大分子拥挤试剂对细胞外基质作用机制及尚待证实的不利因素

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0073

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文题释义：

细胞外基质：是指一个富含糖蛋白、蛋白聚糖和黏多糖的“网络”结构，作为支持细胞的黏附和生长一致的组织。过去细胞外基质通常被认为是组织的结构支架，但现在人们很清楚地表明，细胞外基质在控制细胞黏附、迁移、生长和分化方面都起着很关键的作用，而这些是通过细胞内的信号通路调节的。

大分子拥挤：就是细胞内外一种理想化的生理环境特征，是由各种各样具有多分散性的惰性大分子在培养媒介中占据一定的空间形成，由此形成了部分体积占用，也就是大分子占据总细胞体积的分数，而这种现象是通过一种“排斥容积效应”发挥作用的。

背景：大分子拥挤试剂对细胞外基质成分中的胶原蛋白、糖胺聚糖、生长因子等都会产生一定的影响。

目的：总结大分子拥挤试剂对细胞外基质的影响，以及这些大分子拥挤试剂在各种细胞或组织中的应用。

方法：应用计算机检索PubMed、NCBI、中国知网数据库2001至2017年的文献，中、英文检索关键词为“Macromolecular crowding，MMC，Tissue Engineering，Collagen；大分子拥挤，细胞外基质”，总结大分子拥挤试剂在细胞外基质中及组织工程中的应用进展。

结果与结论：大分子拥挤试剂可通过排斥容积效应增加细胞外基质成分的沉积，如胶原、糖胺聚糖及生长因子等，促进成骨细胞的黏附、迁移、生长和分化，促进骨组织工程中再生医学的发展。但是，大分子拥挤试剂还有很多尚未被发现或证实的作用及作用机制，将其应用到人体是否会产生毒性作用还尚未证实，这些问题都需要大量的实验研究去证实。

ORCID: 0000-0002-0447-1833(耿英楠)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 大分子拥挤, 生物大分子, 拥挤环境, 排斥容积效应, 细胞外基质, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Macromolecule crowding agents exert a certain effect on collagen, glycosaminoglycans and growth factors in the extracellular matrix.

OBJECTIVE: To summarize the effects of macromolecule crowding agents on the extracellular matrix and their applications in various cells or tissues.

METHODS: “Macromolecular crowding, MMC, Tissue Engineering, Collagen” were used as key words to retrieve articles addressing the application of macromolecular crowding agents in the extracellular matrix and in the tissue engineering in PubMed, NCBI, CNKI from 2001 to 2017.

RESULTS AND CONCLUSION: Macromolecule crowding agents can increase the deposition of extracellular matrix components, such as collagen, glycosaminoglycans and growth factors, to promote osteoblast adhesion, migration, growth and differentiation, as well as to promote the development of regenerative medicine in bone tissue engineering. However, some roles and mechanisms of macromolecule crowding agents have yet to be found or confirmed, and whether they can produce toxic effects in the human body has yet to be confirmed. Therefore, further experimental research on these problems is warranted.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Extracellular Matrix, Macromolecular Substances, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

耿英楠，吴鼎宇，张智勇，韦敏. 大分子拥挤试剂对细胞外基质作用机制及尚待证实的不利因素[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(6): 945-951.

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图/表（结果） 4

2.1 什么是大分子拥挤？它是如何作用的？事实上，大分子拥挤就是细胞内外一种理想化的生理环境特征，是由各种各样具有多分散性的惰性大分子，在培养媒介中占据一定的空间形成，由此形成了部分体积占用^[23]，也就是大分子占据总细胞体积的分数，而这种现象是通过一种“排斥容积效应”(图2)发挥作用的。“排斥容积效应”最早也是由 Minton提出的，它强调源于空间排斥的纯物理非特异性效应^[5，24-26]，细胞总体积有很大一部分被大分子占据，因而这些被占据的体积不能被其他分子利用，从而使每一个大分子的实际有效空间显著减少，并使分子内和分子间作用受到影响，促进或减弱相应的化学反应。后来，Minton对空间排斥力和化学作用对大分子拥挤的相关作用进行了定量研究，结果发现二者是共同影响大分子拥挤的^[27-28]。

2.2 大分子拥挤试剂的应用

2.2.1 以前试验中用到过的大分子拥挤试剂有研究证明，一些大分子比如角叉聚糖(相对分子质量550 000)、硫酸葡聚糖(相对分子质量500 000)、聚蔗糖(相对分子质量70 000/400 000)等不仅使细胞外基质成分增加了80倍^[29]，而且保持了永久的细胞分化表型，即使是在培养液和血清浓度很低的培养条件下也能达到这种状态。此外，4-苯乙烯磺酸钠聚酯(相对分子质量200 000)和聚乙烯吡咯烷酮(相对分子质量40 000/360 000)也都在实验研究中应用过^[23，30]。其中，聚乙烯吡咯烷酮是一种比较新颖的很有趣的复合物，已被广泛应用到医药和食物加工生产中，并且在细胞培养和组织工程领域具有创新性很大的广阔前景。

为了更好地了解大分子拥挤，作者对一些大分子拥挤试剂的特性做了总结，包括相对分子质量、流体动力学半径(nm)、电荷性质、有效作用浓度及它们所产生的占有体积等，见表1。

2.2.2 大分子拥挤试剂被应用到的细胞或组织类型见表2。已有很多研究用人体骨分离出来的骨髓间充质干细胞实验，证实了大分子拥挤试剂对细胞外基质的影响^[7，31-32]。但是，成纤维细胞因其良好的生活习性及低要求的生长条件而得到了更广泛的应用^[33-37]，包括人类皮肤成纤维细胞、人肺成纤维细胞、人角膜成纤维细胞和声襞成纤维细胞^[38]。此外，人成骨细胞和肌腱细胞及角质形成细胞都曾被应用到实验研究中^[6，39]。而且在此之前，还有研究人员用猪的软骨细胞来研究大分子拥挤试剂对细胞外基质的作用，以及软骨细胞的生长和细胞外基质的关系^[40-41]。有意思的是，有一篇文章对大分子拥挤试剂对间充质干细胞的作用做了新的阐述，证明它可通过调节细胞微环境来增强人间充质干细胞向脂肪组织的分化^[42]；另外一篇文章表示，大分子拥挤试剂可通过调节解偶联蛋白的表达和非偶联呼吸作用，增加人类骨髓间充质干细胞向棕色脂肪细胞的分化，并且能使人类骨髓间充质干细胞来源的白色脂肪细胞“棕色化”^[43]，这将为婴幼儿的产热功能缺失提供一种新的解决思路。

2.3 大分子拥挤试剂增加细胞外基质成分

2.3.1 大分子拥挤试剂增加细胞外基质胶原含量迄今为止，大分子拥挤试剂已被应用于各种各样的细胞，来促进细胞外基质成分及含量的增加，主要是通过增加细胞外基质中成分的沉积、促进细胞外基质的稳定、重塑及成熟，具体来说，可能是通过以下途径作用的^[23]。①增加前胶原C内肽酶增强子1酶促转化，增强前胶原C蛋白酶变构调节剂的活化形式，从而增强前胶原C蛋白酶的酶活性，进而促进胶原前体向胶原的转化，最终有利于超分子(纤连蛋白、胶原蛋白及原纤维蛋白等)的组装；②增强赖氨酰氧化酶和转谷氨酰胺酶2的活性，从而增加胶原的交联，稳定细胞外基质；③通过增加前胶原C内肽酶增强子1酶促转化来增强基质金属蛋白酶抑制剂的活性，然后增强基质金属蛋白酶/TIMP的行为及相互作用，以便减少胶原的降解或增加细胞外基质特定的重塑。总的来讲，大致经过这3个过程来促进细胞外基质的成熟。

在这里概括了这些大分子拥挤试剂及相应的细胞。首先总结了大分子拥挤试剂对细胞外基质中胶原的影响，包括Ⅰ-Ⅵ胶原蛋白。其中，聚蔗糖70与聚蔗糖400混合物应用得最多，它改变最多的是Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白的含量；卡拉胶应用也很广泛，而它对与Ⅰ-Ⅵ胶原蛋白都有所影响，另外，硫酸葡聚糖500增加的也主要是Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白。

2.3.2 大分子拥挤试剂对细胞外基质其他成分的影响

大分子拥挤试剂对间充质干细胞来源细胞外基质中糖胺聚糖的影响：糖胺聚糖在细胞外基质信号通路中扮演着很重要的角色，它调节生长因子和形态发生素的表达。加入大分子拥挤试剂后，随着Ⅰ型胶原的积累，糖胺聚糖的量也大量增加，二者共同创造了一个增厚相对无弹性的细胞外基质。未硫酸化的透明质酸是相对分子质量最大的一类糖胺聚糖，本身就占据着细胞微环境内很大一部分，因此它在含有大分子拥挤试剂的培养液中的分泌量有所减少。然而，其他硫酸化的糖胺聚糖(硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素)在大分子拥挤环境中的沉积量却显著增长^[32]。最后他们对细胞外基质进行消化并分析了其中硫酸化糖胺聚糖的总含量，发现它们在加入大分子拥挤试剂后显著增加了。

大分子拥挤试剂对生长因子的作用：间充质干细胞来源的细胞外基质释放了各种各样的生长因子和细胞因子，为细胞的生长分化提供营养^[22]。之后，又有研究证明大分子拥挤试剂增强的细胞外基质，能提升一些生长因子如成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的蓄积量，同时又能增加干细胞生长因子的释放量^[32]，从而证实了大分子拥挤试剂对基质中生长因子的重大调节作用。目前已有研究在探寻增加细胞外基质中生长因子和蛋白酶释放的途径，以便在组织工程中得以应用^[44]。

大分子拥挤试剂加速超分子的重新组装：过去几年，人们对超分子的重新组装已进行过研究，他们应用荧光标记Ⅰ型胶原末端来隔离超分子的重新组装过程，结果发现有荧光标记的胶原数量在大分子拥挤环境下的细胞外基质中显著增加，同时也证明了大分子拥挤试剂加速胶原中超分子的重新组装^[35，45-46]。此外在体外培养条件下，大分子拥挤试剂还会引起细胞外基质蛋白沉积物的直线排列，这又反过来促进细胞内肌动蛋白细胞骨架的直线排列^[7]。而且，外部的震动更加有利于呈直线排列的三维胶原纤维支架的构造^[47]。细胞和细胞外基质之间的相互作用的变化也会影响间充质干细胞的黏附、增殖和迁移行为。还有研究报道大分子拥挤试剂加速角膜成纤维细胞基质样组装体的形成，但容易受到表型漂移的影响^[35]。

2.4 大分子拥挤试剂的一些负面效应过去几十年，大量报道都一直在关注大分子拥挤试剂的正面作用，但事实上，它对像蛋白质和酶也有一些负面影响^[48-51]，例如，大分子拥挤试剂会导致细胞内环境微黏度增加、异常的扩散作用及加速蛋白的聚集^[52-54]，降低蛋白的弹性、限制其空间构象，妨碍生物学上蛋白质-蛋白质的相互作用，从而使机体发生异常变化，产生一系列的疾病问题。目前，有很多工业和食品生产中也会经常用到一些大分子拥挤试剂，改善食品的口感和形态，来迎合大众的生活需求。这虽然丰富了人们的物质生活，但是过量地使用这些大分子，终究会对人体的健康造成一定的危害。因此，大分子拥挤试剂并不总是有利的，需要人们理性对待。在此，通过查找一些相关文献，总结了它对其他大分子的性质及生物学过程的一些不利影响(图3)。总而言之，在拥挤的生理环境中，不同的大分子对邻近蛋白和细胞都会产生各种不一样的影响，很大可能是通过改变部分占用体积来改变拥挤程度，从而调节这些大分子的性质。因此，作者认为体内的生物大分子可很好地被调节，并且细胞内的拥挤分子也能适当地发挥生物学作用。而这个作用是可被调节的，当然方式也是多种多样的，但是，最终还是归结于我们前面提出的“部分占用体积”与“排斥容积效应”。

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引言

一般来说，很多的生物大分子(像蛋白质、核酸、核糖体、碳水化合物)都在拥挤的细胞内环境中发挥作用，它们在细胞内可以达到100-1 000 g/L的质量浓度。例如，大肠杆菌内蛋白质和核糖核酸的总质量浓度可达到300-400 g/L^[1]，而这些大分子占据了总细胞体积的很大一部分，可达40%^[2-3]。事实上，这是不可明视但又不可忽略的一种现象^[4]。这样的媒介就被称为“大分子拥挤环境”，但并不仅仅是简单的浓度很高的表现，因为单一的大分子即使浓度很高也不能造成这样的拥挤环境。“大分子拥挤环境”这个术语最早是由 Minton和Wilf^[5]在1981年提出的，他们为拥挤环境对大分子的影响创造了一个新的里程碑，并应用到了理论和实验研究中。随着大分子拥挤环境的提出，造成这种拥挤状态的试剂也就应运而生，即大分子拥挤试剂。

目前，已有很多种大分子拥挤试剂被运用到实验研究中，并取得了很显著的结果。其中，改变最大的是细胞外基质中胶原蛋白的含量，大分子拥挤试剂可通过增加前胶原蛋白酶和变构调节的蛋白水解作用，促进胶原前体向胶原的转化^[6]。然后，通过大分子拥挤与几何限制诱导胶原联合形成一种简单、快速产生具有高度直线排列性、各异向性的胶原纤维板^[7-8]。因此，大分子拥挤环境已被证实对单层细胞培养条件下的细胞外基质具有很重要的意义。除了胶原，大分子拥挤环境对细胞外基质中其他蛋白质也有一定的影响，但要取决于蛋白质-蛋白质的相互作用与“排斥容积效应”之间的较量^[9]。另外，大分子拥挤环境有助于重构细胞内囊泡反应，以便于进行其他研究^[10]。当然，大分子拥挤环境也有其不利的一面，它会加速一些蛋白的聚集、降低酶的活性等，还可以作为一种非特异性的伴侣分子，调节蛋白的空间构像^[11]，从而形成一些无序蛋白，造成蛋白质相关的疾病。

另一方面，人体大约由411种不同的细胞类型组成，而这些细胞大都在一种叫细胞外基质的微环境中生长、黏附和迁移。近年来科学家们对细胞疗法投入了大量研究，希望能为临床疾病提供一些新的解决思路，同时也对细胞外基质有了更加深入的了解。

细胞外基质是指一个富含糖蛋白、蛋白聚糖和黏多糖的“网络”结构，作为支持细胞的黏附和生长一致的组织。过去细胞外基质通常被认为是组织的结构支架，但现在人们很清楚地明确，细胞外基质在控制细胞黏附、迁移、生长和分化方面都起着很关键的作用，而这些是通过细胞内的信号通路调节的。细胞外基质富含各种各样的生物大分子，主要是蛋白多糖、糖蛋白和纤维3大类，且各自具有一定的特征和作用。其中含量最多的是纤维中的胶原纤维，由胶原蛋白构成，此外细胞外基质还含有大量的网状纤维和弹性纤维。糖蛋白的种类很多，通常以单体或多聚体的形式出现，包括纤维连接蛋白、层粘连蛋白、韧性素、玻璃黏附蛋白、制动素、着位素、锚定素、血栓促织素、软骨粘连蛋白等^[12]。蛋白多糖则是由蛋白核心与连接在核心上的多条线性氨基葡聚糖组成，按其功能结构可分为基膜蛋白多糖、透明血凝素类和富含亮氨酸的小分子蛋白多糖3大类。

从最初人们对细胞外基质的研究到现在，大致经历了3个阶段：天然细胞外基质-人工合成的细胞外基质-脱细胞细胞外基质，每一个阶段都有其历史性意义。天然细胞外基质含有丰富的胶原晶格、生长因子和与细胞锚定的区域，以及合适的pH值和CO₂，这也为内环境的稳态和细胞再生提供了保证。细胞外基质在控制细胞黏附、迁移、生长和分化方面都起着很关键的作用，有研究显示在细胞外基质处理过的培养皿中，间充质干细胞的贴壁、增殖和分化速度都较普通组快，且细胞形态活力和长势较普通组活跃^[13]。由此也证明了细胞外基质能明显促进间充质干细胞的增殖分化，使体外扩增培养间充质干细胞更为简单高效。另外，在再生医学的背景下，细胞外基质相当于渗透性细胞的巢穴，为细胞的生长提供源泉，为其再生创造条件。近年来，细胞外基质已被广泛应用于组织工程的再生修复方面，并展现出了广阔的应用前景^[14-15]。但是，随着组织工程再生医学的发展，人们开始将注意力转移到了人工合成的细胞外基质^[16]，使其形成条件更加可控。同样地，早期人工合成的细胞外基质也只是为了提供机械的力学支持，但是现在，人工合成的细胞外基质不仅通过力学结构传送信息，还可通过受体与配体的结合来调节细胞功能。目前，细胞来源的合成细胞外基质支架材料已在组织工程得到了广泛应用，大部分细胞来源于间充质干细胞、软骨细胞和成纤维细胞^[17]。组织学检查和免疫组织化学实验都显示了良好的结果，同时也证明了人工合成细胞外基质确实具有一定的能力，可为组织再生提供条件。当然，这一发现也进一步促进了组织工程再生医学的发展，人工合成的细胞外基质也将成为组织工程的一大有用工具。然而，由于同种异体之间及种属之间具有强烈的免疫排斥反应，想把一种动物的细胞外基质应用到另外一种动物体内并不是一件很简单的事情。近几年来，脱细胞的细胞外基质得到了很多研究学者的关注，并进行了研究^[18-20]。但是，从不同组织或器官获取的细胞外基质具有各自特异的性质，包括胶原类型及其含量、糖胺聚糖成分和脱细胞的过程。例如，从大鼠心肌细胞获得的脱细胞的细胞外基质为大鼠心脏的再生提供了一种新的方法^[21]。数年后，又有研究报道，应用两种不同来源(大鼠和羊)细胞获得的细胞外基质，经过脱细胞然后再细胞化后种植到同一动物(新生鼠)体内也得到了比较满意的实验结果^[18]。由此可以认为，临床上应用脱细胞的细胞外基质支架目的就是尽可能以最小的不利宿主反应来提高组织的再生能力。同时，脱细胞的目的就是获取具有最佳生物学性质的无细胞移植物，例如缺少一些细胞残余物：细胞膜磷脂、蛋白、核酸和线粒体，缺乏免疫原性和细胞毒性^[18]。另外，脱细胞的细胞外基质支架应该具有理想的机械力学和结构性质，以确保其生物相容性。当然，保留细胞外基质的超微结构是脱细胞的最重要目标。

细胞外基质作为细胞生长所不可或缺的生长因子的动态“储蓄池”，在细胞内信号传递及细胞行为的表达方面扮演着重要的角色。细胞外基质在细胞生长发育中的作用是多功能的，能同时影响多种生物化学功能和力学过程(图1)^[22]：①作为细胞黏附的基底物：追踪指导细胞迁移；形成浓度梯度，引导趋向性迁移；②提供结构支架：明确组织之间的界限；提供完整性和弹性，形成器官；在机体生长和发生疾病中，被外来入侵的细胞降解；③为生长因子提呈受体：控制受细胞外基质约束的表面分子的空间分布；促进生长因子受体和细胞外基质受体之间的交流；④隔离并储存生长因子：调节生长因子在时空上的释放；造成形态形成素梯度；在合适的细胞介导力或蛋白降解作用出现时调节生长因子的释放；⑤感受并传导力学信号：指导细胞分化是表现出力学特性；通过细胞和表面受体的相互作用激活细胞内信号；参与细胞骨架的构造并协同加强生长因子信号的作用。其实，这5大功能不是单独起作用的，比如说细胞外基质表型功能缺失时，有可能是多个过程出现了异常，因此想要单独分离收集到细胞外基质的某种成分是不容易的。此外，细胞外基质还有一些很重要的特性：首先，细胞外基质是处于高度动态平衡中的，它可被与之接触的细胞调节，创造一个双向的细胞-基质交流的模式；其次，细胞外基质-细胞外基质之间的相互作用是随细胞外部微环境中的物理化学成分改变而变化的。

总之，细胞外基质和细胞受体之间的相互作用不仅调制着细胞骨架间的物理联接，而且使细胞内外成分的信息得以双向流动。不管是哪种细胞外基质，都在细胞的黏附、迁移、生长和分化及形态发生方面起着很重要作用。因此，寻求一种增加细胞外基质成分及含量的方法，对于实验研究及临床问题的解决是有重大意义的。

而前面提到的大分子拥挤环境对细胞外基质成分中的胶原蛋白、糖胺聚糖、生长因子等都会产生或多或少的影响，因此文章主要就大分子拥挤环境进行介绍，并对这些作用及作用机制做一下阐述，另外对大分子拥挤试剂在其他方面的应用进行展望。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

讨论

胶原主要分布于哺乳动物的结缔组织，对动物和人类的皮肤、血管、骨骼、肌腱、骨、牙齿和软骨的形成很重要，也是这些结缔组织的主要成分。目前已有至少28种类型的胶原被发现^[55]，尤其是Ⅰ型胶原，占骨有机质90%以上，主要在骨中合成，在细胞外基质中分布非常广泛并对骨的形成起着很大作用。实际上，胶原是一种很有用途的物质，胶原特殊的结构使其具有重要的生物作用，显著的低免疫原性、良好的生物相容性、可降解性及止血功能，是胶原作为生物材料的优势之处^[56]，而且它已被运用于大量生物材料来创造可植入的代替品^[57]。令人可喜的是，已有报道证明大分子拥挤试剂可促进形成高度组织化的各向异性的胶原纤维结构，因为胶原分子被限制在一个拥挤的薄层平面几何中，通过物理排斥效应来达到高度线性排列的目的^[58]。大分子拥挤试剂通过增加成核率来促进胶原重新组装，并通过它对纤维直径和孔径大小的影响来调节胶原的生物学特性^[59]。更重要的是，在拥挤条件下，胶原的机械抵抗力是原来的2倍。究其原因就是在这个过程中，尽管纤维直径减少了，但是其数量大量增加，使其具有更强的机械力量。因此，塑造一个拥挤的微环境是优化胶原性质很好的方法。而且，胶原已在骨组织再生领域得到了应用^[60-61]。

前面已讨论过，胶原在骨的形成中是起着一定作用的关键因素，因此，作者认为大分子拥挤试剂可通过增加细胞外基质中胶原含量和其他一些重要成分如糖胺聚糖、生长因子等促进成骨细胞的形成，进而促进骨组织工程中再生医学的发展，同时也为解决一些临床疾病问题提供更好的思路和方法。但是，目前大分子拥挤试剂还有很多尚未被发现或证实的作用及作用机制，另外，虽然这种大分子试剂对细胞外基质具有很好的改善作用，可快速增加其中的重要成分和含量，但是至于将其应用到人体是否会产生毒性作用还尚未证实，这些问题都需要大量的实验研究去证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程