素，在成骨代谢活动中发挥着重要作用。
NLRP3炎症小体：是由NOD样受体、凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1组成的多蛋白复合体，控制着Caspase-1的活性和天然免疫系统中炎症细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素18的成熟和分泌，介导炎症，并诱导细胞焦亡。

背景：白细胞介素4可以提高骨替代材料的成骨效应，但其分子机制尚未明确，进一步阐明白细胞介素4提高成骨效应的作用机制，有助于为牙槽骨缺损患者的再生治疗找到安全、经济和有效的方法。

目的：探讨白细胞介素4对巨噬细胞极化转化和骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其可能的作用机制。
方法：M1组RAW264.7细胞用干扰素γ+脂多糖诱导24 h，白细胞介素4+M1组RAW264.7细胞用干扰素γ+脂多糖诱导24 h后加入白细胞介素4诱导24 h，白细胞介素4+AG+M1组RAW264.7细胞用干扰素γ+脂多糖诱导细胞24 h后加入白细胞介素4和JAK/STAT通路抑制剂AG-490诱导24 h。干预结束后，采用免疫荧光染色分析巨噬细胞表型标记蛋白诱导型一氧化氮合酶、CD206的表达；采用ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平；采用RT-qPCR检测NLRP3、白细胞介素1β、caspase-1的 mRNA表达；采用 Western blot检测JAK1/p-JAK1、STAT6/p-STAT6、NLRP3、pro-IL-1β和pro-caspase-1通路蛋白的表达水平。随后将以上4组RAW264.7细胞与骨髓间充质干细胞transwell间接共培养24 h，然后进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色，采用RT-qPCR检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素的mRNA表达。

结果与结论：①免疫荧光、ELISA检测结果显示白细胞介素4可促进M2样巨噬细胞CD206和白细胞介素10的表达，抑制诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α的表达；②RT-qPCR结果显示白细胞介素4可抑制NLRP3、白细胞介素1β、caspase-1 mRNA表达；③Western blot结果显示白细胞介素4可促进JAK1/p-JAK1、STAT6/p-STAT6和NLRP3蛋白表达明显增加；④与白细胞介素4+M1组RAW264.7细胞共培养的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色、茜素红染色明显增强，碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素的mRNA表达明显升高。结果表明，白细胞介素4可能通过上调JAK1/STAT6通路，抑制NLRP3活化，从而促进巨噬细胞从M1向M2样极化转换，最终增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。

https://orcid.org/0000-0003-4456-1144 (张洁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 巨噬细胞, 白细胞介素4, NLRP3炎性小体, JAK/STAT信号通路, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Interleukin-4 can promote the osteogenic effect of bone substitute materials, but its molecular mechanism is not yet clear. Further elucidating the mechanism of interleukin-4 promoting osteogenic effect can help find safe, economical, and effective methods for the regeneration treatment of alveolar bone defects in patients.
OBJECTIVE: To explore the effect of interleukin-4 intervention on polarization transformation of macrophages and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and its possible mechanism.
METHODS: RAW264.7 cells in the M1 group were induced with interferon gamma + lipopolysaccharide for 24 hours. RAW264.7 cells in the interleukin-4+M1 group were induced with interferon gamma + lipopolysaccharide for 24 hours and then interleukin-4 was added for 24 hours. RAW264.7 cells in the interleukin-4+AG+M1 group were induced with interferon gamma + lipopolysaccharide for 24 hours, and then interleukin-4 and AG-490, a JAK/STAT pathway inhibitor, were added for 24 hours. After intervention, immunofluorescence staining was used to analyze the expression of inducible nitric oxide synthase and CD206, the phenotypic marker protein of macrophages. ELISA kit was used to detect the expression of interleukin-10 and tumor necrosis factor-α in the supernatant of cell culture. The gene expressions of nodular receptor protein-3 (NLRP3), interleukin-1β, and caspase-1 were detected by RT-qPCR. The expression levels of tyrosine protein kinase 1 (JAK1)/ phosphorylated tyrosine protein kinase 1 (p-JAK1), signal transduction and transcription activator 6 (STAT6)/phosphorylated signal transduction and transcription activator 6 (p-STAT6), NLRP3, pro-interleukin-1β and pro-caspase-1 were detected by western blot assay. Then, RAW264.7 cells in the above four groups were indirectly co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells by transwell for 24 hours, followed by alkaline phosphatase staining and alizarin red staining. The mRNA expressions of alkaline phosphatase, collagen type I, and osteocalcin were detected by RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence and ELISA results showed that interleukin-4 intervention could promote the expression of CD206 and interleukin-10 in M2 macrophages, and inhibit the secretion of inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor-α. (2) RT-qPCR results showed that interleukin-4 could suppress the expression of NLRP3, interleukin-1β, and caspase-1 mRNAs. (3) Western blot assay showed that interleukin-4 could promote the expression of JAK1/p-JAK1, STAT6/p-STAT6 and NLRP3 proteins. (4) The alkaline phosphatase staining and alizarin red staining of bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with the interleukin-4+M1 group were significantly enhanced, and the mRNA expressions of alkaline phosphatase, collagen type I, and osteocalcin were significantly increased. It is concluded that interleukin-4 may inhibit the activation of NLRP3 by up-regulating JAK1/STAT6 pathway, thus promoting the transformation of macrophages from M1 polarization to M2 polarization, and finally enhancing the osteogenic differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: macrophage, interleukin-4, NLRP3 inflammatory, JAK/STAT signaling pathway, osteogenic differentiation

中图分类号:

张洁, 肖天骄, 李丽, 康佳兵, 湛济帆, 韦艳, 田艾. 白细胞介素4调控巨噬细胞极化及骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3960-3966.

Zhang Jie, Xiao Tianjiao, Li Li, Kang Jiabing, Zhan Jifan, Wei Yan, Tian Ai. Interleukin-4 regulates macrophage polarization and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 3960-3966.

图/表（结果） 5

2.1 白细胞介素4促进M1型巨噬细胞转化为M2型免疫荧光结果显示，脂多糖+干扰素γ处理后，RAW264.7细胞中M1标记诱导型一氧化氮合酶荧光强度比M2标记CD206更强，而白细胞介素4干预M1巨噬细胞后，诱导型一氧化氮合酶荧光强度减弱，而CD206荧光强度明显增强，差异有显著性意义(P < 0.05)；使用AG-490与白细胞介素4干预M1巨噬细胞24 h后，诱导型一氧化氮合酶荧光强度明显增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，并且CD206荧光强度减弱，见图1。

2.2 白细胞介素4抑制促炎因子的分泌，增加抗炎因子分泌 M1组肿瘤坏死因子α水平显著上升，白细胞介素4处理后肿瘤坏死因子α水平明显下降，白细胞介素10水平上调，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。说明白细胞介素4对脂多糖+干扰素γ刺激的肿瘤坏死因子α的分泌有抑制作用，并且促进了白细胞介素10的分泌。

2.3 白细胞介素4处理激活JAK1/STAT6信号通路 Western blot实验检测了STAT6、JAK1、p-STAT6和p-JAK1蛋白的表达。结果表明，与M1组相比，白细胞介素4+M1组p-JAK1/JAK1和p-STAT6/STAT6水平明显升高(P < 0.05)；与白细胞介素4 +M1组相比，白细胞介素4 +AG+M1组p-JAK1/JAK1和p-STAT6/STAT6水平降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 白细胞介素4处理抑制NLRP3的活化 q-PCR结果显示，与M0组相比，M1组NLRP3、白细胞介素1β、caspase-1的mRNA相对表达量明显增高，白细胞介素4+M1组上述mRNA相对表达量降低，而AG-490的加入会明显逆转NLRP3 mRNA的表达(P < 0.05)，见图4A。Western blot结果显示，与M0组相比，M1组NLRP3蛋白表达明显增高，而白细胞介素4干预显著降低其表达，白细胞介素4+AG+M1组NLRP3的表达则与之相反(P < 0.05)，见图4B，C。这些结果表明，白细胞介素4诱导M2巨噬细胞极化的机制与抑制NLRP3活化有关。

2.5 白细胞介素4 促进M2巨噬细胞极化从而增强骨髓间充质干细胞成骨分化第3代骨髓间充质干细胞贴壁生长，呈长梭形，见图5A；成脂诱导后见明显的脂滴聚集，见图5B。碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示，白细胞介素4+M1组巨噬细胞有利于骨髓间充质干细胞成骨分化，而M1巨噬细胞明显抑制成骨分化，见图5C，与上述结果相一致的是，白细胞介素4+M1组成骨特异性基因碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素高表达。相反，与M1巨噬细胞共培养的骨髓间充质干细胞中成骨特异性基因的表达减少(P < 0.05)，见图5D。

参考文献

[1] AMENGUAL-PEÑAFIEL L, BRAÑES-AROCA M, MARCHESANI-CARRASCO F, et al. Coupling between Osseointegration and Mechanotransduction to Maintain Foreign Body Equilibrium in the Long-Term: A Comprehensive Overview. J Clin Med. 2019;8(2):139.
[2] ARRON JR, CHOI Y. Bone versus immune system. Nature. 2000;408(6812): 535-536.
[3] SALEH LS, BRYANT SJ. The Host Response in Tissue Engineering: Crosstalk Between Immune cells and Cell-laden Scaffolds. Curr Opin Biomed Eng. 2018;6:58-65.
[4] PAJARINEN J, LIN T, GIBON E, et al. Mesenchymal stem cell-macrophage crosstalk and bone healing. Biomaterials. 2019;196:80-89.
[5] MICHALSKI MN, MCCAULEY LK. Macrophages and skeletal health. Pharmacol Ther. 2017;174:43-54.
[6] ZHENG ZW, CHEN YH, WU DY, et al. Development of an Accurate and Proactive Immunomodulatory Strategy to Improve Bone Substitute Material-Mediated Osteogenesis and Angiogenesis. Theranostics. 2018;8(19):5482-5500.
[7] JIN SS, HE DQ, LUO D, et al. A Biomimetic Hierarchical Nanointerface Orchestrates Macrophage Polarization and Mesenchymal Stem Cell Recruitment To Promote Endogenous Bone Regeneration. ACS Nano. 2019;13(6):6581-6595.
[8] ZHANG J, SHI H, ZHANG N, et al. Interleukin-4-loaded hydrogel scaffold regulates macrophages polarization to promote bone mesenchymal stem cells osteogenic differentiation via TGF-β1/Smad pathway for repair of bone defect. Cell Prolif. 2020;53(10):e12907.
[9] YU Y, CUI H, ZHANG C, et al. Human nail bed extracellular matrix facilitates bone regeneration via macrophage polarization mediated by the JAK2/STAT3 pathway. J Mater Chem B. 2020;8(18):4067-4079.
[10] LIU Y, GAO X, MIAO Y, et al. NLRP3 regulates macrophage M2 polarization through up-regulation of IL-4 in asthma. Biochem J. 2018;475(12):1995-2008.
[11] SONG N, LIU ZS, XUE W, et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 2017;68(1):185-197.
[12] FURUYA MY, ASANO T, SUMICHIKA Y, et al. Tofacitinib inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-induced NLRP3 inflammasome activation in human neutrophils. Arthritis Res Ther. 2018;20(1):196.
[13] LI D, LI X, ZHANG J, et al. The immunomodulatory effect of IL-4 accelerates bone substitute material-mediated osteogenesis in aged rats via NLRP3 inflammasome inhibition. Front Immunol. 2023;14: 1121549.
[14] LASSUS J, SALO J, JIRANEK WA, et al. Macrophage activation results in bone resorption. Clin Orthop Relat Res. 1998;(352):7-15.
[15] WALKER DG, LUE LF. Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: challenges to detecting microglial polarization in human brains. Alzheimers Res Ther. 2015;7(1):56.
[16] PEREGO C, FUMAGALLI S, DE SIMONI MG. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 2011;8:174.
[17] FUMAGALLI S, PEREGO C, ORTOLANO F, et al. CX3CR1 deficiency induces an early protective inflammatory environment in ischemic mice. Glia. 2013;61(6):827-842.
[18] MARTINEZ FO, GORDON S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 2014;6:13.
[19] WANG N, GAO J, JIA M, et al. Exendin-4 Induces Bone Marrow Stromal Cells Migration Through Bone Marrow-Derived Macrophages Polarization via PKA-STAT3 Signaling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2017;44(5):1696-1714.
[20] KEEGAN AD, NELMS K, WANG LM, et al. Interleukin 4 receptor: signaling mechanisms. Immunol Today. 1994;15(9):423-432.
[21] KOH YC, YANG G, LAI CS, et al. Chemopreventive Effects of Phytochemicals and Medicines on M1/M2 Polarized Macrophage Role in Inflammation-Related Diseases. Int J Mol Sci. 2018;19(8):2208.
[22] XUAN YT, GUO Y, HAN H, et al. An essential role of the JAK-STAT pathway in ischemic preconditioning. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(16):9050-9055.
[23] XIONG H, ZHANG ZG, TIAN XQ, et al. Inhibition of JAK1, 2/STAT3 signaling induces apoptosis, cell cycle arrest, and reduces tumor cell invasion in colorectal cancer cells. Neoplasia. 2008;10(3):287-297.
[24] SHARIF H, WANG L, WANG WL, et al. Structural mechanism for NEK7-licensed activation of NLRP3 inflammasome. Nature. 2019; 570(7761):338-343.
[25] JIANG N, AN J, YANG K, et al. NLRP3 Inflammasome: A New Target for Prevention and Control of Osteoporosis? Front Endocrinol (Lausanne). 2021;12:752546.
[26] NETEA MG, NOLD-PETRY CA, NOLD MF, et al. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1beta in monocytes and macrophages. Blood. 2009;113(10):2324-2335.
[27] KONG X, LIU Y, YE R, et al. GSK3β is a checkpoint for TNF-α-mediated impaired osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in inflammatory microenvironments. Biochim Biophys Acta. 2013;1830(11):5119-5129.
[28] LOI F, CÓRDOVA LA, PAJARINEN J, et al. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 2016;86:119-130.
[29] ZHANG Y, BÖSE T, UNGER RE, et al. Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs. Cell Tissue Res. 2017;369(2):273-286.
[30] LOI F, CÓRDOVA LA, ZHANG R, et al. The effects of immunomodulation by macrophage subsets on osteogenesis in vitro. Stem Cell Res Ther. 2016;7:15.
[31] GENG Y, ZHANG L, FU B, et al. Mesenchymal stem cells ameliorate rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via the activation of M2 macrophages. Stem Cell Res Ther. 2014;5(3):80.
[32] LUZ-CRAWFORD P, JORGENSEN C, DJOUAD F. Mesenchymal Stem Cells Direct the Immunological Fate of Macrophages. Results Probl Cell Differ. 2017;62:61-72.

引言

随着骨组织工程研究的不断深入，骨替代材料已被广泛研究用于促进骨缺损和植入种植体后的骨再生。事实上，在植入生物材料的微环境中，存在着30多种不同的细胞群，这些细胞群体之间的串扰也应该得到更多的关注[1]，尤其是免疫细胞和骨骼细胞之间的串扰所形成的新的研究方向——“骨免疫学”[2]。巨噬细胞是骨重建过程中必不可少的炎性细胞[3-4]。首先，巨噬细胞可以通过吞噬作用清除入侵的微生物、受损的细胞碎片和凋亡细胞；第二，巨噬细胞具有高度的可塑性，能够根据来自微生物、受损组织或局部微环境中激活的淋巴细胞信号而分化为不同的功能表型，这个过程被称为巨噬细胞极化[5]，经典活化的巨噬细胞(M1)由干扰素γ和脂多糖诱导，分泌大量炎症细胞因子(如肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶等)，而交替激活的巨噬细胞(M2)则由白细胞介素4和白细胞介素13诱导，其特征是表面标志CD206、精氨酸酶1和转化生长因子β表达增加[5]。巨噬细胞的极化状态是不稳定的，并且可以根据微环境改变在极化状态之间切换。
到目前为止，白细胞介素4已用于许多骨组织工程的研究，其具有多种免疫调节效应，同时也是促进骨再生的正向调节因子[6-8]。ZHENG等[6]研究表明早期使用白细胞介素4可以通过抑制M1巨噬细胞的激活而促进M2巨噬细胞的激活，从而促进抗炎反应，然而这种效应的具体机制尚不清楚。白细胞介素4诱导巨噬细胞激活是白细胞介素4受体介导的细胞内包含JAK-STAT信号级联的结果[8]。最近，YU等[9]指出脱细胞甲床支架的植入会增加p-JAK2和p-STAT3的表达，促进白细胞介素4诱导的巨噬细胞交替激活，同时增加了骨形态发生蛋白2和RUNX2的表达，从而增强大鼠颅骨临界缺损的骨形成以及成骨分化。同时，有研究证实了NLRP3 通过与干扰素调节因子4相互作用后上调巨噬细胞中白细胞介素4的表达以驱动M2巨噬细胞极化[10]。在诱发过程中，NLRP3的翻译后修饰由 JNK1介导，是启动NLRP3寡聚化的关键步骤[11]。此外，抑制JAK1的活化可以减少NLRP3炎症小体成分的表达和激活[12]。目前关于JAK/STAT信号通路在骨重建中的功能及其与NLRP3炎性小体产生的关系还知之甚少，此外白细胞介素4对两者之间的具体调节机制尚未报道。
课题组前期研究表明，在大鼠颅骨缺损模型中局部注射白细胞介素4可调节骨缺损区域M1/M2极化比例，导致M2巨噬细胞数量增多，而M1巨噬细胞数量减少，从而在早期能够抑制NLRP3炎性小体的激活，减少白细胞介素1β的产生，促进骨生物支架材料诱导的成骨作用[13]，但是其中的具体作用机制尚不清楚。因此该研究将通过构建体外细胞模型探究白细胞介素4促进M2样巨噬细胞极化的可能作用机制及对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年10月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自上海富衡细胞库。
1.3.2 实验动物 SPF级SD大鼠10只，2周龄，体质量20-25 g，雌雄不限，购于贵州医科大学实验动物中心，实验方案通过贵州医科大学实验动物中心伦理审查(NO: 2001324)。
1.3.3 实验主要试剂 DMEM高糖培养基(Gibco，美国)；DMEM/F12培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(BI，以色列)；重组小鼠干扰素γ、重组小鼠白细胞介素4(PeproTech，美国)；脂多糖(Sigma，美国)；JAK-STAT抑制剂AG-490(MCE，美国)；小鼠CD206、诱导型一氧化氮合酶单克隆抗体(三鹰，武汉)；小鼠白细胞介素10、肿瘤坏死因子α酶联免疫吸附试剂盒(4A Biotech，北京)；兔抗鼠p-JAK1多克隆抗体(Abcam，美国)；兔抗鼠p-STAT6多克隆抗体(Abcam，美国)；兔抗鼠JAK1、STAT6、NLRP3多克隆抗体(Huabio，杭州)；pro-IL-1β/IL-1F2、pro-Caspase-1抗体(Novus，美国)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green Master Mix(TIANGEN，中国)；油红O染色液、茜素红染色液(Solarbio，北京)；成骨、成脂诱导分化培养基(赛业生物科技有限公司，苏州)；二抗(泰安普美生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 RAW264.7极化模型的确立
(1) RAW264.7细胞的培养：RAW264.7细胞采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。细胞生长至培养瓶底面积的80%-90%时，每2 d按照1∶3传代。
(2)建立RAW264.7细胞极化模型：将传代培养的第6代RAW264.7细胞分成4组：①M0组：DMEM高糖培养基处理细胞24 h；②M1组：干扰素γ+脂多糖诱导细胞24 h；③白细胞介素4+M1组：干扰素γ+脂多糖诱导细胞24 h后加入白细胞介素4诱导24 h；④白细胞介素4+AG+M1组：干扰素γ+脂多糖诱导细胞24 h后加入白细胞介素4和AG-490诱导24 h。干扰素γ质量浓度为100 ng/mL，脂多糖质量浓度为100 ng/mL，白细胞介素4质量浓度为40 ng/mL，AG-490浓度为10 μmol/L。
1.4.2 细胞免疫荧光染色将RAW264.7细胞稀释成浓度为1×108 L-1的细胞悬浮液，接种于内置爬片的6孔板培养24 h，加入 100 ng/mL干扰素γ和100 ng/mL脂多糖诱导处理，再用40 ng/mL白细胞介素4和10 μmol/L AG-490 处理，分组同1.4.1(2)，干预结束后用0.3%Triton X-100处理10 min，5%BSA封闭3 min，抗CD206和诱导型一氧化氮合酶一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育2 h；100 μL DAPI染色5 min，晾干，抗荧光淬灭剂封固，倒置荧光显微镜采集图像。
1.4.3 ELISA检测取M0、M1和白细胞介素4 +M1组RAW264.7培养液，12 000 r/min离心，收集上清液，过滤。按照ELISA试剂盒说明书步骤测定细胞上清液中炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素10的分泌水平。

1.4.4 RT-qPCR检测收集各组RAW264.7细胞，使用Trizol裂解液从各组细胞中提取总RNA并合成cDNA。使用SYBR Green染料法进行qPCR分析。最后，使用GAPDH作为内参基因对qPCR反应进行标准化，采用2 -ΔΔCt法计算NLRP3、Caspase-1和白细胞介素1β的表达。引物序列见表1。

1.4.5 Western blot 检测各组RAW264.7细胞培养板中加入100 μL 蛋白裂解液，冰上裂解 30 min，然后在4 ℃离心机上以12 000 r/min速度离心10 min后收集上清，-80 ℃保存，测定蛋白浓度，制胶，10 μL/孔上样，恒压电泳，甲醇活化PVDF 膜1 min，按滤纸(正极)-PVDF膜-凝胶-滤纸(负极)的顺序，放入电转槽电转，恒流200 mA，2 h；5%BSA封闭1 h，一抗[JAK1、STAT6抗体(1∶500)；p-JAK1抗体、p-STAT6抗体、NLRP3抗体、pro-IL-1β/IL-1F2抗体、pro-Caspase-1抗体(1∶1 000)]，4 ℃孵育过夜，二抗孵育1 h。化学发光仪曝光，保存蛋白条带，并用Image J定量分析软件系统测量结果。
1.4.6 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定
(1) SD大鼠麻醉后脱颈处死，剥离胫骨和腓骨，PBS冲洗骨髓腔，收集骨髓液，用含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的DMEM/F12培养基培养，原代细胞培养48 h后半量换液，之后每隔2 d全量换液1次，细胞生长融合至80%-90%时，按照1∶2传代，取第3代细胞用于后续实验，成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色，14 d后进行茜素红染色，成脂诱导14 d后进行油红O染色进行鉴定。
(2)碱性磷酸酶染色：将骨髓间充质干细胞以每孔1×105细胞密度接种于12孔板，使用DMEM/F12培养基培养至70%融合度，更换为成骨诱导培养液，每2 d更换1次成骨诱导分化培养基，共诱导7 d。将细胞用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗2遍，按碱性磷酸酶染色试剂盒配置工作液，室温染色5 min，PBS冲洗3遍，倒置相差显微镜观察采集图像。
(3)茜素红染色：将骨髓间充质干细胞以每孔1×105 细胞密度接种于12孔板，使用DMEM/F12培养基培养至70%融合度，更换为成骨诱导培养液，每3 d更换1次成骨诱导分化培养基，共诱导14 d。将细胞用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗2 遍，换成茜素红染液室温染色5 min，PBS 冲洗3遍，倒置相差显微镜观察采集图像。
(4)油红O染色：将骨髓间充质干细胞以每孔1×105 细胞密度接种于12孔板，使用DMEM/F12培养基培养至70%融合度，更换为成脂诱导培养液，每2 d更换1次成脂诱导分化培养基，共诱导7 d。将细胞用40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗2 遍，换成油红O溶液室温染色5 min，PBS 冲洗3遍，倒置相差显微镜观察采集图像。

1.4.7 不同极化亚组RAW264.7与骨髓间充质干细胞共培养将1×107 L-1 RAW264.7细胞悬液500 μL接种于transwell小室上室(DMEM高糖培养基)，1×108 L-1骨髓间充质干细胞悬液1.5 mL接种于12孔板内(DMEM/F12培养基)，两部分分别培养过夜后，在上室中添加极化诱导物，分组同1.4.1(2)，再将接种有RAW264.7细胞小室转移至接种有骨髓间充质干细胞的12孔板上，于孵箱内共培养24 h，以无RAW264.7细胞共培养条件的骨髓间充质干细胞作为对照组。共培养24 h后取出上室，PBS冲洗12孔板下室后进行成骨诱导及成脂诱导，方法同1.4.6，收集骨髓间充质干细胞，采用RT-qPCR方法进行成骨标记基因检测，方法同1.4.4，引物序列见表2。

1.5 主要观察指标 ①干扰素γ和脂多糖、白细胞介素4干预对巨噬细胞表型及炎症因子分泌水平的影响；②白细胞介素4是否通过激活JAK1/STAT6通路促进M1样巨噬细胞转化为M2样巨噬细胞；③白细胞介素4干预对NLRP3炎性小体的影响；④大鼠骨髓间充质干细胞染色鉴定结果；⑤不同分组RAW264.7细胞对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
1.6 统计学分析每组实验独立重复 3 次，所得数据以x±s表示。采用 GraphPad Prism 8.0 软件对结果数据进行统计学分析，分别使用Shapiro-Wilk 检验和 Brown-Forsythe 检验验证数据的正态性和方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey 检验，以双侧P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

鉴于骨缺损后骨植入物的整合困难，骨免疫学已成为组织工程领域的一个重要研究热点。事实上，骨再生的本质是一种特殊类型的异物反应，它包括一系列驻留细胞/因子的反应。不同表型的巨噬细胞对炎症反应的作用大不相同，M1型巨噬细胞可通过多种机制促进骨吸收的发生，包括促炎因子的分泌、作为破骨细胞的储存库等[14]。然而，M2型巨噬细胞能够调控骨代谢、血管重建和组织修复[6]。前期研究表明，骨替代材料植入后的骨改建过程与组织损伤的标准反应相似[13]，只是骨再生期延迟，主导表型从M1巨噬细胞向M2型巨噬细胞转变。因此，M2型巨噬细胞的及时有序极化对于骨整合的成功是必不可少的。
巨噬细胞主要通过表面标志物来区分，M1亚型在细胞表面表达肿瘤坏死因子α产生抗炎反应[14]；不同的M2表型主要根据表面的细胞激活生物标志物分为M2a(CD206、CD209和CD33)、M2b(CD64)和M2c(CD163)亚型[15-17]。白细胞介素4的给药加速了M2a的极化，伴随着生长因子和抗炎细胞因子的产生[18]，因此，参与该研究过程的主要细胞亚型可能是具有M2a表型的巨噬细胞，所以选择表面标记CD206作为M2样巨噬细胞的代表性标记。
JAK-STAT通路参与巨噬细胞的激活并调节骨骼系统疾病，如骨缺损、骨关节炎和骨质疏松症等[9，19]。白细胞介素4是白细胞介素4受体的配体，是由激活的T细胞分泌的免疫系统中的一种多功能细胞因子[20]。白细胞介素4经由白细胞介素4受体(白细胞介素4受体1与白细胞介素4受体2)结合来激活JAK的磷酸化，活化的JAK进一步磷酸化STAT6，使其进入细胞核，对巨噬细胞向M2极化施以调节[21]。该研究旨在验证JAK1/STAT6通路是否参与了白细胞介素4促进M1样巨噬细胞活化为M2样巨噬细胞以及骨髓间充质干细胞的成骨分化。首先，用免疫荧光法检测了不同分组RAW264.7细胞的M1/M2标志物，用Western blot检测了JAK1/STAT6的蛋白水平。与干扰素γ+脂多糖组相比，白细胞介素4降低了M1标志物的相对强度，增加了M2标志物的相对强度；AG-490抑制M2标志物的上调，促进M1标志物的上调；与干扰素γ+脂多糖组相比，采用白细胞介素4干预M1巨噬细胞后，诱导型一氧化氮合酶阳性细胞明显减少，CD206阳性细胞显著增加。酶联免疫吸附实验检测结果显示白细胞介素4干预可以减少肿瘤坏死因子α的分泌，并使抗炎细胞因子白细胞介素10的分泌水平升高，从而在抗炎信号转导中发挥有益的作用。由此体外实验证明了白细胞介素4可以促进M2样巨噬细胞活化而抑制M1样巨噬细胞。JAK/STAT通路抑制剂AG-490是一种酪氨酸激酶的小分子抑制剂，不仅能够抑制JAKs酪氨酸的磷酸化，还能够抑制STATs的磷酸化过程[22-23]。在给予通路阻断剂AG-490处理后，观察到白细胞介素4对M2巨噬细胞的促进作用减弱。同时，通过Western blot实验检测了JAK1和STAT6通路蛋白(p-JAK1、JAK1、p-STAT6和STAT6)的表达水平，分析结果可知，白细胞介素4+M1组p-JAK1和p-STAT6蛋白表达相对于M0组和M1组有上升；与白细胞介素4+M1组相比，白细胞介素4+AG+M1组p-JAK1/JAK1和p-STAT6/STAT6比值显著下降。因此提示，JAK1/STAT6 通路可能介导了白细胞介素4促进 M1样巨噬细胞向M2样巨噬细胞的极化过程。
该研究还发现白细胞介素4能明显抑制NLRP3、白细胞介素1β和Caspase-1的mRNA表达。NLRP3炎症小体是由NOD样受体、凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1组成的多蛋白复合体，控制着Caspase-1的活性和天然免疫系统中炎症细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素18的成熟和分泌，介导炎症，并诱导细胞焦亡[24]。在骨质疏松症中，NLRP3炎症小体不仅通过其下游炎症因子白细胞介素1β和白细胞介素18扩大炎症反应促进破骨细胞分化，而且抑制成骨相关蛋白或转录因子的表达，这就说明激活的NLRP3炎症小体不仅会加速骨吸收，而且还抑制骨形成。一项已发表的研究表明，NLRP3炎症小体在M1巨噬细胞中上调，并可能通过产生白细胞介素1β来调节炎症过程[25]。该研究观察到NLRP3炎症小体被激活，参与了促炎反应。此外，与M0细胞相比，M1巨噬细胞中NLRP3、Caspase-1和白细胞介素1β的表达显著上调。但是Western blot结果显示，巨噬细胞中只有NLRP3蛋白与mRNA的表达水平一致，而对pro-IL-1β和pro-caspase-1无明显影响，这一结果与巨噬细胞需要2个信号来激活炎症体的假设相一致。脂多糖诱导白细胞介素1β和NLRP3的mRNA表达，而第2个信号则诱导pro-caspase-1的自溶裂解[26]。因此作者推测，白细胞介素4可能通过诱导JAK1/STAT6活化促进M2样巨噬细胞交替极化，其激活和磷酸化JAK1/STAT6可以抑制NLRP3的激活。
骨髓间充质干细胞的成骨分化受巨噬细胞分泌炎症因子所形成的炎症微环境影响。众所周知，M1巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α抑制骨髓间充质干细胞成骨分化[27]，而M2巨噬细胞分泌的因子参与促进体外成骨和后期的血管生成，同时释放的细胞因子包括骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子和转化生长因子β1[28]。目前的研究表明白细胞介素4在体外能促进M2样巨噬细胞的交替极化而刺激骨髓间充质干细胞成为成熟的成骨细胞，并增加骨矿化，而M1巨噬细胞明显抑制成骨分化，这些结果似乎与那些观察到的用M1巨噬细胞可以诱导成骨作用增强的结果相矛盾[29-30]，这可能是因为在这些使用直接共培养系统的研究中忽略了骨髓间充质干细胞和巨噬细胞之间的动态双向细胞相互作用，毕竟骨髓间充质干细胞也可以促进巨噬细胞向M2表型分化[31-32]。此外，该研究还显示加入AG490后可以阻断白细胞介素4的作用，导致M1样巨噬细胞不能极化为M2样巨噬细胞，从而影响成骨分化，这表明白细胞介素4促进骨髓间充质干细胞的成骨分化是通过调节M2样巨噬细胞实现的，但潜在的通路串扰还需要在后续的实验中进一步验证。总之，炎症因子和干细胞之间必须存在相互作用，从而改变巨噬细胞的极化，以此作为促进干细胞成骨的有效途径，这些发现可能揭示骨再生的另一个治疗靶点。
综上所述，巨噬细胞的炎症表型及分泌水平直接或间接影响成骨的过程，为了确定免疫反应和骨再生之间的平衡，采取安全、简单而有效的具有特定生物特性的免疫调节因子是不可或缺的。白细胞介素4能够提高M2样巨噬细胞的抗炎反应，增加M2样标记细胞及抗炎因子的生成，这可能是通过促进 JAK1/STAT6信号通路及抑制NLRP3活化实现的。白细胞介素4促进M2样巨噬细胞的活化作用是显而易见的，目前国内外的研究报道了白细胞介素4与JAK1/STAT及白细胞介素4与NLRP3之间的联系，然而三者之间的具体联系以及作用机制尚不清晰，该实验证实了JAK1/STAT6与NLRP3之间的负反馈调节作用，为进一步研究骨组织工程中白细胞介素4与JAK1/STAT6/NLRP3信号通路参与M2样巨噬细胞极化的具体作用机制提供了新的思路。未来的研究重点将聚焦于沉默NLRP3或过表达JAK1、STAT6、NLRP3基因时白细胞介素4对M2样巨噬细胞的作用及骨髓间充质干细胞的成骨效应进行验证，也需要进一步探究该通路上游与下游基因之间的关系。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

白细胞介素4调控巨噬细胞极化及骨髓间充质干细胞的成骨分化

Interleukin-4 regulates macrophage polarization and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[2]	王伟庆, 周越. 慢性炎症调控脂肪组织的纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1307-1312.
[3]	王雯, 郑芃芃, 孟浩浩, 刘浩, 袁长永. 过表达Sema3A促进牙髓干细胞和MC3T3-E1的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 993-999.
[4]	曾凡卓, 李雨欣, 孙嘉晨, 谷欣阳, 文山, 田鹤, 梅晰凡. 脊髓损伤模型小胶质细胞的高效移植替换策略[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1007-1014.
[5]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[6]	杨雨晴, 陈志宇. 早期短暂M1巨噬细胞在骨组织工程中的作用及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 594-601.
[7]	李斯锦, 冯骁腾, 王怡茹, 秦合伟, 刘萍. 巨噬细胞特异性启动子SP146-C1增强血管内皮生长因子C在动脉粥样硬化小鼠中的表达#br#[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4202-4208.
[8]	赵广建, 刘大男, 周博, 王尧. Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5抑制巨噬细胞焦亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4005-4012.
[9]	韩月, 王雨菲, 刘婉晴, 董明, 牛卫东. 淫羊藿苷在炎症环境下对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3709-3714.
[10]	葛叡扬, 倪璨, 杨琨, 闫福华. 巨噬细胞极化在牙周炎发病及治疗中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3246-3251.
[11]	王增顺, 索南昂秀, 刘立民, 周京元. miR-155/瘦素受体/AMPK轴在结核菌素诱导破骨细胞形成中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3190-3195.
[12]	孟志成, 乔卫平, 赵阳, 刘洪飞, 李凯杰, 马博. 免疫细胞及相关细胞因子在骨关节炎发病及治疗中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 280-287.
[13]	宋悦, 舒晴, 贾绍辉, 田峻. 光生物调节诱导间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3069-3075.
[14]	苟秋童, 罗文豪, 王频, 兰玉燕, 刘敏, 黄海霞. 黄连素在高糖环境下促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 2974-2980.
[15]	谢婷, 刘婷婷, 曾雪慧, 李亚敏, 周庞虎, 易念华. 维生素D3减轻高糖暴露诱导氧化应激促进人脐带间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 2981-2987.