人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡

doi:10.12307/2021.134

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 4945-4949.doi: 10.12307/2021.134

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人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡

衣志爽1 ，王植海2，李明3，周清安1 ，杨保胜1

新乡医学院三全学院，1临床学院诊断学教研室，3生命科学系，河南省新乡市 453000；2新乡市第二人民医院神经外科，河南省新乡市 453002

收稿日期:2020-10-29 修回日期:2020-10-30 接受日期:2020-12-14 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 杨保胜，教授，新乡医学院三全学院临床学院诊断学教研室，河南省新乡市 453000
作者简介:衣志爽，女，1982年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2009年新乡医学院毕业，硕士，主治医师，讲师，主要从事儿科疾病诊疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82072802)，项目负责人：李明；新乡医学院三全学院科学研究培育基金(XJKT201922)，项目负责人：衣志爽

Exosomes from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells suppress the proliferation and promote the apoptosis of medulloblastoma Daoy cells

Yi Zhishuang1, Wang Zhihai2, Li Ming3, Zhou Qingan1, Yang Baosheng1

1Department of Diagnostics, Clinical College, Xinxiang Medical University Sanquan College, Xinxiang 453000, Henan Province, China; 2Department of Neurosurgery, Xinxiang Second People’s Hospital, Xinxiang 453002, Henan Province, China; 3Academy for Life Science, Xinxiang Medical University Sanquan College, Xinxiang 453000, Henan Province, China

Received:2020-10-29 Revised:2020-10-30 Accepted:2020-12-14 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Yang Baosheng, Professor, Department of Diagnostics, Clinical College, Xinxiang Medical University Sanquan College, Xinxiang 453000, Henan Province, China
About author:Yi Zhishuang, Master, Attending physician, Lecturer, Department of Diagnostics, Clinical College, Xinxiang Medical University Sanquan College, Xinxiang 453000, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82072802 (to LM); the Scientific Research Cultivation Fund of Xinxiang Medical University Sanquan College, No. XJKT201922 (to YZS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外泌体：是指含有复杂RNA和蛋白质，直径在40-100 nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

CFSE：是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色剂，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至2个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，用流式细胞仪在490 nm激发光处可对其进行分析。
背景：间充质干细胞能够产生大量的与其生物学功能相似的外泌体，但间充质干细胞来源外泌体对髓母细胞瘤Daoy细胞的影响仍不清楚。
目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖、凋亡的影响以及可能机制。
方法：分离、培养人脐带间充质干细胞，提取第4代人脐带间充质干细胞来源外泌体，Western blot检测外泌体标志蛋白CD9和CD81的表达。将人脐带间充质干细胞来源外泌体与Daoy细胞共培养96 h，采用流式细胞术、克隆形成实验检测Daoy细胞的增殖情况；流式细胞术检测Daoy细胞的凋亡情况；Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。
结果与结论：Western blot检测人脐带间充质干细胞来源外泌体CD9和CD81呈阳性表达。与对照组比较，人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制Daoy细胞增殖和克隆形成(P < 0.05，P < 0.01)；促进Daoy细胞凋亡(P < 0.01)；凋亡相关蛋白Cyclin D1和Bcl-2表达下调(P < 0.05)，Caspase-3表达上调(P < 0.01)。结果表明，人脐带间充质干细胞来源外泌体可能通过调节细胞周期以及凋亡相关蛋白表达来抑制髓母细胞瘤Daoy细胞的增殖，并促进其凋亡。
https://orcid.org/0000-0001-9359-0596(衣志爽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人脐带间充质干细胞, 外泌体, 髓母细胞瘤, Daoy细胞, 增殖, 凋亡, 蛋白

Abstract: BACKGROUND: Mesenchymal stem cells can produce a large number of exosomes, which has similar biological activity to mesenchymal stem cells. However, the effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on Daoy cells of medulloblastoma has yet to be determined.
OBJECTIVE: To investigate the effect of exosomes derived from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on the proliferation and apoptosis of medulloblastoma Daoy cells and its potential mechanism.
METHODS: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured. Passage 4 of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells was collected. The expression of exosome markers CD9 and CD81 was detected by western blot assay. Exosomes extracted from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cocultured with Daoy cells for 96 hours. The proliferation of Daoy cells was detected by flow cytometry and colony formation assay. The apoptosis of Daoy cells was detected by flow cytometry. The expression levels of apoptosis related proteins were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blot assay results showed that exosomes from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were positive for CD9 and CD81. Compared with the control group, exosomes from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells inhibited the proliferation of Daoy cells and the formation of colonies (P < 0.05, P < 0.01), and promoted Daoy cell apoptosis (P < 0.01). Apoptosis related proteins Cyclin D1 and Bcl-2 were down regulated (P < 0.05), but expression level of Caspase-3 was up-regulated (P < 0.01). The results confirm that human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells derived exosomes can suppress the proliferation of Daoy cells and promote its apoptosis possibly by regulating cell cycle and apoptosis related protein expression.

Key words: stem cells, human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, exosomes, medulloblastoma, Daoy cells, apoptosis, protein

中图分类号:

衣志爽, 王植海, 李明, 周清安, 杨保胜 . 人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4945-4949.

Yi Zhishuang, Wang Zhihai, Li Ming, Zhou Qingan, Yang Baosheng. Exosomes from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells suppress the proliferation and promote the apoptosis of medulloblastoma Daoy cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4945-4949.

图/表（结果） 4

2.1 人脐带间充质干细胞及其外泌体鉴定结果接种10 d左右可长出贴壁的梭形细胞，传至第4代呈平行排列或漩涡状生长，见图1A，B；流式细胞仪检测人间充质干细胞表面标志物CD73，CD44，CD90和CD105呈阳性表达，HLA-DR，CD14，CD34和CD45呈阴性表达，见图1C，提示所分离培养细胞为人间充质干细胞。人脐带间充质干细胞上清液超速离心得到的物质，经Western blot检测CD9，CD81蛋白均呈阳性表达，证明所提取物质为外泌体，见图1D。

2.2 Daoy细胞增殖情况 CFSE是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色剂，在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至2个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。培养96 h后，流式细胞术分析Daoy细胞CFSE荧光发生递减即增殖的细胞比率，这一部分细胞包含了G2/M期和S期细胞；CFSE荧光未发生递减即未增殖的细胞比率，这部分细胞为G0/G1期细胞。人脐带间充质干细胞来源外泌体组G2/M期和S期细胞比率为(44.60±7.28)%，明显低于对照组(79.30±8.92)%，差异有显著性意义(P < 0.05)；人脐带间充质干细胞来源外泌体组G0/G1期细胞比率为(53.10±5.74)%，明显高于对照组(20.30±4.42)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3 人脐带间充质干细胞来源外泌体对Daoy细胞克隆形成的影响通过克隆形成实验检测人脐带间充质干细胞来源外泌体对Daoy细胞增殖活力和群体依赖性的影响。人脐带间充质干细胞来源外泌体组Daoy细胞的克隆形成率为(42.6±8.6)%，较对照组(86.3±11.4)%明显下降(P < 0.01)，表明人脐带间充质干细胞来源外泌体对Daoy细胞增殖活力具有抑制作用，见图3。

2.4 人脐带间充质干细胞来源外泌体对Daoy细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的影响人脐带间充质干细胞来源外泌体组细胞凋亡率为(32.8±7.8)%，较对照组(11.9±9.4)%显著增加(P < 0.01)，见图4A和B；抗凋亡因子Bcl-2和Cyclin D1蛋白表达水平相对下调(P < 0.05)，而促凋亡因子Caspase-3蛋白表达显著上调(P < 0.01)，见图4C和D。

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引言

间充质干细胞是一群来源于中胚层的成体干细胞，因其具有多向分化潜能、低免疫原性、免疫调节以及分泌能力而被广泛用于研究免疫系统疾病、血液系统疾病和癌症[1-2]。外泌体是直径为30-100 nm的双层膜结构囊泡，是由细胞内多囊泡体与胞膜通过“内吞-融合-外排”等过程向胞外分泌的生物活性物质，能够介导细胞之间的信息交流，进而调节周围细胞的功能[3-4]。间充质干细胞来源外泌体具有与亲代细胞类似的生物学活性，如有低免疫原性、免疫调节能力以及能够归巢至炎症或肿瘤部位的能力，且外泌体较间充质干细胞具有低毒性、便于提取和储存等特点，发生体内免疫排斥的可能性较低，因而逐渐成为研究的热点[5-6]。
髓母细胞瘤是儿童常见的中枢神经系统肿瘤，约占儿童脑肿瘤的25%，常起源于小脑蚓部，是一种小脑神经上皮肿瘤，具有生长迅速、高侵袭性等特点[7-8]。目前髓母细胞瘤的治疗方法主要以手术切除为主、化疗为辅。然而，由于发病部位位于脑内，患者年龄小，使得手术难度大，且不易完全清除肿瘤，导致肿瘤易复发，5年生存率较低，探索新的生物治疗靶点，不断优化治疗方案，有望提高治疗效果、延长患儿生存率。间充质干细胞对于髓母细胞瘤的影响报道较少，该实验选择取材便利的脐带作为间充质干细胞的来源，观察人脐带间充质干细胞来源外泌体对髓母细胞瘤细胞体外增殖以及凋亡的影响，并探讨其可能的机制，为髓母细胞瘤寻找新的诊疗靶点提供实验数据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点 2019年9月至2020年6月在新乡医学院干细胞与组织工程重点实验室进行。
1.3 材料髓母细胞瘤Daoy细胞购于美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)。RPMI-1640、DMEM/F12、胎牛血清(Gibco公司)；表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(Thermo Fisher公司)；小鼠抗人抗体CD44-PE、CD34-FITC、CD45-APC、CD90-BV421、CD105-PE、CD73-FITC(Biolegend公司)；CD14-PE抗体、HLA-DR-APC抗体(碧迪公司)；结晶紫染料(碧云天生物技术有限公司)；抗人CD9和CD81抗体(Abcam公司)；β-actin单抗(Bioworld公司)；Cyclin D1，Bcl-2以及Caspase-3抗体(Cell Signaling Technology公司)；CFSE(Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI试剂盒(Sigma-Aldrich公司)。CO2培养箱(SHELLAB公司)；Image Quant LAS 4000化学发光成像仪(瑞士Mettler公司)；Labwork凝胶图像分析系统(日本奥林巴斯光学有限公司)；Verse流式细胞仪(碧迪公司)。
1.4 方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定经产妇及家属知情同意并签订知情同意书，在新乡市第二人民医院妇产科收集4份脐带标本，均为正常足月妊娠剖宫产，以确保无菌、无微生物污染。

首先在无菌操净台中将脐带用含100 U/L青霉素-链霉素的生理盐水反复冲洗，以去除残余血液，然后用无菌眼科剪去除外膜层和和脐带内动静脉，保留华尔通胶，将华尔通胶剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，收集组织块，手动振荡与剪切相结合，至无肉眼可见的组织块，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液重悬，分别加入10 μg/L表皮生长因子、2 μg/L成纤维细胞生长因子和100 U/mL青霉素-链霉素，三四天换液1次，待细胞长至80%融合，可传代。取传至第4代生长状态良好的细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，然后消化、离心，用PBS调整细胞浓度为5×105/管，分别加入CD44，CD73，CD90，CD105，CD14，CD34，CD45，HLA-DR抗体和各自的同型对照抗体进行荧光标记，室温避光30 min，离心，洗去残余抗体，上流式细胞仪检测。

1.4.2 人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取和鉴定收集第4代人脐带间充质干细胞培养上清，4 ℃ 300×g/min离心10 min，去除细胞碎片，转移至新的离心管，4 ℃ 2 000×g/min离心20 min，0.22 μm滤器过滤，再将上清转移至新的50 mL离心管，4 ℃ 10 000×g/min离心30 min，最后上清移至高速离心管，4 ℃ 100 000×g/min离心2 h，弃除上清，用PBS重悬沉淀，BCA蛋白质定量试剂盒对外泌体中的蛋白质进行定量，-80 ℃冰箱保存备用。

在外泌体中加入50 μL RIPA蛋白裂解液，而人脐带间充质干细胞对照样品(1.0×106个细胞)加入100 μL RIPA蛋白裂解液，均在冰上裂解并测定蛋白浓度，将蛋白煮沸变性后，使用10%SDS-PAGE蛋白分离胶进行电泳，蛋白分离后将其转至PVDF膜上，1%PBS/BSA溶液封闭1 h，4 ℃孵育一抗CD9和CD81(1∶1 000稀释)过夜，TBST洗膜，加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗(1∶2 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL发光液，使用数码成像仪曝光。

1.4.3 Daoy细胞培养以及实验分组取液氮冻存的Daoy细胞，置于38 ℃温水中迅速摇动至细胞溶解，加入RPMI-1640培养液洗涤离心，接种于25 cm2培养瓶静置培养，内含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，当细胞生长状态较好时，取出一部分细胞进行CFSE标记，然后将Daoy细胞以1×105个/孔接种于24孔板中，实验组加入10 mg/L人脐带间充质干细胞来源外泌体，对照组加入等量的PBS。
1.4.4 Daoy细胞增殖检测培养96 h后，取实验组和对照组Daoy细胞，离心，洗去残余培养液，将细胞置于流式管中，1×105个/管，流式细胞术检测CFSE荧光递减情况。
1.4.5 Daoy细胞克隆形成检测培养96 h后，实验组和对照组Daoy细胞以每皿1 000个接种于含RPMI-1640培养液的6 cm培养皿中，使细胞分散均匀，约10 d待克隆形成后，弃去培养液并用PBS洗去残留培养液，多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色15 min，PBS洗去多余的染料，在倒置显微镜下计数大于10个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。
1.4.6 Daoy细胞凋亡检测培养96 h后，实验组和对照组Daoy细胞以1×105个置于流式管中，PBS洗涤2次，加入500 µL Binding Buffer重悬细胞，分别加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI，室温避光染色10 min，上流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率。
1.4.7 Western blot检测Daoy细胞凋亡相关分子的表达培养96 h后，用RIPA裂解液提取实验组和对照组Daoy细胞总蛋白，紫外分光光度计测定蛋白浓度，取25 µg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜，封闭液封闭1 h，加入一抗Cyclin D1、Bcl-2、Caspase-3和β-actin，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL发光液进行显影，经Image J软件分析。
1.5 主要观察指标 Daoy细胞增殖与凋亡变化以及凋亡相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析所有数据均为4次独立重复实验所得，使用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，连续变量数据以x±s表示，采用t检验进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。流式结果用Flowjo 7.6分析，统计结果均采用GraphPad Prism 8作图。

讨论

间充质干细胞以其具有多潜能性、免疫调节和转分化功能而被作为一种重要的组织工程种子细胞。间充质干细胞在体内的作用机制复杂，旁分泌是其发挥作用的重要途径，外泌体是旁分泌的主要物质，由于其具有较低的体内毒性、免疫排斥性和不良反应等特点，有望将外泌体作为一种无细胞药物制剂应用于临床治疗中[9]。而对于肿瘤患者而言，间充质干细胞及其外泌体的使用仍具有争议性，目前对于间充质干细胞及其外泌体与肿瘤细胞的关系报道较多[10-14]，但是观点并不一致，一些学者认为间充质干细胞来源外泌体被靶细胞或组织内化后，可通过诱导肿瘤细胞耐药相关蛋白的表达，而使其产生耐药性[15-16]，还可通过促进肿瘤组织血管生成等促进肿瘤的增殖和发展[17-18]；还有研究认为间充质干细胞来源外泌体被内化后，可调节细胞周期进程以及癌症相关信号通路，通过阻断细胞周期使细胞凋亡增加，继而发挥抗肿瘤作用[19-20]。出现不同实验结果的可能原因有：间充质干细胞来源不同、作用的肿瘤细胞类型不同、间充质干细胞与肿瘤细胞及其外泌体数量比例不同、实验模型不同等因素。脐带间充质干细胞及其外泌体对于髓母细胞瘤的影响，目前报道较少见。该研究以人髓母细胞瘤Daoy细胞为体外研究对象，发现人脐带间充质干细胞来源外泌体可以抑制Daoy细胞增殖和克隆形成，此外还可以通过调节细胞周期蛋白以及凋亡相关因子来促进Daoy细胞的凋亡。
肿瘤细胞的增殖能力和克隆形成能力通常反映肿瘤细胞的活力和群体依赖性，异常增殖和侵袭是肿瘤恶化的标志。为了观察人脐带间充质干细胞来源外泌体对于Daoy细胞增殖的影响，采用CFSE标记Daoy细胞，根据荧光变化来判断细胞的增殖情况，实验组Daoy细胞发生增殖的细胞比率较对照组降低，提示人脐带间充质干细胞来源外泌体使更多的Daoy细胞停留在G0/G1期，改变了细胞周期，抑制了细胞增殖。通过克隆形成实验观察到实验组Daoy细胞克隆形成数目较对照组明显减少。以上结果共同表明人脐带间充质干细胞来源外泌体可以抑制Daoy细胞的增殖活力，这与一些认为间充质干细胞及其来源外泌体能够抑制肿瘤生长的报道相一致。例如miR-302A负载的人脐带间充质干细胞来源外泌体能够通过抑制细胞周期蛋白D1的表达和AKT信号通路而抑制子宫内膜癌细胞的增殖与迁移[21]；骨髓间充质干细胞来源外泌体还能够抑制胶质瘤细胞、胰腺癌细胞增殖[22-23]。
肿瘤具有快速增殖的特点，细胞周期调控是癌细胞生长的重要生理机制。为了进一步观察人脐带间充质干细胞来源外泌体对Daoy细胞生长抑制的机制，检测了细胞周期蛋白Cyclin D1、促凋亡因子Caspase-3和抗凋亡因子Bcl-2的表达。Cyclin D1是细胞周期蛋白，在许多发生癌变的组织中cyclin D1表达上调，它是评价肿瘤发生发展及转移的常用指标。目前认为，cyclin D1是调控G期至S期最关键的细胞周期蛋白，其表达下调将会使细胞阻滞于G1/G0期[24-25]。该实验观察到人脐带间充质干细胞来源外泌体使更多的Daoy细胞停留在G0/G1期，提示可能与cyclin D1表达下调有关。Caspase-3是细胞凋亡的关键因子之一，是凋亡的标志性蛋白，能够反映细胞的凋亡水平。研究表明，Caspase-3可以被cyclin D1、GLI1等上游因子激活，Caspase-3被激活后可以诱导凋亡小体形成，从而促进细胞凋亡[26-27]；另外还可以通过经典的Caspase依赖的凋亡途径促进凋亡过程。Bcl-2是抑制细胞凋亡的重要分子又被称为抗凋亡蛋白，其抗凋亡的机制主要有：Bcl-2可以减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成；Bcl-2可通过调节胞内钙离子浓度来调节凋亡等[28-29]。该实验观察到与人脐带间充质干细胞来源外泌体共培养后的Daoy细胞凋亡比率上升，进而在蛋白水平观察到Cyclin D1和Bcl-2表达下调，而Caspase-3表达上调，推测人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制Daoy细胞增殖并促进凋亡可能主要是通过抑制Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达、上调Caspase-3蛋白表达来实现的。
综上所述，人脐带间充质干细胞来源外泌体可能通过调节细胞周期以及凋亡相关蛋白表达来抑制髓母细胞瘤Daoy细胞的增殖，并促进其凋亡，但是，该实验仅为体外研究结果，下一步将对其机制进行临床标本和动物体内实验探索，以期为髓母细胞瘤的临床治疗提供实验数据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡

Exosomes from human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells suppress the proliferation and promote the apoptosis of medulloblastoma Daoy cells

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