角膜组织工程研究的丝素蛋白/壳聚糖支架：理论进展与应用转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0074

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (6): 952-957.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0074

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角膜组织工程研究的丝素蛋白/壳聚糖支架：理论进展与应用转化

王嘉琪，张文芳

兰州大学第二医院眼科，甘肃省兰州市 730030

收稿日期:2017-12-09 出版日期:2018-02-28 发布日期:2018-02-28
通讯作者: 张文芳，博士，主任医师，兰州大学第二医院眼科，甘肃省兰州市 730030
作者简介:王嘉琪，男，1991年生，甘肃省天水市人，汉族，兰州大学在读硕士，医师，主要从事角膜修复研究。
基金资助:
甘肃省重大疾病研究课题(201405)

Silk fibroin/chitosan scaffolds for corneal tissue engineering: theoretical development and applications

Wang Jia-qi, Zhang Wen-fang

Department of Ophthalmology, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730030, Gansu Province, China

Received:2017-12-09 Online:2018-02-28 Published:2018-02-28
Contact: Zhang Wen-fang, M.D., Chief physician, Department of Ophthalmology, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
About author:Wang Jia-qi, Studying for master’s degree, Physician, Department of Ophthalmology, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
Major Disease Research Program of Gansu Province, No. 201405

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

ABCG2蛋白：ABCG2作为一种转运蛋白，在维持细胞自身稳定及机体正常生理功能等方面起着重要作用，随着干细胞研究的不断深入，发现它直接参与了干细胞特性即SP表型的形成，并且与肿瘤干细胞的多药抗性及肿瘤的发生和临床治疗密切相关。

角膜缘干细胞：角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，角膜上皮的更新及创伤愈合有赖于角膜缘干细胞的增殖、移行。

背景：角膜炎、化学伤、创伤和其他疾病往往导致角膜组织不可逆的损伤，留下纤维瘢痕进而最终导致视力下降甚至视力丧失。角膜移植是唯一的治疗途径，但供体的缺乏限制了其应用，此外其他替代材料制备复杂且价格昂贵。丝素蛋白和壳聚糖是组织工程领域常用的材料，制备成生物支架的技术已日趋成熟，得到了广泛应用，但在角膜修复领域尚处于起步阶段。

目的：系统分析丝素蛋白/壳聚糖支架材料应用于角膜修复领域的相关文献，为进一步研究和促进其修复角膜时的临床应用提出新方向和理论支持。

方法：以“丝素蛋白，壳聚糖，角膜，角膜修复材料”为中文关键词，以“silk fibroin，chitosan，cornea，keratoprosthesis，scaffold”为英文关键词检索CNKI，万方以及PubMed数据库有关角膜修复材料的相关文献，追踪以丝素蛋白/壳聚糖作为修复材料在角膜组织工程领域的发展过程，并分析其应用现状及前景。

结果与结论：初步检索178篇文献，最终纳入52篇符合标准的文献进行综述。①丝素蛋白/壳聚糖支架作为缺损角膜的修复体，细胞毒性低，生物相容性良好；②丝素蛋白/壳聚糖支架为角膜细胞提供了适宜的细胞外环境，有利于角膜细胞的水电解质交换；③ABCG2蛋白的检出，提示支架为角膜缘干细胞的增殖提供了可能；④大量的动物模型实验表明该支架几乎不会引起角膜细胞的炎症反应，这对于维持角膜组织的透明性有重要意义；⑤由于供体角膜的缺乏，寻找新型的人工材料修复损伤角膜是角膜移植领域的发展方向，而丝素蛋白壳/聚糖支架具有巨大的潜力，值得深入研究。

ORCID: 0000-0002-3152-2798(王嘉琪)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 丝素蛋白, 壳聚糖, 生物支架, 角膜损伤, 组织修复, 人工角膜, ABCG2蛋白, 生物相容性, 细胞毒性, 综述

Abstract:

BACKGROUND: Keratitis, chemical injury, trauma, and other diseases often lead to irreparable damage to the corneal tissue, which can cause scars and finally vision loss. Corneal transplantation is the only way for treatment, but is of limit use by the deficiency of donors. Moreover, biosynthetic implants are expensive and complex. Silk fibroin and chitosan are common materials for tissue engineering and have been widely used as bio-scaffold materials. However, the technology applied in corneal repair is still in infant stage.

OBJECTIVE: To systemically analyze the literature regarding the application of silk fibroin/chitosan scaffold materials in corneal repair, and to offer new directions and theoretical support for further studies on corneal repair.

METHODS: A computer-based search of CNKI, WanFang and PubMed was performed for relevant articles with the keywords of “silk fibroin, chitosan, cornea, keratoprosthesis, scaffold”. Then, we traced the development progress of silk fibroin/chitosan scaffolds in corneal repair and summarized its current applications and prospects.

RESULTS AND CONCLUSION: In total, 178 articles were preliminarily retrieved, and finally, 52 eligible articles were reviewed. (1) The silk fibroin/chitosan scaffold for corneal repair has low cytotoxicity and good biocompatibility. (2) This kind of scaffold supplies proper pericellular environmental for corneal cells that is good for hydroelectrolyte exchange. (3) The presence of ABCG2 protein implies that the scaffold offers possibilities of limbal stem cell proliferation. (4) Increasing animal model tests have shown that the scaffold can barely cause an inflammatory reaction of corneal cells, which is highy important to remain the vitreousness of corneal tissues. (5) Because of the deficiency of corneal donors, searching for new artificial materials for corneal repair is the developing direction of corneal transplantation. Silk fibroin chitosan scaffold has huge potential in this area, and it deserves more researches for clinical use in the future.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Silk, Chitosan, Materials Testing, Corneal Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王嘉琪，张文芳. 角膜组织工程研究的丝素蛋白/壳聚糖支架：理论进展与应用转化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(6): 952-957.

Wang Jia-qi, Zhang Wen-fang . Silk fibroin/chitosan scaffolds for corneal tissue engineering: theoretical development and applications[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(6): 952-957.

图/表（结果） 1

2.1 丝素蛋白/壳聚糖复合支架制备方法目前该复合支架的制备主要有两种方法：一种是冷冻干燥法，另一种是乙醇浸泡法。

2.1.1 冷冻干燥法^[16] 将家蚕丝于无水碳酸钠中煮沸脱胶并烘干拉松，在75 ℃时置入三元溶液中，搅拌制备纤维溶液，随后经透析得到纯化的丝素蛋白溶液。将其配置为2%的浓度后加入2%的壳聚糖混合而成。利用超声脱去混合液的气泡，置于-80 ℃冷冻12 h，待冻制品完成后，干燥24 h。最后将样品于甲醇中处理，使其产生β-折叠，此时，材料具备疏水性并且韧性增加。用去离子水反复洗涤并再次冷冻干燥，最终制得复合支架。

2.1.2 乙醇浸泡法^[17] 将蚕丝在高温碳酸氢钠液中脱胶，并于真空箱中烘干，随后将制备出的脱胶丝于溴化锂水溶液中溶丝过滤。3 d内不间断的去水离子透析去除溴化锂后离心保存。将制备好的再生蚕丝溶液置于烧杯中低速搅拌，同时逐渐加入壳聚糖醋酸水溶液，继续低速搅拌而成共混液后于-20 ℃冷冻24 h。随后转移置于-5 ℃的乙醇溶液里长时浸泡，待到共混支架结构成熟时，多次洗涤去除乙醇并用碳酸氢钠中和掉支架里的醋酸，即得到高孔隙的复合支架.

2.2 丝素蛋白壳聚糖复合材料理化性质丝素蛋白与壳聚糖互为改性，Hirano等^[18]通过电镜扫描指出，混入了壳聚糖的丝素蛋白支架的孔隙结构比单纯的丝素蛋白的孔隙结构更加均匀有序，这是因为壳聚糖抑制了丝素蛋白的片层结构。Park等^[19]指出，丝素蛋白壳聚糖复合支架的内部为三维多孔结构。Kweon等^[20]的研究表明，壳聚糖以合理的比例加入丝素蛋白后，其理化性质得到增强。

2.2.1 孔径大小柳磊等^[21]实验显示，除了纯丝素蛋白因为溶蚀率高而无法计算其孔径大小外，无论壳聚糖和丝素蛋白以何种比例进行配比，其孔径率均高于90%，合适的孔径大小是细胞黏附的结构基础。当壳聚糖含量比重大时，复合材料的孔径会变小，连通性差，而丝素蛋白含量比重增大时，其孔径增大但却向着片层结构发展^[22]。因此当二者以60%丝素蛋白和40%壳聚糖比例混合制备时，该复合支架的连通性较好且孔径大小合理，为(210±23.71) μm。

2.2.2 吸水性张霞只等^[16]的实验指出，当壳聚糖与丝素蛋白的在混合材料中的质量比例为1∶2时，该材料的吸水率最高，约为37%，而随着丝素蛋白比例的增加，吸水率降至30%。作为角膜组织工程的材料，其渗透性能受到平衡含水量的影响^[22]。植入角膜后，材料前表面接触到泪液，后表面与前房房水相同，低吸水性导致外液中的阳离子因为较高的渗透压向材料转移从而形成自身沉淀，导致支架的脆性增加。

2.2.3 力学强度作为角膜修复的材料，应当具有一定的力学强度来对抗眼压。丝素蛋白的力学性能要优于壳聚糖，当壳聚糖成比例地加入丝素蛋白中，复合材料的力学强度也较纯丝素蛋白下降^[23]。Ruan等^[24]的实验表明，纯丝素蛋白的压缩模量为(7.51±0.19) kPa，当壳聚糖与丝素蛋白的混合比例为1∶8时，压缩模量降低到(6.36±0.69) kPa，而当二者比例为1∶2时，其压缩模量为(4.70±0.14) kPa。正常眼压的上限为2.80 kPa，因此，二者成比例制备时，随着壳聚糖相对质量的增加，其力学强度也将相应的下降(表1)。

2.2.4 生物降解速率良好的生物支架，其降解速率应与角膜细胞的生长速率吻合。Kang等^[25]的研究表明，当复合支架的配成比为40%丝素蛋白和60%壳聚糖时，在最初的15 d里，该复合材料迅速失去了14.43%的原始重量，随后降解速率开始减慢，在第64天里时，材料仅仅失去了18.25%的重量，其降解速率方程拟合曲线与人体组织的新生率相匹配。Baran等^[26]指出，最开始降解速率快的原因可能是因为来自壳聚糖的降解反应。同时，在材料降解的两个月的时间段内，其降解液的pH值始终波动在7.42-7.62之间，与人体微环境的类似^[27]。

2.2.5 合理的制备比综合各实验结果，在统筹考虑复合支架的吸水率，力学强度，降解率等方面，壳聚糖与丝素蛋白的配成比随着壳聚糖的增加，其力学性能下降，吸水率升高，但考虑到生物降解的合理曲线，二者的构成比为1∶1至1∶1.5时，各项指标满意^[25]。

2.3 丝素蛋白壳聚糖复合材料的生物相容性支架材料与人体组织的生物相容性是衡量其实际效用的关键，目前通常采用接种成纤维细胞株或者间充质干细胞在支架材料上观察其细胞毒性、增殖活力以及黏附作用，再通过电镜扫描观察细胞株的生长情况来评价支架的生物相容性^[28]。

2.3.1 细胞毒性 Sha等^[29]利用细胞毒性相对增殖率对支架材料的细胞毒性进行分级。叶鹏等^[30]利用丝素蛋白壳聚糖构建的生物支架于兔骨髓间充质干细胞进行体外共培养，分别置于25%，50%以及100%的支架浸提液中，观察24，48以及72 h，经测定相对增殖率值均大于100，根据细胞毒性反应分级标准，其结果均为合格。

2.3.2 增殖活力佘荣峰^[31]通过提取第3代经诱导后的间充质干细胞接种于丝素蛋白壳聚糖支架中，培养箱中培养并加入MTT，孵化4 h滴入盐酸异丙醇，通过ELISA测定吸光度并采用扫描电镜观察，随着时间的推移，细胞在支架上的数量逐渐增加，分裂增殖速度正常。其机制可能与天然生物材料可以促进细胞增殖有关^[32-33]。

2.3.3 黏附作用刘宁华^[34]通过制备脂肪干细胞植入丝素蛋白壳聚糖支架中，培养3 d后取出通过扫描电镜观察，结果显示脂肪干细胞形态呈现长梭形，表面光滑，足突伸出与丝素蛋白壳聚糖支架相互黏附，作用紧密，而细胞彼此之间也通过伪足相联。

2.3.4 植入角膜的生物相容性 Thuaksuban等^[35]指出，不同来源的细胞和同一支架的相容性不同，在角膜组织工程中，植入是否成功在于保持角膜细胞的高度分化性和良好的胶原产生能力。关于这点，Lawrence等^[36]提出，良好的角膜移植吻合口，应当具有相对平滑的细胞外基质，而大部分的支架材料，很难使角膜细胞保持表面静止。Gil等^[37]的研究表明，将支架的结构制备为单孔或者多孔的膜状多层组织，其移植结果令人满意。Bray等^[38]的研究表明，利用丝素蛋白和壳聚糖混合制备的支架，不仅有助于多孔结构的重建，而且会提供一个类似角膜细胞外基质的微环境。

2.4 丝素蛋白壳聚糖支架在角膜组织工程的应用进展 Guan等^[39]研究表明，壳聚糖的含量影响着角膜细胞的附着能力，当丝素蛋白和壳聚糖的比例为3∶1的时候，此时支架细胞液中的角膜细胞的黏附力最强，呈现球形三维结构，培养第7天时，角膜细胞对数生长，然而在第14天时，部分细胞生长停滞，推测其原因，可能是因为壳聚糖提供的过于宽敞的结构，导致了细胞处于静止状态。在实验期内，角膜细胞里未检出CD4/CD8的表达，提示复合支架与角膜不会发生排斥反应。后期其课题组利用15只新西兰兔构建出了角膜缺损模型，并将兔角膜上皮细胞和基质细胞种植在丝素蛋白/壳聚糖支架中，制备出体外共培养的材料，将其植入缺损模型中。结果显示，在一开始，构建的角膜并不像兔眼本身的角膜那样透明，苏木精-伊红染色显示，细胞并未皱缩，细胞排列也较为规整；在培养第7天时，细胞呈现树突样的形态，并成功在支架孔隙并形成了网状纤维样结构；在培养14 d后细胞还呈现出叠加的双层片状结构；随后利用Western Blot定量分析的结果显示，丝素蛋白壳聚糖细胞培养物高表达角蛋白。随访期间内，所有实验兔眼的植入部位未感染，置于裂隙灯下也未发现角膜出现新生血管。丝素蛋白壳聚糖支架在4个月之间完全降解，角膜透明度也逐渐恢复，结果表明重建层的角膜结构与天然角膜相似，角膜上皮的K3/12基因高表达，证明支架裙边结构和角膜组织没有发生免疫反应^[40]。

Kim等^[41]在对丝素蛋白壳聚糖支架进行制备的时候发现，将细胞接种在壳聚糖质量占5%的混合支架后，通过分光光度计测定，在该比例下，支架材料的透明度最佳；并指出，虽然壳聚糖质量占5%的混合支架具有良好的透明度，但是其角膜内皮细胞数量为(236±13)细胞/mm²，显著低于壳聚糖质量占1%的对照组(327±42 细胞/mm²)，这一结果表明，壳聚糖的含量影响着角膜内皮的细胞密度；另外，移植支架产生了类似细胞外基质般可进行钠钾阳离子交换的功能，通过对NaK标记物的对比，在壳聚糖质量占3%的对照组中高表达。大量研究指出角膜内皮细胞密度对角膜的增殖至关重要，当数量减少以及分布不均匀时，其功能开始丧失^[42-44]。Yee等^[45]指出NaK标记物的表达与水分子的渗透效率以及控制水肿并维持角膜透明有关，并发现维持壳聚糖在3%的水平时，角膜更为透明。

Hazra等^[46]将从大鼠角膜上获得的角膜外植体在丝素蛋白壳聚糖支架上进行培养，在第4天时，观察到支架中的角膜上皮细胞开始分裂，并附着于支架上向远端迁徙，随后逐渐覆盖模型的缺损部位。Paiva等^[47]通过免疫组化测定，发现角膜细胞膜上高表达ABCG2蛋白，表明支架支持角膜缘干细胞的生长。在进行兔眼的动物实验环节时，与Hazra等实验不同之处在于，其未将兔眼角膜细胞培养后接种在支架上再进行移植，而是直接将丝素蛋白壳聚糖支架直接植入构建的损伤模型中。在裂隙灯下观察，植入后兔眼耐受良好，透明度良好，虹膜清晰可见，两个月内支架材料未发生降解。

Wang等^[49]的实验证明了丝素蛋白壳聚糖支架在角膜生物相容性方面的肯定性价值。但是他的实验里发现了一例新生血管的形成，不过在第30天的时候消失。证明丝素蛋白壳聚糖支架的植入也是可以短暂的引起炎症反应的，这与前述几位作者的实验结果不尽相同，其炎症刺激机制尚需更加深入的研究去阐明。同时，其也特别指出，该类支架会影响角膜基质的渗透能力，并引起角膜上皮变薄。

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引言

角膜作为人眼重要的光学结构，其透明性直接关乎视觉效果，一旦损伤或瘢痕化，往往需要依靠角膜移植来得以解决。就目前医疗现状而言，用以移植的供体量并不能满足需求^[1]。而诸如人重组胶原130型或去细胞的猪眼角膜，其制备过程复杂，价格昂贵，临床应用有限^[2-3]。因此寻找新型的替代材料，具有现实意义。角膜组织工程是近些年来发展起来的一门交叉学科，利用生物学、材料学、临床医学等知识，以期建立由生物材料构成的具有良好生物相容性的复合支架^[4]。在这一领域，有学者使用不同比例的丝素蛋白和壳聚糖用来构建软骨组织，也利用该复合材料来修复重建切除肿瘤后的缺损部位^[5-7]。但在角膜组织工程里，鲜有利用^[8]。

丝素蛋白由家蚕吐丝获得，是自然界中较为容易获取的原材料，其成分主要为甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，经过其二级分子结构的β折叠，形成以10-15 nm为基础的纤维，具有优良的力学强度和韧性^[9]。目前干燥冷冻法是其主流的制备方式，但冷冻过程中会形成自然片层，影响其孔径结构^[10]。壳聚糖是甲壳素脱乙酰作用后的产物，是自然界唯一的正电多糖，在体内可降解吸收，生化性质类似人体内的黏多糖，与大分子亲和力高，能够溶解于稀酸，具有渗透水性和良好的生物相容性，亦具有一定程度的广谱抗菌性^[11]。以壳聚糖为支架，可以抑制纤维细胞的增殖，并促进上皮细胞分化，是理想的角膜组织工程材料^[12]。在角膜组织工程相关领域，二者在单独使用时具有诸多缺点。丝素蛋白的力学性能并不理想，孔径粗大，容易断裂甚至降解；而壳聚糖因其表面的正电荷作用，会阻碍角膜上皮细胞的生长，并且其韧性差缺乏弹性，降解速率快^[13-14]。有研究者指出，将二者成比例混合，构建新型复合材料，是更理想的组织工程领域的支架材料^[15]。

因此，文章系统地梳理丝素蛋白壳/聚糖支架材料应用于角膜修复领域的相关文献，从复合材料的制备，理化性质，生物相容性等方面进行总结，为进一步研究和促进其修复角膜的临床应用提出新方向和理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

讨论

角膜由于其损伤后的不可逆性，一旦瘢痕化，势必影响其光学质量。就目前而言，角膜移植是唯一治愈的方法。然而，供体角膜的缺乏，限制了其临床应用。大量的实验表明丝素蛋白/壳聚糖复合支架用以修复缺损的角膜，具有广阔的应用前景。该复合支架移植于角膜后，因其较低的细胞毒性和生物相容性，角膜细胞在支架里增殖良好，内皮计数可观，支架所提供的孔径结构给予了角膜细胞的良好的外环境，有助于水电解质的交换，维持角膜的透明度。未来，应当继续优化支架的孔径形态及大小，这对维持支架的透明性和降解率至关重要，也是未来研究方向的技术难点。并且，检出的高表达ABCG2蛋白也足以说明，支架为角膜缘干细胞的增殖分化提供了可能。在前人的实验中，该支架均未引起角膜严重的炎症反应，这表明，角膜组织对丝素蛋白壳聚糖支架具有令人满意的耐受性。

目前，丝素蛋白/壳聚糖复合材料在骨组织工程皮肤脂肪组织工程已初见应用，然而在角膜组织工程里，尚处于起步阶段^[49]。究其原因，是因为制备方法尚不成熟，而且由于壳聚糖水溶性的限制，在制备过程中添加了一些诸如甲酸，乙酸等溶剂，如此，所制备支架用于人眼必然存在一定的隐患。陈忻等^[50]等通过羟丙基修饰壳聚糖，使其表现出优异的水溶性，在未来，用羟丙基壳聚糖代替壳聚糖来和丝素蛋白配伍制备新型的复合材料，前景广阔。

随着现代科技的发展，3D打印技术已经走进生活的方方面面，在组织工程领域也初见应用^[51]。Fedotov等^[52]指出，利用3D打印技术，可以很好地将壳聚糖和丝素蛋白以任何比例均匀混入进行打印制备，但其制作成本高昂，实验室方法尚处于摸索阶段，离实际应用还由一定的距离，但这一方法也开辟了新思路，在组织工程材料领域，面对制备方式繁杂的支架，3D打印将另辟蹊径。

就目前而言，还没有哪一种材料能够真正替代捐献的角膜，完成损伤修复，但以壳聚糖以及丝素蛋白优异的表面改性，通过合理的修饰以及混合比例，使其成为角膜细胞生长的支架，发挥良好的生物相容性，适配的降解速率，满意的裙边结构和力学强度，具有巨大的潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

角膜组织工程研究的丝素蛋白/壳聚糖支架：理论进展与应用转化

Silk fibroin/chitosan scaffolds for corneal tissue engineering: theoretical development and applications

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