低温冷凝沉积法3D打印骨组织工程左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架

doi:10.12307/2024.474

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (17): 2702-2707.doi: 10.12307/2024.474

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

低温冷凝沉积法3D打印骨组织工程左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架

刚芳莉1，石瑞1，马春阳2，肖一1

1忻州师范学院生物系，山西省忻州市 034000；2北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京市 100083

收稿日期:2023-07-21 接受日期:2023-09-02 出版日期:2024-06-18 发布日期:2023-12-15
通讯作者: 刚芳莉，博士，讲师，忻州师范学院生物系，山西省忻州市 034000
作者简介:刚芳莉，女，1990年生，甘肃省陇南市人，汉族，博士，讲师，主要从事生物医用材料方面的研究。
基金资助:
山西省基础研究计划青年科学研究项目(20210302124286)，项目负责人：刚芳莉；清华大学先进材料教育部重点实验室开放课题(ADV21-16)，项目负责人：刚芳莉；忻州市科技计划应用基础研究计划(20220505)，项目负责人：石瑞

Low-temperature condensation deposition method for 3D printing of bone tissue engineering poly-L-lactic acid/pearl powder composite scaffold

Gang Fangli1, Shi Rui1, Ma Chunyang2, Xiao Yi1

1Department of Biology, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, Shanxi Province, China; 2School of Biological and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100083, China

Received:2023-07-21 Accepted:2023-09-02 Online:2024-06-18 Published:2023-12-15
Contact: Gang Fangli, PhD, Lecturer, Department of Biology, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, Shanxi Province, China
About author:Gang Fangli, PhD, Lecturer, Department of Biology, Xinzhou Teachers University, Xinzhou 034000, Shanxi Province, China
Supported by:
Shanxi Applied Basic Research Project for Youth Science Research, No. 20210302124286 (to GFL); Fund of Key Laboratory of Advanced Materials of Ministry of Education, No. ADV21-16 (to GFL); Xinzhou Basic Science and Technology Research Project, No. 20220505 (to SR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

低温冷凝沉积法：在3D打印过程中，将材料溶于特定溶剂中制成墨水，接收台温度降低到墨水凝固点以下，墨水从喷嘴中挤出，在接收台上逐层沉积并在短时间内冷凝成型。然后通过其他途径(如冷冻干燥)将墨水中的溶剂除去，使其能够在常温环境中固定成型并最终形成所需支架而建立起来的一种方法。
左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架：组织工程是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。支架作为组织工程三要素之一能满足细胞贴附、成长以及分化需求并最终形成新生组织。左旋聚乳酸凭借其优异的力学性能和生物相容性被广泛用作支架基体材料。在基体材料中复合功能颗粒(如珍珠粉等)可制备具有特定功能(如促进成骨分化)的复合支架用于组织修复。

背景：大面积骨缺损的修复目前仍面临严峻挑战，研发可个性化定制、低成本且具有成骨诱导活性的组织工程支架用于骨修复意义深远。

目的：探索低温冷凝沉积法实现3D打印含珍珠复合材料骨组织工程支架的工艺流程，并进一步测试该复合支架的理化性能和体外生物学功能。
方法：采用研磨过筛法制备珍珠粉，将不同质量的珍珠粉加入左旋聚乳酸墨水中，使珍珠粉与左旋聚乳酸的质量比分别为0，0.1，0.2，0.3，0.5，采用低温冷凝沉积法3D打印左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架。检测支架的微观形貌、抗压性能、水接触角、细胞相容性以及体外促成骨分化能力。

结果与结论：①扫描电镜显示5组支架均有直径2 μm甚至更小的微孔，形状不规则且相互连通；②5组支架均具有良好的抗压性能，其中珍珠粉0.5组支架的压缩强度高于其他4组支架(P < 0.05)，珍珠粉0.2组、珍珠粉0.5组的水接触角小于珍珠粉0组(P < 0.01，P < 0.001)；③将骨髓间充质干细胞分别与5组支架共培养1，3，5 d，珍珠粉0.1组、珍珠粉0.2组、珍珠粉0.3组、珍珠粉0.5组培养3，5 d的细胞增殖均快于珍珠粉0组(P < 0.05)；培养1 d的活死染色显示，各组支架上的细胞数量较少，但均为活细胞；④将骨髓间充质干细胞分别接种至珍珠粉0组、珍珠粉0.1组支架表面进行成骨诱导分化，珍珠粉0.1组诱导4，6 d的碱性磷酸酶活性高于珍珠粉0组(P < 0.05)；⑤结果表明，左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架具有良好的抗压强度、亲水性、细胞相容性与促成骨性能。

https://orcid.org/0000-0002-1507-2539(刚芳莉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 低温冷凝沉积法, 3D打印, 左旋聚乳酸, 珍珠粉, 复合支架, 骨组织修复, 细胞相容性, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: The repair of large-scale bone defects is still facing serious challenges. It is of great significance to develop personalized, low-cost, and osteogenic-inducing tissue engineering scaffolds for bone repair.
OBJECTIVE: To explore the process of 3D printing bone tissue engineering scaffold containing pearl composite material by low-temperature condensation deposition method, and further test the physicochemical properties and in vitro biological functions of the composite scaffold.
METHODS: Pearl powder was prepared by grinding and sieving. The pearl powder of different qualities was added into the poly-L-lactic acid ink, so that the mass ratio of pearl powder to poly-L-lactic acid was 0, 0.1, 0.2, 0.3, and 0.5, respectively. The 3D-printed poly-L-lactic acid/pearl powder scaffolds were prepared using the low-temperature condensation deposition method. The microstructure, compressive properties, water contact angle, cytocompatibility, and in vitro bone differentiation ability of the printed poly-L-lactic acid/pearl powder composite scaffolds were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that the five groups of scaffolds all had micropores with a diameter of 2 μm or even smaller, irregular shapes and interconnectivity. (2) All the five groups had good compressive properties. The compressive strength of the pearl powder 0.5 group was higher than that of the other four groups (P < 0.05). The water contact angle of the pearl powder 0.2 group and the pearl powder 0.5 group was smaller than that of the pearl powder 0 group (P < 0.01, P < 0.001). (3) Bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with five groups of scaffolds for 1, 3, and 5 days, respectively. The cell proliferation in pearl powder 0.1, 0.2, 0.3, and 0.5 groups cultured for 3 and 5 days was faster than that in pearl powder 0 group (P < 0.05). After 1 day of culture, live-dead staining exhibited that the number of cells on the scaffold was small, but all of them were living cells. (4) Bone marrow mesenchymal stem cells were inoculated on the scaffold surface of the pearl powder 0 group and pearl powder 0.1 group respectively for osteogenic differentiation. The alkaline phosphatase activity induced for 4 and 6 days in the pearl powder 0.1 group was higher than that in the pearl powder 0 group (P < 0.05). (5) The results showed that the poly-L-lactic acid/pearl powder composite scaffold had good compressive strength, hydrophilicity, cytocompatibility, and osteogenic properties.

Key words: low-temperature condensation deposition method, 3D printing, poly-L-lactic acid, pearl powder, composite scaffold, bone tissue repair, cytocompatibility, osteogenic differentiation

中图分类号:

刚芳莉, 石瑞, 马春阳, 肖一. 低温冷凝沉积法3D打印骨组织工程左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(17): 2702-2707.

Gang Fangli, Shi Rui, Ma Chunyang, Xiao Yi. Low-temperature condensation deposition method for 3D printing of bone tissue engineering poly-L-lactic acid/pearl powder composite scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(17): 2702-2707.

图/表（结果） 6

2.1 珍珠粉的制备及表征左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架制备流程如图1所示。

将珍珠研磨成粉与左旋聚乳酸一起溶于1，4-二氧六环制备墨水，在此基础上探索左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的低温冷凝3D打印工艺。首先，对研磨过筛法得到的珍珠粉进行矿物学表征。从图2A可以看到，过筛后的珍珠粉粒径绝大部分分布在400-600 nm之间。扫描电镜图像显示(图2B)，制备的珍珠粉颗粒尺寸大小不一，存在少许直径100 μm左右的大颗粒，将图像进一步放大，可以看到较完整的珍珠粉呈片状，部分颗粒直径在2 μm以上，也有一部分粉末状的颗粒直径在1 μm以下，处于纳米级。为了明确所制备珍珠粉中的矿物成分，分别对粉晶进行X射线衍射和红外光谱表征。通过与球文石、文石标准样品的X射线衍射图谱对比(图2C、D)，发现珍珠粉中004、110、112的峰位与标准球文石对应，111、021、012的峰位与标准文石相对应，表明该珍珠粉中的主要矿物成分包括球文石和文石，主要化学成分是CaCO3。此外，张刚生等[29]的研究曾指出，生物成因文石的面外弯曲振动频率范围在862-865.1 cm-1处，而无机成因文石的频率振动明显小于生物成因文石，在852.17-858 cm-1之间。文中珍珠粉的红外测试结果显示(图2E)，该特征吸收峰对应振动频率为864.07 cm-1，因此判断其为生物成因文石。

2.2 左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的3D打印配制了5种不同比例(m珍珠粉/m左旋聚乳酸+珍珠粉=0，0.1，0.2，0.3，0.5)的左旋聚乳酸/珍珠粉墨水，并通过黏度和剪切流变学性能进行测试来确定复合支架的3D打印工艺。由于左旋聚乳酸在1，4-二氧六环中的溶解度较低，所以需要将左旋聚乳酸研磨成粉，并在加热(不超过50 ℃)和不断搅拌的情况下制备墨水。如图3所示，所有墨水的黏度都随着剪切速率的增加呈现出短暂的上升再大幅度下降的趋势，即在低剪切速率下存在剪切增稠现象。因此，鉴于左旋聚乳酸基复合墨水的这种特性，在打印时采用了高压气动推进结合喷嘴高速移动的策略，以避开具有剪切增稠现象的低剪切速率范围，并调整接收温度以使支架能够正常冷凝成型。在实际打印过程中，墨水从喷嘴中挤出后黏到低温的接收台上，会形成一个未冷冻结晶到逐渐冷冻再到完全冷冻结晶并固定形状的过程，但是在这个过程中喷嘴移动速度过快或者料筒内气压值过大都会导致墨水还未完全冷冻凝固而结构坍塌，反之则会导致墨水被冷冻结晶至喷嘴处形成堵塞。因此，墨水黏度、料筒内气压值和喷嘴的移动速度必须相互匹配才能保证良好的三维支架形貌。除此之外，接收台的温度也会影响打印效果。温度过低会导致墨水迅速冷凝而发生变形，温度过高墨水又无法快速成型。经过多次实验发现铝片接收台的温度设置为-2 ℃至-3 ℃最适合左旋聚乳酸基材料的打印。

在不同墨水流变学性能测试中发现，随着珍珠粉含量的增加，墨水黏度先略有上升然后下降。这可能是少量珍珠粉的加入会增加墨水黏度，但是材料总浓度不变的情况下珍珠粉的含量增加则左旋聚乳酸含量减少，而墨水的黏度主要依靠左旋聚乳酸提供，所以墨水的黏度会下降。这样的墨水制备策略能够保持最终形成的支架质量不变，但是由于左旋聚乳酸含量的下降会导致墨水黏度明显降低。墨水黏度过低不利于3D打印的进行，因此在实际的墨水制备时应保持左旋聚乳酸含量不变，只改变珍珠粉的含量。该文后续实验所用墨水均以保持左旋聚乳酸含量不变为原则制备，而且在保持喷嘴直径、气压以及喷嘴移速一定的情况下这几种支架打印效果不受黏度变化的影响。
2.3 左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的材料学表征由于该多孔支架在受力时会被压扁而不出现断裂，因此该文将支架被压到原来高度1/2处时所承受的压强作为其压缩强度。结果显示5组支架都表现出了高抗压性能(> 100 MPa)，尤其是珍珠粉0.5组支架的压缩强度高达332.6 MPa，与其他组支架相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4A。
亲水性测试显示，左旋聚乳酸支架中掺杂珍珠粉的含量对其亲水性影响不呈比例(图4B、C)。珍珠粉具有良好的亲水性，在高温熔融法打印的支架中有效提高了支架的亲水性[29]，出现这种情况的原因可能是低温冷凝法打印的支架中珍珠粉被左旋聚乳酸包裹而难以与水接触，因而对支架整体的亲水性影响并不规律。

通过扫描电镜观察左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的内外部形貌(图5)。从宏观照片中可以看到三维支架(2 cm×2 cm)的纤维笔直，孔隙大小均一且清晰可见。除了3D打印人为设定的孔隙外，所有支架都观察到了直径2 μm甚至更小的微孔，这些微孔大小不一，形状不规则且相互连通。这些微孔都是在冷冻干燥的过程中溶剂挥发形成的，各组之间的微孔结构没有明显差异。

2.4 左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的细胞相容性如图6A所示，5种支架上的细胞数目都随着培养时间的增加而显著增加，接种细胞后第1天，珍珠粉0.2组、珍珠粉0.3组和珍珠粉0.5组支架上的细胞数量明显多于珍珠粉0组；接种细胞后第3，5天，各组细胞开始快速增殖，珍珠粉0.1组、珍珠粉0.2组、珍珠粉0.3组、珍珠粉0.5组培养3，5 d的细胞增殖均快于珍珠粉0组(P < 0.05)。
支架上的细胞染色结果也进一步证实了材料良好的细胞相容性(图6B)。在细胞培养1 d后，5组支架上的细胞数量较少，但绝大部分为典型的绿色活细胞影像，红色死细胞很少。这可能归因于左旋聚乳酸疏水的特性导致黏附早期存留在支架纤维上的细胞量较少，这些细胞多沿着相互交叉的支架纤维的走行而轴向分布，少部分细胞也会聚集在支架孔隙内。
2.5 左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的促成骨能力考虑到珍珠粉复合支架的促成骨分化性能已经被多篇论文所证实[30-32]，此处仅以珍珠粉含量最少(m珍珠粉/m左旋聚乳酸=0.1)的三维支架与纯左旋聚乳酸支架，测定其成骨早期指标碱性磷酸酶活性作辅助验证。如图6C所示，成骨诱导4，6 d后，与珍珠粉0组相比，珍珠粉0.1组碱性磷酸酶活性显著升高(P < 0.05)。

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引言

骨在人类的生命活动中起到关键支撑作用，然而创伤性骨折、骨质疏松等原因都会造成不同程度的骨损伤或缺失[1]。尽管高度血管化的骨组织具有一定的再生能力，但是超过临界阈值(> 2 cm)的骨缺损要想实现完全愈合和功能恢复，通常需要进行临床干预[2]。在诸多治疗大面积骨缺损的方法中，自体骨移植是“金标准”，然而自体骨移植常常因为给患者带来二次伤害而难以在临床上推广[3-5]。异体骨移植则存在可能引发排异反应或传播疾病等风险[6-7]。
骨组织工程的出现为大面积骨缺损修复提供了新思路[8-10]。骨是一种天然的纳米复合材料，从仿生学角度看，复合支架在骨组织修复领域具有很大的应用潜力[11-14]。最常见的骨组织工程复合支架由有机基体材料和功能颗粒组合而成[15]，其中基体材料主要提供基础的力学性能和结构支撑，而复合颗粒的作用是赋予支架特定功能以促进骨缺损的再生。通过美国食品药品监督管理局批准的左旋聚乳酸，凭借其优异的机械性能和生物相容性被广泛用作支架基体材料[16-18]。珍珠作为一种常见的天然生物矿物来源广泛、价格低廉、生物物理性质优越，并且具有潜在的促成骨和促血管生成能力，是理想的候选复合颗粒[19-20]。因此，左旋聚乳酸/珍珠粉构建的复合支架是良好的骨组织工程候选材料。
3D打印技术是将材料推向临床应用的重要环节，它可以根据实际需求个性化定制骨组织工程支架，包括宏观外形、内部孔隙和纳、微观结构[21-24]。已经有多种3D打印技术用来构建三维生物矿物复合支架，包括选择性烧结[25]、熔融沉积打印及直接浆料挤压等[26-27]，其中高温熔融沉积的3D打印方法已被成功应用于含珍珠粉复合材料支架的制备，并取得了良好的促骨再生效果[28]。相对来说，低温冷凝成型的3D打印方法操作简单，并且因其往往与冷冻干燥法结合，更容易形成有利于骨组织长入的多级孔隙结构。然而，使用低温冷凝的3D打印方法制备珍珠粉复合支架的研究因制备工艺不够成熟，因此针对该制备工艺的研究还需进一步探索。
考虑到左旋聚乳酸可溶于1，4-二氧六环，且溶剂在真空环境下能够快速挥发，该文提出将珍珠粉和左旋聚乳酸溶于1，4-二氧六环中制备成墨水，经3D打印在低温接收板上冷凝成型。然后采用冻干法除去溶剂，左旋聚乳酸析出后会形成复合了珍珠粉的三维多孔支架，以此来探索左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的低温冷凝3D打印工艺。同时进一步研究不同支架的表观形貌、孔隙率、机械性能和细胞相容性等性能，以评估低温冷凝3D打印策略制备的左旋聚乳酸/珍珠粉复合材料用作骨组织工程支架的可行性，为新型骨组织工程支架提供新的选择。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料的3D打印、性能表征及体外细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020年3月至2023年6月在清华大学材料学院及忻州师范学院生物系完成。
1.3 材料珍珠(北京诚聚德生物技术有限公司)；左旋聚乳酸(黏度2.4 dl/g，分子质量339 000 g/mol，北京聚德安泰)；1，4-二氧六环(国药，AR)；CCK-8试剂盒(日本同仁)；大鼠骨髓间充质干细胞(P5，Cyagen，美国)；碱性磷酸酶活性试剂盒(Sigma Aldrich，美国)；α-MEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，澳大利亚)；钙黄绿素AM、碘化丙啶(Invitrogen，美国)；粉磨机(北京科伟永兴仪器有限公司，中国)；扫描电镜(日立S-450，日本)；粒度分析仪(Malvern仪器有限公司)；X射线衍射仪(D/max-2550，日本理学公司)；傅里叶变换红外光谱仪(Innovate T5，杰博电器科技)；流变仪(Kinexus，英国)；万能试验机(岛津)；3D生物打印机(GeSim Biosaffold 3.2，德国)；激光共聚焦显微镜(TCS SP5，德国)；光学表面张力计(JC2000C1，Powereach，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 珍珠粉的制备及表征采用研磨过筛法制备珍珠粉。首先将珍珠用去离子水清洗干净并晾干，加入粉磨机内研磨成粉末。然后使用孔径150 μm的筛子过筛，收集过筛后的珍珠粉末用于后续实验。取少量制备的珍珠粉粘贴在导电胶上，喷金，通过扫描电镜观察珍珠粉的形貌特征，加速电压15 kV。将珍珠粉末交予清华大学材料学院中心实验室，使用激光粒径分析仪、X射线衍射仪和傅里叶变换红外光谱仪进行矿物学表征。
1.4.2 左旋聚乳酸/珍珠粉墨水的制备及流变特性测试配制5种不同比例(m珍珠粉/m左旋聚乳酸+珍珠粉=0，0.1，0.2，0.3，0.5)的墨水，其中左旋聚乳酸和珍珠粉的总质量为1.5 g保持不变。按比例将珍珠粉加入1，4-二氧六环(10 mL)中，通过细胞粉碎仪振荡20 min使其均匀分散。然后，加入对应质量的左旋聚乳酸粉末搅拌至完全溶解，超声除去气泡。使用流变仪对墨水的黏度和剪切流变学性能进行表征，剪切速度范围为10-1–102 rad/s，以此确定复合支架的3D打印工艺。
在上部分实验的基础上优化墨水成分，重新配制5种不同比例(m珍珠粉/m左旋聚乳酸 = 0，0.1，0.2，0.3，0.5)的墨水，其中左旋聚乳酸的质量不变，为1.5 g。按特定比例将珍珠粉加入1，4-二氧六环(10 mL)中，通过细胞粉碎仪振荡20 min使其均匀分散。然后，加入对应质量的左旋聚乳酸粉末搅拌至完全溶解，超声除去气泡即可用于打印。
1.4.3 左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的3D打印及性能测试左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的3D打印遵循气动挤出→低温冷凝接收→冷冻干燥成型的流程。具体来说，预先将3D Builder软件绘制的三维图像导入到Gesim Robotics软件，选择合适的打印参数并开始打印。打印参数如下：墨水由(100±10) MPa气压推动，通过直径0.26 mm的喷嘴挤出，喷嘴以(5±1) mm/s的速度移动，支架纤维之间的间隔为0.8 mm，接收台是温度为-2至-3 ℃的铝片。实际打印参数可依据打印机性能以及周围环境适当调整。
通过扫描电镜观察不同倍数下三维复合支架的内部形貌。采用万能试验机对支架(10 mm×10 mm×2 mm)的压缩性能进行表征，压缩速率为1 mm/min。压缩强度被定义为支架压缩至50%高度时所受的力。使用光学表面张力计测量支架材料所制备薄膜的水接触角。选取膜中较为平坦的区域，转动仪器蠕动泵的旋钮，将一滴10 μL左右的水滴在膜表面，调整角度拍摄静态水滴照片。定量分析数据通过使用量角器直接测定法测量水滴两侧角度得到。
1.4.4 左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的细胞相容性接种细胞前，将5组支架经去离子水浸泡48 h，体积分数75%乙醇消毒24 h，再置于α-MEM培养基中浸泡72 h，并每天更换培养基。
将处理好的支架(5 mm×5 mm×2 mm)转移至96孔板，每孔接种8×103个大鼠骨髓间充质干细胞，每组样品3个平行。待细胞贴壁4-6 h后，将支架转移到新的96孔板内，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养1，3，5 d，最后采用CCK-8法测定支架的细胞相容性。共培养1 d后，通过共聚焦显微镜观察经钙黄绿素AM和碘化丙啶染色后的细胞结果。
1.4.5 左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的促成骨分化能力接种细胞前，将珍珠粉0组、珍珠粉0.1组支架经去离子水浸泡48 h，体积分数75%乙醇消毒24 h，再置于α-MEM培养基中浸泡72 h，并每天更换培养基。
灭好菌的珍珠粉0组、珍珠粉0.1组支架转移至24孔板，每组样品3个平行。将大鼠骨髓间充质干细胞以5×104的细胞密度接种于支架表面。细胞贴壁6 h后，培养基换为成骨诱导培养基(含体积分数15%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%谷氨酰胺、100 µmol/mL抗坏血酸、2 mmol/L β-甘油磷酸盐、1.8 mmol/L磷酸二氢钾、10 nmol/L地塞米松的α-MEM)。诱导分化4，6 d后提取蛋白质，用Bradford比色法测定蛋白质浓度，根据碱性磷酸酶活性试剂盒说明在405 nm处测量碱性磷酸酶活性。碱性磷酸酶活性=碱性磷酸酶浓度/总蛋白浓度。
1.5 主要观察指标左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的微观形貌、抗压性能、水接触角、细胞相容性及体外促成骨分化能力。
1.6 统计学分析使用IBM SPSS Statistics 24软件进行数据分析。所有数据都表示为至少3个独立实验的平均标准偏差值。通过单因素方差分析(ANOVA)对数据进行分析，采用Tukey post-hoc检验确定两组间差异。该文统计学方法已经忻州师范学院学校生物统计学专家审核。

讨论

组织工程是近年来治疗骨缺损发展最为迅速的有效途径之一。左旋聚乳酸因具有良好的生物相容性等优点而被广泛应用于骨组织工程支架的制备。活性生物成分的加入可以显著提高左旋聚乳酸支架材料的骨组织修复能力，如生长因子等[33-34]，除此之外，珍珠、动物甲壳等生物矿物也已经被证明具有良好的生物相容性和促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力[19]。珍珠的主要成分是碳酸钙和有机蛋白，其中碳酸钙降解产生的高含量钙离子可以促进钙盐的沉积，抑制破骨细胞的骨吸收活性，促进骨再生。珍珠粉中含有的水溶性蛋白具有骨诱导作用，可促进成骨细胞的分化，增强成骨相关基因Runx2、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原mRNA的表达。通过将珍珠研磨成粉末掺杂到左旋聚乳酸基体里制备的左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架有潜力用于骨修复。然而，传统的支架制备方法通常难以同时实现支架的宏观外形和内部结构的个性化设计以满足不同患者的实际需求。3D打印技术的引入有效地解决了这一问题，尤其是高温熔融沉积3D打印已被成功地应用于含珍珠粉复合支架的制备，并取得了良好的促骨再生效果[28]。与之相比，操作温和简单、且易形成多级孔隙结构的低温冷凝沉积3D打印来制备左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的研究尚需进一步探索。
在此，该文提出将珍珠研磨成粉复合到左旋聚乳酸基体材料中，探索低温冷凝3D打印珍珠粉复合支架的工艺流程，并进一步评估该支架用于骨组织工程的潜力。考虑到珍珠粉是通过机械粉碎制备的，虽然经过了筛选，但仍然可能存在粒径分布不均匀等情况。因此，需对珍珠粉的粒径分布进行检测，结果证明制备得到的珍珠粉(粒径绝大部分分布在400-600 nm之间)能够轻易地从3D打印最常见的喷嘴(口径为260 μm)挤出，适用于一般的3D打印。扫描电镜图像显示仍然存在少许直径100 μm左右的珍珠粉，但是这些大颗粒在不发生聚集的情况下是不影响打印进行的。为防止颗粒聚集堵塞喷嘴，在配制墨水过程中需要确保珍珠粉分散良好，可采取添加分散剂或增加超声时间和功率等策略。
考虑到左旋聚乳酸溶于1，4-二氧六环后在-3 ℃时即可迅速冷冻成型，且溶剂在真空环境下能够快速挥发，该文选择使用低温冷凝接收结合冷冻干燥成型法制备左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架，进一步探索其3D打印工艺。墨水的黏度对3D打印工艺会产生较大的影响，因此对不同比例(m珍珠粉/m左旋聚乳酸+珍珠粉)的墨水进行黏度表征。流变学测试显示该墨水在低剪切速率下存在剪切增稠现象，这是左旋聚乳酸作为基体材料的共性，体现为墨水在流经喷嘴时流速最快，所受剪切应力也最大，被挤出后流速减慢，剪切应力也迅速减小。对于剪切增稠的材料来说，流经喷嘴时黏度高不利于材料的挤出，容易导致喷嘴堵塞，而挤出后剪切应力变小，黏度减小，最终导致材料不易成型，容易出现坍塌等不利情况。因此，结合该流变测试结果，该文在打印时采用了高压气动推进结合喷嘴高速移动的策略，以避开具有剪切增稠现象的低剪切速率范围，并调整接收温度以使支架能够正常冷凝成型。此外，由于左旋聚乳酸含量的变化对墨水黏度影响十分显著，因此在制备墨水是采用了保持左旋聚乳酸含量不变，只改变珍珠粉含量的策略。
已有文献证明高强度的支架不仅可以为受损骨组织提供一定的力学支撑，还能对干细胞的分化产生一定的促进作用[35-37]，因此该文进一步检测三维左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架的抗压性能。结果显示在高孔隙率的情况下，几种3D打印左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架仍然表现出了高抗压性能(> 100 MPa)。而且，这种同时具有人为设定的贯通孔和溶剂挥发形成的尺寸不一的多级微孔结构，有利于细胞的长入和贴附[38-40]。其中，贯通孔为细胞提供了迁移进入的通道，微孔增加了材料的表面积和粗糙度，为细胞的贴附提供了更好的条件。因此，通过气动挤出→低温冷凝接收→冷冻干燥成型法制备的三维左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架对细胞的长入、增殖以及物质交换等能够产生积极影响。
良好的细胞相容性和促成骨分化能力是生物材料用于骨组织修复的必要条件。体外细胞学实验表明，基于气动挤出→低温冷凝接收→冷冻干燥成型制备的三维左旋聚乳酸/珍珠粉复合材料均表现出良好的细胞相容性，能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖。而且，一定量珍珠粉的掺入可能增加了左旋聚乳酸支架的细胞亲和性。更重要的是，珍珠粉的加入可以提高左旋聚乳酸支架的促成骨分化趋势，表明该支架在骨组织修复领域具有极大潜力。
综上所述，该文通过研磨过筛法制备了尺寸从纳米到微米级均有分布的珍珠粉，再将其与高分子聚合物左旋聚乳酸复合，通过气动挤出、低温冷凝接收与冷冻干燥成型相结合的3D打印方法，构建了几种三维左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架。该支架表现出了高抗压性能(> 300 MPa)，多级孔隙结构、良好的细胞相容性和促成骨分化能力，为构建天然生物矿物复合的骨组织工程支架提供了基础数据和理论支撑。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

低温冷凝沉积法3D打印骨组织工程左旋聚乳酸/珍珠粉复合支架

Low-temperature condensation deposition method for 3D printing of bone tissue engineering poly-L-lactic acid/pearl powder composite scaffold

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