流体静水压力对牙髓干细胞成牙/成骨分化的影响

doi:10.12307/2021.139

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 4976-4980.doi: 10.12307/2021.139

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

流体静水压力对牙髓干细胞成牙/成骨分化的影响

李峻青1，2，何文喜2，郭倩2，吴家媛1，3

1遵义医科大学，贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州省遵义市 563000；2军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，空军军医大学第三附属医院牙体牙髓病科，陕西省西安市 710032；3遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2020-10-26 修回日期:2020-10-29 接受日期:2020-12-07 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 吴家媛，博士，教授，遵义医科大学，贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州省遵义市 563000；遵义医科大学附属口腔医院，贵州省遵义市 563000
作者简介:李峻青，女，1993年生，贵州省遵义市人，汉族，遵义医科大学在读硕士，医士，主要从事牙体牙髓病学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81771060，81970932)，项目负责人：何文喜

Effect of hydrostatic pressure on odontogenic/osteogenic differentiation of dental pulp stem cells

Li Junqing1, 2, He Wenxi2, Guo Qian2, Wu Jiayuan1, 3

1Zunyi Medical University, Special Key Laboratory of Oral Diseases Research of Universities in Guizhou Province, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2State Key Laboratory of Military Stomatology, Key Laboratory of Shaanxi Province Stomatology, Department of Dental Pulp Diseases, The Third Affiliated Hospital of Air Force Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; 3Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2020-10-26 Revised:2020-10-29 Accepted:2020-12-07 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Wu Jiayuan, MD, Professor, Zunyi Medical University, Special Key Laboratory of Oral Diseases Research of Universities in Guizhou Province, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Li Junqing, Master candidate, Zunyi Medical University, Special Key Laboratory of Oral Diseases Research of Universities in Guizhou Province, Zunyi 563000,
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81771060 (to HWX), No. 81970932 (to HWX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

牙髓干细胞：由GRONTHOS等研究发现的一种与间充质干细胞相似且具有自我更新、多向分化和较强克隆能力，来源于牙髓组织的细胞，称牙髓干细胞，又称为牙髓间充质干细胞。
流体静水压：处于相对静止状态下的流体，由于本身的重力或其他外力的作用，在流体内部及流体与容器壁面之间存在着垂直于接触面的作用力，这种作用力称为流体静水压。
背景：除了生物化学因素外，细胞力学被认为是影响干细胞行为和功能的关键因素。
目的：探讨静水压力对人牙髓干细胞成牙/成骨分化潜能的影响。
方法：通过酶消化法分离提取人牙髓干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达，成骨诱导培养14 d或成脂诱导培养21 d分别采用茜素红染色或油红O染色鉴定人牙髓干细胞的多向分化能力。利用自主研发的力学加载装置，对人牙髓干细胞加载不同的流体静水压(0，30，60，90，120，150 kPa)，加压1 h，在第1，3，5，7天弃掉培养液，采用CCK-8法检测人牙髓干细胞的增殖活性；每天加压1 h并连续加压14 d，茜素红染色观察成骨矿化能力，Western blot法检测成牙/成骨分化相关基因的蛋白表达水平。
结果与结论：牙髓干细胞高表达CD29、CD90、CD146、CD105，低表达CD45、CD34，具有成骨、成脂分化能力。流体静水压力在90，
120 kPa时可以促进牙髓干细胞增殖，但150 kPa时明显抑制其增殖。流体静水压刺激14 d后，牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素的蛋白表达量显著低于对照组(P < 0.05)，且随着静水压力值的增加，抑制其成牙/成骨分化的能力越明显。结果表明，流体静水压力参与牙髓干细胞成牙/成骨分化过程并具有负向调控作用。
https://orcid.org/0000-0001-6191-6539(李峻青)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 牙髓干细胞, 流体静水压, 静压力, 细胞力学, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Besides biochemical factors, cellular mechanics is increasingly recognized as the key factor affecting the behavior and function of stem cells.

OBJECTIVE: To explore the effect of hydrostatic pressure on the odontogenic/osteogenic differentiation potential of human dental pulp stem cells.
METHODS: Human dental pulp stem cells were isolated and extracted by enzyme digestion. The expression of cell surface markers was detected by flow cytometry. After osteogenic induction for 14 days or adipogenic induction for 21 days, alizarin red or oil red O staining was used to identify the mutidirectional differentiation of human dental pulp stem cells. The human dental pulp stem cells were loaded with hydrostatic pressure of different pressure values (0, 30, 60, 90, 120, and 150 kPa) by using the self-developed mechanical loading device, for 1 hour. At 1, 3, 5, and 7 days, the culture solution was discarded. CCK-8 assay was used to observe the proliferation of human dental pulp stem cells, 1 hour per day, for 14 consecutive days. Alizarin red staining was applied to observe the osteogenic and mineralized abilities. Western blot assay was used to detect the protein expression levels of odontogenic/osteogenic differentiation related genes.
RESULTS AND CONCLUSION: Dental pulp stem cells expressed high levels of CD29, CD90, CD146, CD105 and low levels of CD45 and CD34, and had the ability of osteogenic and adipogenic differentiation. Hydrostatic pressure could promote the proliferation of human dental pulp stem cells at 90 and 120 kPa, but the proliferation ability could be significantly inhibited when the pressure value was 150 kPa. After 14 days of hydrostatic pressure stimulation, the protein expression levels of dentin sialophosphoprotein, collagen type I, and osteocalcin in dental pulp stem cells were significantly lower than those in the control group (P < 0.05), and their ability to inhibit differentiation became more obvious with the increase of hydrostatic pressure. The results show that hydrostatic pressure is involved in the process of dental pulp stem cell odontogenesis/osteogenesis and has a negative regulatory effect.

Key words: stem cells, dental pulp stem cells , hydrostatic pressure, static pressure, cellular mechanics, cell differentiation

中图分类号:

李峻青, 何文喜, 郭倩, 吴家媛. 流体静水压力对牙髓干细胞成牙/成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4976-4980.

Li Junqing, He Wenxi, Guo Qian, Wu Jiayuan. Effect of hydrostatic pressure on odontogenic/osteogenic differentiation of dental pulp stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4976-4980.

图/表（结果） 5

2.1 牙髓干细胞的形态利用组织块酶消化法成功分离培养牙髓干细胞，第5天可在镜下观察到组织块周围有长梭形细胞贴壁生长，大小、形态较均一，见图1A；10 d左右，可见牙髓干细胞呈集落生长，排列成团块或漩涡状，见图1B；当细胞融合至80%以上，通过0.25%胰酶消化传代并扩大培养。

2.2 牙髓干细胞的鉴定结果体外成骨诱导培养2周进行茜素红染色，显微镜下观察可见牙髓干细胞排列紧密，细胞间有大量呈现团块状的红褐色钙化结节，见图1C；体外成脂诱导培养3周进行油红O染色，显微镜下可见细胞间染成红色且发亮的脂滴，见图1D。

流式细胞仪检测分析牙髓干细胞中CD29、CD90、CD105、CD146高表达，而CD34和CD45近乎不表达，见图2。

2.3 流体静水压力对牙髓干细胞增殖能力的影响各组培养3，5，7 d后，90，120 kPa流体静水压均可促进牙髓干细胞增殖，30，60 kPa时牙髓干细胞增殖与对照组相比没有明显变化，而150 kPa流体静水压力显著抑制牙髓干细胞增殖，对其有毒性作用，见图3。

2.4 流体静水压对牙髓干细胞分化的影响使用不同压力值的流体静水压矿化诱导14 d后，茜素红染色及定量分析结果显示：流体静水压力均明显抑制牙髓干细胞成牙/成骨向分化能力(P < 0.05)，其中120 kPa流体静水压的抑制作用最为显著，见图4。

进一步通过Western blot观察成牙/成骨分化相关基因的表达，结果显示：在流体静水压力刺激下牙本质涎磷蛋白、骨钙素与Ⅰ型胶原的表达显著降低(P < 0.05)，见图5，与茜素红染色结果一致。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3月至2020年9月在空军军医大学第三附属医院牙体牙髓病科实验室完成。
1.3 材料地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、青链霉素、茜素红(美国Sigma公司)；α-MEM培养基、胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；Western blot(美国Bio-Rad公司)；国家重点实验室自行设计制作的细胞液压加载装置[12-15]；氯化十六烷基吡啶(美国Sigma公司)；ECL化学发光底物(中国Millipore公司)；PVDF膜(美国Santa公司，孔径：0.45 μm)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(美国Bio-Rad公司)；牙本质涎磷蛋白抗体(美国Santa公司，货号：sc-73632)、Ⅰ型胶原抗体(美国CST公司，货号：39952S)、骨钙素抗体(美国Santa公司，货号：sc-390877)、Tubulin抗体(中国Abway公司，货号：AB2002)；CD29、CD34、CD105、CD146、CD45、CD90抗体(美国Biolegend公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)；离心机(日本Kubota2l00)；AR2130电子天平(上海梅特勒-托利多)；酶标仪(美国Power Wave 340，Bio-TEK公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 牙髓干细胞的分离、培养患者知情同意后，在空军军医大学第三附属医院口腔颌面外科获取因正畸减数而拔除的健康第三磨牙，完整取出牙髓将其放置于含有2%双抗的PBS中反复冲洗，用小剪刀将牙髓组织剪至1 mm×1 mm大小，加入Ⅰ型胶原酶消化40 min，接种于含体积分数20%胎牛血清的α -MEM培养基，放置在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞量达到孔底面积70%-80%时，胰酶消化传代并扩大培养。

1.4.2 牙髓干细胞表面标志物的鉴定取生长状态良好的第3代牙髓干细胞，胰酶消化后离心，用含体积分数3%胎牛血清的PBS重悬，将100 μL(1×106)单细胞悬液分装至EP管中。每管分别加入CD105-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD29-PE、CD146-PE抗体，室温避光孵育1 h，PBS清洗3次，转移至流式细胞管，上流式细胞仪检测。

1.4.3 牙髓干细胞分化能力检测取生长状态良好的第3代牙髓干细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，待细胞生长融合至80%，加入成脂诱导液(含1 mmol/L IBMX，0.4 mmol/L吲哚美辛，0.2 μmol/L地塞米松，0.02 g/L胰岛素，100 mg/L链霉素，100 U/mL青霉素和体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养液)诱导培养21 d，进行油红O染色，倒置显微镜下观察和拍照。取生长状态良好的第3代牙髓干细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，待细胞生长融合至80%，加入成骨诱导液(10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油钠，50 mg/L维生素C、100 mg/L链霉素，100 U/mL青霉素和体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养液)诱导培养14 d，进行茜素红染色，倒置显微镜下观察和拍照。
1.4.4 力学加载采用国家重点实验室自主研发的细胞液压加载装置对牙髓干细胞施加流体静水压力[12-15] ，该系统可以对细胞施加准确、可调且一致的压力。通过向37 ℃密闭的培养室(湿度98%)连续注入二氧化氮、空气、氮气等方式产生正性压力使细胞受压，观察流体静水压力对牙髓干细胞增殖及成牙/成骨分化相关基因表达的影响。
1.4.5 CCK-8增殖实验取生长状态良好的第3代牙髓干细胞，将200 μL(2 000个细胞)细胞悬液接种至96孔板，用含体积分数10%胎牛血清的α -MEM培养基培养，每天统一时间点分别进行0，30，60，90，120，150 kPa加压1 h，在第1，3，5，7天弃掉培养液，加入CCK-8溶液，在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱孵育2 h，用酶标仪检测490 nm波长各孔吸光度值。
1.4.6 茜素红染色及定量分析取生长状态良好的第3代牙髓干细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，分别施加0，30，60，90，120 kPa流体静水压，频率0.1 Hz，加载1 h，连续加载14 d，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗，加入40 mmol/L pH 4.2的茜素红染色5-10 min，蒸馏水洗去残留的染液，倒置显微镜下观察并拍照记录。定量分析：配置10%氯化十六烷基吡啶溶解液，加入茜素红染色的细胞中，置于摇床上30 min，使茜素红最大程度溶解，将溶解后的液体以每孔100 μL加入96孔板，用酶标仪检测562 nm波长各孔吸光度值。
1.4.7 Western blot检测牙本质涎磷蛋白、Ⅰ型胶原、骨钙素的表达完取生长状态良好的第3代牙髓干细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，分别施加0，30，60，90，120 kPa流体静水压，频率0.1 Hz，加载1 h，连续加载14 d，收集细胞，加入适量蛋白裂解液冰上裂解细胞，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，小心吸取上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，超纯水调平各组蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液放入100 ℃沸水中煮5 min，每组上样量20 μg，进行10%凝胶电泳，转膜，5%牛血清蛋白室温封闭1 h，分别加入牙本质涎磷蛋白、Ⅰ型胶原、骨钙素、TUBULIN一抗，4 ℃避光孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h，ECL化学发光试剂盒将膜在凝胶成像系统中显影，Image J软件分析灰度值。
1.5 主要观察指标流体静水压力对牙髓干细胞增殖、分化能力的影响。
1.6 统计学分析应用SPSS 14.0统计学软件进行统计学分析处理，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行各组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

除了生物化学因素外，细胞力学被认为是影响干细胞行为和功能的关键因素。常见的力学类型包括静水压力、牵张力、压缩力、流体切力，刺激的方式分为动态和静态。牙齿作为咀嚼系统的重要器官，在日常生活中使用咀嚼功能而经常处于受力状态，又因异常咬合、咬合早接触、夜磨牙等使牙髓常常受到动态或静态的各种力学刺激，而各种类型的力学刺激对其来源干细胞即牙髓干细胞的增殖、分化、迁移等活动产生一定影响并积极参与到牙髓损伤修复过程。该研究采用自主研发的细胞力学加载装置模拟牙齿所承受的静态压力微环境。
研究发现生物力学刺激可协同生长因子或细胞培养的微环境调控骨髓间充质干细胞的定向分化[16]，牙髓干细胞在周期机械循环张力的作用下，可显著提高Ⅰ型胶原、骨唾液酸蛋白和骨钙素的蛋白表达量和骨唾液酸蛋白、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平[9，17]；HATA等[8]和CAI等[18]分别发现牵张力抑制牙髓干细胞的分化；YU等[19]研究发现动态静水压力(2.5 MPa，0.5 Hz)作用时间2 h时可促进牙髓干细胞骨向分化而轻度抑制细胞活性。成骨细胞在每天1 h，68 kPa流体静水压力作用下会增加成骨相关标识物环氧化酶2的表达，但骨髓干细胞没有产生相似的变化[20-21]；相比之下，10-36 kPa静水压力刺激下可以促进骨髓间充质干细胞表达一些早期成骨相关基因如成骨转录因子2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶[22-23]。此外，骨髓间充质干细胞用每天90 kPa静水压力处理21 d后，未见其有成骨相关变化[12，22]。不同力学类型对不同细胞产生不同的影响，即使选用相同的力学类型，又因为力学微环境作用下力的大小、作用时间、频率对牙髓干细胞的影响效应也不尽相同，因此，该实验拟探索一定范围内不同静水压力对牙髓干细胞成牙/成骨分化的影响，选用0-150 kPa压力值范围，以30 kPa为梯度递增，作用时间1 h/d。
细胞增殖是细胞的重要生理功能之一，是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。牙髓干细胞的增殖能力对力学反应较为敏感，在循环单轴压应力刺激3 h或6 h时会显著刺激牙髓干细胞增殖[24]，循环机械张力、低强度脉冲超声等也可显著促进牙髓干细胞增殖[9，25]。该实验采用CCK-8实验检测不同压力干预不同时间对牙髓干细胞增殖能力的影响，结果显示，压力作用3，5，7 d时，90 kPa和120 kPa静水压力均可刺激细胞增殖，而30 kPa和60 kPa静水压力下与对照组相比没有明显变化，150 kPa静水压力显著抑制细胞增殖，对其有毒性作用，因此在后续实验选用30，60，90，120 kPa静水压力干预。
茜素红染色及定量分析是一种鉴定钙化结节形成的有效方法，可以判断细胞成牙/成骨分化的能力。牙髓干细胞在成牙/成骨过程中可表达牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原等相关基因，其中牙本质涎磷蛋白在体内被蛋白裂解为牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白，在干细胞成骨分化过程中发挥着重要的作用[26]。Ⅰ型胶原是早期成骨分化的标志，干细胞成骨向分化一般都会表现出Ⅰ型胶原表达或合成增加[27]。骨钙素能抑制羟基磷灰石异常结晶的形成并在成骨过程中起关键作用，其是成骨细胞合成的一种非特异性蛋白，并且与骨的钙化以及钙的运输相关，可作为成熟成骨细胞的标志[28]。该实验通过茜素红染色、茜素红定量及Western blot检测结果可见，施加30，60，90，120 kPa静水压力刺激14 d后，相较于对照组，牙本质涎磷蛋白、Ⅰ型胶原及骨钙素的蛋白表达量逐渐降低，说明静水压力抑制牙髓干细胞成牙/成骨分化，且抑制效果随着压力的增加逐渐增强，提示其受抑制效应可能与力值大小成正相关。
综上所述，一定范围内的流体静水压力可诱发牙髓干细胞产生应答反应，在90 kPa和120 kPa压力下促进牙髓干细胞增殖，但随着流体静水压力值的不断增加，对牙髓干细胞成牙/成骨分化能力的抑制作用越明显，但尚不明确通过哪些作用机制来调控流体静水压力诱导牙髓干细胞成牙/成骨分化，未来可进一步探讨其内在作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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