间充质干细胞在关节软骨组织工程中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.023

摘要/Abstract

摘要：

背景：组织工程技术的发展为关节软骨缺损修复和功能重建提供了新的方法和思路。

目的：探讨以间充质干细胞作为种子细胞在关节软骨组织工程中的应用和研究进展。

方法：由第一作者检索PubMed数据库中2000-01-01/2014-09-30有关间充质干细胞和关节软骨组织工程的文献，检索词为“articular cartilage defects, cartilage tissue engineering, mesenchymal stem cells”。共检索到70篇相关文献，对其中49篇文献进行综述。

结果与结论：关节软骨缺损自身修复能力很有限，目前的临床治疗手段无法达到满意修复，而组织工程的发展为解决这个问题提供了新思路。在种子细胞选择方面，软骨细胞去分化能力有限，胚胎干细胞受到伦理、法律等方面的制约，而间充质干细胞因其自体来源、易扩增、具有软骨分化潜能而受到广泛重视。但目前应用组织工程方法修复关节软骨缺损的效果存在一定的争议，主要是远期功能距离临床应用存在一定差距，在修复组织结构和生物力学方面还需要进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 关节软骨缺损, 间充质干细胞, 软骨组织工程, 综述, 上海市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The development of tissue engineering techniques provides new methods and ideas for the repair and functional reconstruction of articular cartilage defects.

OBJECTIVE: To summarize the research progress in the application of mesenchymal stem cells, as seed cells, in articular cartilage tissue engineering.

METHODS: A computer-based retrieval was performed to search articles describing articular cartilage tissue engineering and mesenchymal stem cells published between January 1st, 2000 and September 30th, 2014 in PubMed database with the key words of “articular cartilage defects; cartilage tissue engineering; mesenchymal stem cells” in English. Seventy articles were retrieved initially, and only 49 were included in further analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: The ability of the articular cartilage for defect self-repair is limited, and current clinical treatments cannot be satisfactory. Development of tissue engineering provides a new idea for problem-solving. In the selection of seed cells, chondrocyte is limited to dedifferentiate, and embryonic stem cell is restricted by ethical, legal and other aspects. Autologous mesenchymal stem cells, which are easy to be amplified and exhibit excellent cartilage differentiation potential, have gained widespread attention. But there is still some controversy on the current application of tissue engineering techniques for repair of articular cartilage defects, including a certain gap between the long-term effects and the clinical applications. So the effect of mesenchymal stem cells on biological structure and mechanical function still needs further studies.

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Key words: mesenchymal stem cells, cartilage, articular, tissue engineering

中图分类号:

R318

张永兴，赵庆华. 间充质干细胞在关节软骨组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(45): 7342-7347.

Zhang Yong-xing, Zhao Qing-hua. Application of mesenchymal stem cells in articular cartilage tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(45): 7342-7347.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞成人骨髓间充质干细胞是最广泛应用于软骨组织工程构建研究中的间充质干细胞，被认为是骨肌系统构建的“金标准”。骨髓间充质干细胞容易通过骨髓穿刺获得，具有在体内和体外分化为结缔组织如软骨、骨和脂肪组织的能力。使用骨髓间充质干细胞的主要优点在于为组织构建提供了自体细胞来源，避免了潜在的免疫排斥。自体和同种异体的骨髓间充质干细胞有免疫抑制能力^[9]。Wakitani等采用体外培养的兔自体骨髓间充质干细胞修复关节软骨全层缺损后，组织学评分发现术后3个月内缺损被软骨组织所修复，其后他们又进行了人关节软骨缺损的修复，也获得类似效果。但经长期观察发现，已形成的透明软骨最终被纤维软骨和骨样组织所代替。并且，由于骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，故干细胞中只有一小部分能自发地分化为软骨祖细胞，其在体外的分化很大程度上依赖于特殊的培养条件，诱导因子在骨髓间充质干细胞的定向分化中起到非常关键的作用。Kuroda等^[10]研究显示，自体骨髓间充质干细胞不存在免疫排斥反应，可成为理想的软骨种子细胞来源。Rowland等^[11]发现用细胞外基质作为支架材料，如去矿化的骨基质，不仅可以提供良好的生物力学支撑，还可以调节细胞行为、减少免疫反应，改善体内软组织修复的长期效果。除此之外，细胞因子对于骨髓间充质干细胞成软骨分化能力也有一定的影响^[12]。Wei等^[13]发现骨髓间充质干细胞合成的细胞外基质和转化生长因子β3均能存进软骨损伤处的骨髓凝块向软骨方向分化。Bhumiratana等^[14]通过转化生长因子β诱导骨髓间充质干细胞模拟体外间充质凝结的过程，构建了一种生物机械性能好(弹性模量> 800 kPa，均衡摩擦系数< 0.3)的生物软骨，用于软骨缺损修复，取得了比较好的效果。

不少学者试图通过改良支架材料性能复合骨髓间充质干细胞来达到更好的修复效果。Bai等^[15]和Tan等^[16]分别发现，生物活性玻璃和三维多孔支架表面改性复合骨髓间充质干细胞比起自体骨组织，能够更好地在宿主体内进行整合，在移植物表面形成透明软骨样组织，表达更多的Ⅱ型胶原。Zheng等^[17]和Xie等^[18]分别发现，仿生结构的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)和聚己酸内酯(PCL)多孔海绵支架对骨髓间充质干细胞均具有良好的亲和性；Ahmed等^[19]发现新鲜的血纤维蛋白和富血小板的纤维蛋白胶与骨髓间充质干细胞复合均能收到良好的效果，血纤维蛋白的效果似乎要好过富血小板的纤维蛋白胶；Duan等^[20]用温度梯度介导、热诱导相分离的方法来编织细胞外基质，后与骨髓间充质干细胞复合植入裸鼠皮下，与仅仅通过冷冻干处理的支架相比，前者的压缩模量更高，机械性能更佳；同时，支架组成材料的有序排列对于软骨缺损的修复也十分重要^[21]。众所周知，软骨损伤部位往往会产生大量的炎性因子，如白细胞介素1，这些炎性因子会影响细胞材料复合体的机械性能。Ousema等^[22]发现3D网状支架可以保持材料良好的机械性能，从而减少了炎性因子对材料细胞复合体的负面影响。软骨组织工程移植物通常能够保持接近正常的抗压能力，但是其抗拉伸能力、不均一性和各向异性都不如正常软骨组织。为此，Huang等^[23]设计了一种新型的滑动接触生物负荷反应器，通过增加两关节接触面的生理负荷来刺激其机械性能的改善。Erickson等^[24]通过不同浓度(1%，2%，5%)的丙烯酸酯透明质酸交联水凝胶高聚物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程复合物，发现随着高聚物密度的增加，骨髓间充质干细胞成软骨分化能力和基质形成能力得到增强，但机械性能却随之下降，在1%浓度的复合物中，其均衡压缩模量为0.12 MPa，糖胺多糖含量接近湿质量的3%，分别达到了正常组织的25%和50%。

也有人通过技术方法与流程的革新来提高软骨组织工程的有效性。Shi等^[25]通过聚L-乳酸-乙醇酸(PLLGA)支架与微骨折法结合，将软骨缺损腔与软骨下骨髓钻通，使得骨髓间充质干细胞可以直接进入缺损部位，从而将体内取材、体外培养、体内回植的过程转变成“一步”。Wise等^[26]通过静电纺丝复合聚己酸内酯纳米支架(500-3 000 nm孔径)构建软骨组织工程支架替代细胞外基质获得了成功。

近年来，研究者们发现软骨组织工程不应紧紧局限于表层软骨，还应关注软骨下骨的修复，尤其是对于高负荷区的骨软骨缺损^[27]，于是提出了骨软骨修复的概念^[8]。Da等^[28]通过研究发现致密层在骨软骨修复中具有重要作用，含有致密层的双相支架的机械性能(包括抗拉伸和抗剪切能力)更强；体内试验也表明，其表观评分、糖胺多糖和胶原含量、显微断层成像效果以及组织学性质更佳；Liu等^[29]和Zhou等^[30]分别通过Ⅰ型胶原和聚羟基乙酸羟基磷灰石双向支架复合骨髓间充质干细胞用于软骨组织工程均取得了满意的效果。

2.2 脐带间充质干细胞对骨髓间充质干细胞创造性的研究为关节软骨缺损的修复提供了新的种子细胞来源，成为目前组织工程修复关节软骨缺损研究的主要细胞类型，但由于对骨髓间充质干细胞分化的机制并不明确，且这种分化并不稳定、分化率有限、分化后的软骨细胞显示出易退化和衰老的特性，在软骨缺损修复长期观察中发现暂时形成的透明软骨最终会被纤维软骨或纤维组织所替代，这些局限性都限制了骨髓间充质干细胞在软骨组织工程中的进一步应用；在研究中科学家们发现，人类脐带来源的间充质干细胞似乎可以弥补骨髓间充质干细胞的不足。

脐带间充质干细胞是一种多能基质细胞，它具有可黏附性和可塑性，细胞表面一样可以产生像其他间充质细胞表面产生的标记分子，如CD73、CD90和CD105，而且不是造血细胞。作为一种胚外细胞来源，脐带间充质干细胞比骨髓间充质干细胞有更快的增殖速度，数量翻倍所用时间更短^[31]。比起骨髓间充质干细胞，脐带间充质干细胞在体外保持增殖分化特性的时间要更长^[32]。细胞采集之后，脐带间充质干细胞经过7次传代，已经达到了具有细胞数量300倍增长，而始终保持分化潜能的特性^[33]。然而，脐带间充质干细胞的成软骨细胞分化能力的研究得出的结论却不一致。在Wang等做的实验中，未经转化生长因子β1诱导的脐带间充质干细胞在黏多糖检测和Ⅱ型胶原的检测中呈阳性。而在Karahuseyinoglu等^[34]做的相同实验中，脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均只检测到少量的Ⅱ型胶原。在对脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞所做的实验中都检测到了Ⅰ型胶原，而拥有更好丝状细胞外基质的脐带间充质干细胞组中观察到比骨髓间充质干细胞组更大的胶原颗粒。

2009年，研究者将骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞在几乎完全相同的条件下传代培养，然后接种到聚乙醇酸支架上，在成软骨基质中培养^[35]。这次实验的主要成果在于人们发现，脐带间充质干细胞产生的胶原数量要高于骨髓间充质干细胞(以每平方单位基质和每个细胞为单位来计数)。2010年，人们将骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞在几乎完全相同的条件下又进行了一次对比实验，这次实验是将它们接种在以微球体为基质的倾斜支架上^[36]。在这次骨软骨构建实验中，脐带间充质干细胞在胶原合成和碱性磷酸酶活性方面要高于骨髓间充质干细胞，然而在Sox9和Runx2的基因表达方面，前者仍逊于后者。

总体来讲，脐带间充质干细胞在分化能力方面要逊于骨髓间充质干细胞，但是比后者有更强的组织形成能力。但必须指出的是，这些发现仅适用于特定的体外环境，如果脐带间充质干细胞确实能够对体内诱导信号做出比较积极响应的话，脐带间充质干细胞可能在组织再生的质量和成功率方面有更大的骨软骨再生的潜力。

2.3 脂肪间充质干细胞骨髓间充质干细胞虽然可以作为关节软骨组织工程的主要种子细胞，但取材困难、原代数量少仍然是限制其应用的“瓶颈”。作为替代，脂肪来源的间充质干细胞逐渐引起了大家的兴趣。脂肪组织容易获得，而且间充质干细胞的含量高(约占间充质细胞总数的5%)，在同等条件下是骨髓间充质干细胞含量100倍^[37]。脂肪组织可以通过脂肪吸引术这种微创技术大量获得，继而获得大量的脂肪间充质干细胞^[38]。脂肪间充质干细胞成软骨分化涉及3个时相，即凝结、增殖、分化；Zhang等^[39]发现脂肪间充质干细胞在未经诱导的情况下也能修复全层透明软骨缺损；Merceron等^[40]用一种可注射的自固化纤维素水凝胶复合脂肪间充质干细胞进行成软骨分化培养，效果与骨髓间充质干细胞并无明显差异。Buckley等^[41]发现在含有转化生长因子β3的环境下，低氧能够促进髌骨下脂肪垫来源的间充质干细胞形成细胞外基质；然而，在正常氧浓度和转化生长因子β3存在的情况下，软骨细胞复合的组织工程支架却能产生最佳机械性能。Jakobsen等^[42]比较了骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞复合透明质酸支架在软骨组织工程中的应用，结果发现，3周后，骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原mRNA的水平是脂肪间充质干细胞的600倍；而Ⅰ型胶原mRNA和蛋白聚糖的表达二者基本相同，这一结果表明，在软骨组织工程应用方面，骨髓间充质干细胞似乎比脂肪间充质干细胞更具优势。

2.4 其他来源的间充质干细胞与基因转染除了以上来源，骨膜、关节滑膜也是常见的间充质干细胞来源。2001年，De Bari等从人关节周围的滑膜中分离出了间充质干细胞，即滑膜间充质干细胞。滑膜中的间充质干细胞比例很高，平均每毫克滑膜组织中含(3.0-4.0)×10³个有核细胞，平均10个有核细胞中就含有8个左右间充质干细胞，因此只需少量的标本就可以获得足量滑膜间充质干细胞，其数量是骨髓来源间充质干细胞的100倍以上，并且随着供体年龄的增加，间充质干细胞数量也并未出现明显减少。Iwakura等^[43]发现转化生长因子β1和骨形态发生蛋白7的联合或序贯使用能够促进滑膜来源间充质干细胞的成软骨分化和浅表层蛋白的分泌。Hermida-Gómez等^[44]研究发现，骨关节炎患者的滑膜间充质干细胞表达CD271要高于健康人的滑膜间充质干细胞，且更多地参与关节软骨的修复，修复效果更好，质量更高。在增殖能力方面，脂肪来源的间充质干细胞在第7代即丧失增殖力，而滑膜来源间充质干细胞在10代后仍保持增殖能力^[43]。这些发现都在一定程度上拓宽了间充质干细胞的取材来源。

为解决种子细胞来源困难的难题，学者们将转基因技术应用到关节软骨组织工程，将转化生长因子、骨形态发生蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等基因借助载体转染至相应靶细胞，使之分化为软骨细胞，其中应用最多的靶细胞是骨髓间充质干细胞。Cao等^[45]用腺病毒介导将Sox-9基因转移到兔骨髓间充质干细胞中，发现骨髓间充质干细胞成软骨分化能力增强。Bai等^[46]发现骨形态发生蛋白7基因转染的骨髓间充质干细胞分泌Ⅱ型胶原、糖胺多糖量增加，与阳性对照组(转化生长因子β1、地塞米松诱导)几乎相同。Hu等^[47]用抗凋亡蛋白基因Bcl-xL，Elsler等^[48]用北美萤火虫荧光素酶、β-大肠杆菌半乳糖苷酶和人胰岛素样生长因子1对间充质干细胞进行基因转染，发现转染细胞生存率高，细胞毒性小，且在长期培养中软骨分化能力不受影响。但Seo等^[49]发现转染基因序列对宿主体内本身的基因结构造成了破坏，且长期的生长因子过表达会导致干细胞发生一系列的改变。除此之外，间充质干细胞与转染生长因子后的软骨细胞共培养也是不错的替代方式。关于基因转染的可行性与安全性，还需进一步的探讨。

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引言

临床上，各种原因造成的关节软骨损伤广泛存在，国外文献报道关节软骨损伤发生率为5%，在特定人群(如运动员)中的发生率可高达22%-50%。不同于骨组织，人体关节软骨一旦损伤就很难再生，其组织学和生物学特性限制了它对损伤的反应^[1]：①缺乏血管，使未分化间质细胞无法进入损伤部位进行类似其他组织的愈合过程。②软骨组织本身缺乏修复损伤的未分化细胞。③软骨细胞包埋于致密的胶原-蛋白多糖基质中，限制了细胞的增殖和迁移能力。④成熟的软骨细胞基质在软骨受到损伤时的合成能力虽然增加，但很有限而不足以满足修复的需要。临床修复软骨缺损的方法很多^[1]，每种方法均有其各自的优势和劣势。微骨折术一般用于治疗软骨缺损面积小于4 cm²，患者年龄小于40岁的软骨缺损，但它修复后产生纤维软骨而非透明软骨，且存在新生软骨层较薄、缺损周边融合不完全、软骨下骨过度生长等其他缺陷，不适用于大面积软骨缺损的修复。软骨移植分为自体和异体移植，用于修复大面积软骨缺损方面优势明显，但自体软骨移植需要两次手术，术后康复时间长，并且存在对技术要求高、新生成的细胞表型不稳定、骨膜相关并发症多等缺点。Niemeyer等^[2]总结出自体软骨移植技术的4个主要并发症，即骨膜肥大、再生软骨融合不佳、再生软骨少、脱层。而异体软骨移植虽然克服了自体软骨移植修复面积小、供区并发症、移植物与缺损区结构很难匹配等问题，但也存在免疫排斥风险、组织融合不佳、费用高、有疾病传播可能、移植物有效活性等缺点。

随着材料学、生命科学，以及相关物理、化学学科的发展，人们提出了一种新的方法——组织工程^[3]，其基本方法是将自体或异体组织细胞经体外培养扩增后，接种到一种生物相容性良好、可生物吸收的生物材料上，形成细胞生物材料复合物。将细胞生物材料复合物回植到体内组织缺损部位，在生物材料逐渐被机体吸收的过程中，细胞就形成新的有功能的组织，从而达到修复组织或器官缺损的目的。

在关节软骨组织工程中，种子细胞的选择显得尤为重要。软骨细胞似乎是软骨缺损修复的最佳选择，可从关节软骨或鼻软骨中获取，在体外和体内移植研究中均证实具有可靠的软骨形成效果^[4]，但单层培养扩增存在表型变异问题，即软骨细胞去分化成纤维细胞特征，失去软骨形成能力，细胞数量受到限制，从而达不到组织构建的要求。胚胎干细胞可分化成所有种类的细胞包括生殖细胞^[5]，其无限增殖和自我更新能力使其产生应用于组织构建中的终末分化细胞数量在理论上是无限的。然而，胚胎干细胞受到了一系列的限制和约束，包括道德伦理、来源不足、移植后有形成畸胎瘤的可能，以及免疫排斥反应等^[6]。间充质干细胞具有多分化潜能，存在于骨髓、滑膜、外周血和脐血中，在外源性生长因子存在的条件下可以分化成同一胚层的各种类型细胞，形成不同类型的组织，包括骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪组织和其他结缔组织。国际细胞治疗协会(ISCT)提出，被定义为间充质细胞必须满足以下3个标准^[7]：①具有可黏附性和可塑性。②细胞表面表达CD105，CD73和CD90标记分子，但不表达造血干细胞表面标记分子。③在体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。因具备以上特性，间充质干细胞逐渐能够替代软骨细胞和胚胎干细胞，成为软骨组织工程构建的理想种子细胞。Berninger等^[8]还系统描述了利用间充质干细胞的多能分化性质实现骨软骨多层次修复的一般步骤和原则。本文将对不同来源的间充质干细胞及其在关节软骨组织工程中的应用做一综述。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

讨论

文章快阅

1 此问题的已知信息：关节软骨是滑膜关节中最重要的结构之一，也是滑膜关节的功能单位。由于软骨组织本身缺乏血管，也缺乏修复损伤的未分化细胞，加之软骨细胞包埋于致密的胶原-蛋白多糖基质中，其增殖和迁移能力受到限制，所以关节软骨缺损自身修复能力很有限，目前的临床治疗手段无法达到满意修复；而如果治疗不及时或者治疗方法不恰当，不但不能满足正常关节的功能需求，而且可能诱发骨关节炎等关节功能障碍。而组织工程的发展为解决这个问题提供了新思路，使软骨组织缺损的完全再生成为可能，并且可以达到恢复软骨组织结构完整性和功能稳定性的最终目的。
2 文章增加的新信息：在细胞选择方面，软骨细胞去分化能力有限，胚胎干细胞受到伦理、法律等方面的制约，而间充质干细胞因其自体来源、易扩增、具有软骨分化潜能而受到广泛重视。但目前应用组织工程方法修复关节软骨缺损的效果存在一定的争议，主要是远期功能距离临床应用存在一定差距，在修复组织结构和生物力学方面还需要进一步研究。文章对目前研究较多的几种间充质干细胞及其最新应用进展做一综述。
3 临床应用的意义：通过体外获取并大量增殖种子细胞，种植至来源广泛、可大量生产并可任意塑形的生物材料上，在体外构建成为细胞-三维支架复合物，进而植入体内修复各种关节软骨缺损。生物材料问题已得到有效解决，因此，种子细胞来源和加快其增殖等问题便成为关节软骨组织工程研究中亟待解决的关键问题。

基金资助：
上海市自然科学基金项目(14ZR1433100)

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