人工颈椎间盘不同涂层影响骨髓间充质干细胞的黏附及分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.022

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1938-1943.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.022

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人工颈椎间盘不同涂层影响骨髓间充质干细胞的黏附及分化

李俊辉¹，俞兴¹，穆晓红¹，徐林¹，王松²，卢俊哲³

1北京中医药大学东直门医院骨科，北京市 100700
2清华大学机械工程系，北京市 100084
3深圳清华大学研究院，广东省深圳市 518057

修回日期:2014-01-04 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 俞兴，博士生导师，主任医师，北京中医药大学东直门医院骨科，北京市 100700 并列通讯作者：徐林，博士生导师，教授，北京中医药大学东直门医院骨科，北京市 100700
作者简介:李俊辉，男，1983年生，河南省浚县人，北京中医药大学在读博士，主要从事脊柱、关节外科研究。
基金资助:
国家科技支撑计划课题(2012BAI18B05)，课题名称：新型人工椎间盘

Effects of different cervical artificial disc coatings on adhesion and differentiation ability of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Li Jun-hui¹, Yu Xing¹, Mu Xiao-hong¹, Xu Lin¹, Wang Song², Lu Jun-zhe³

1Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
2Department of Mechanical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China
3Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen, Shenzhen 518057, Guangdong Province, China

Revised:2014-01-04 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Yu Xing, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China Corresponding author: Xu Lin, Doctoral supervisor, Professor, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
About author:Li Jun-hui, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
Supported by:
the National Key Technology R&D Program of China, No. 2012BAI18B05

摘要/Abstract

摘要：

背景：钛合金人工颈椎间盘具有良好的生物相容性，但钛合金存在生物活性差、与骨结合强度低、在生理环境下易造成金属离子释放等问题。
目的：观察国产人工颈椎间盘钛合金终板不同涂层对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、分化的影响。
方法：将第3代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，接种于含羟基磷灰石涂层、钛粉复合羟基磷灰石涂层的钛合金板及裸钛合金板的24孔板内，培养的第24，48小时后分别终止培养，扫描电镜观察细胞生长情况；接种24 h后加成骨诱导剂进行诱导，并于第3，5，7天各收集细胞裂解后离心的上清，检测碱性磷酸酶表达。
结果与结论：骨髓间充质干细胞与材料复合培养48 h后，羟基磷灰石组和钛粉复合羟基磷灰石组表面的细胞呈多角形，并伸出细长伪足伸入到材料的微孔内，与材料表面紧密黏附；而裸钛合金组骨髓间充质干细胞分化较差且黏附率低。随时间延长，各组碱性磷酸酶表达均增加，羟基磷灰石组和钛粉复合羟基磷灰石组各时间点的碱性磷酸酶表达均较裸钛合金组明显增高(P < 0.05)。表明羟基磷灰石、钛粉复合羟基磷灰石涂层可有促进大鼠骨髓间充质干细胞的黏附和分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 国产人工颈椎间盘, 假体涂层, 大鼠骨髓间充质干细胞, 实验观察

Abstract:

BACKGROUND: Titanium artificial cervical disc has good biocompatibility, but titanium alloy is shown to have poor biological activity, low bonding strength, easy release of metal ions under physiological conditions.
OBJECTIVE: To observe the effects of different coating for the titanium plate of domestic cervical artificial disc on adhesion and differentiation ability of rat bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells from Wistar rats were seeded into 24-well titanium plates with hydroxyapatite coating, titanium powder+hydroxyapatite coating and bare titanium plate. Cell culture was terminated after 24 and 48 hours, and the cell growth was observed under scanning electron microscope. After 24 hours of inoculation, osteogenic inducer was added; then, cell supernatant was collected at 3, 5, 7 days after cell lysis and centrifugation to detect the activity of alkaline phosphatase.
RESULTS AND CONCLUSION: After composite culture with titanium plates with hydroxyapatite coating or titanium powder+hydroxyapatite coating, cultured cells were in polygonal shape, and pseudopodia were extended into the micropores that were adhered closely to the material surface. Cells cultured with bare titanium plates had poor differentiation and adhesion rate. With time, the expression of alkaline phosphatase was increased in each group, especially in the groups of titanium plates with hydroxyapatite coating and titanium powder+hydroxyapatite coating (P < 0.05). These findings indicate that titanium plates with hydroxyapatite coating or titanium powder+hydroxyapatite coating can promote adhesion and differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, intervertebral disk, bioprosthesis, stem cells

中图分类号:

R318

李俊辉，俞兴，穆晓红，徐林，王松，卢俊哲 . 人工颈椎间盘不同涂层影响骨髓间充质干细胞的黏附及分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1938-1943.

Li Jun-hui, Yu Xing, Mu Xiao-hong, Xu Lin, Wang Song, Lu Jun-zhe . Effects of different cervical artificial disc coatings on adhesion and differentiation ability of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1938-1943.

图/表（结果） 3

2.1 各组材料表面分析结果 3组材料表面可见许多胞状孔穴凹陷，疏松多孔，能谱分析显示涂层主要由Ti、Ca、P、Si、O、C元素组成，见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞鉴定结果 原代骨髓间充质干细胞接种于培养瓶后，倒置显微镜下观察细胞呈圆型，大小不一，悬浮于培养液中；24 h后部分细胞开始贴壁，呈圆形、梭形或多角形。48 h后换液去除未贴壁的杂质细胞，可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长；三四天可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起，梭形细胞为主；六七天细胞呈集落生长，融合80%以上，呈漩涡状，细胞排列紧密，逐渐融合成片。原代细胞铺满瓶底80%以上可以传代，传代24 h后细胞大部分贴壁生长，形态均一，生长旺盛，二三天换液1次。以后四五天可传代1次。流式细胞仪检测结果显示第3代骨髓间充质干细胞表面抗体CD44、CD106阳性表达率分别为95.0%和81.1%，而造血类细胞表面标志CD45呈阴性，表达率为5.0%，见图2。

2.3 扫描电镜下样品表面细胞黏附观察结果 扫描电镜观察表明，材料与细胞复合培养24 h后表面即有部分细胞黏附，裸金属钛表面的骨髓间充质干细胞呈圆形，而羟基磷灰石和钛粉复合羟基磷灰石表面的细胞呈梭形或多角形；48 h时可见羟基磷灰石和钛粉复合羟基磷灰石表面的细胞开始铺展，尤其是在钛粉复合羟基磷灰石表面，细胞呈多角形，并伸出细长的伪足伸入到材料的微孔内，与材料表面紧密黏附，见图3。

2.4 各组材料表面细胞碱性磷酸酶活性测定结果 骨髓间充质干细胞复合培养2-7 d细胞分泌的碱性磷酸酶量呈上升趋势，3个观察时间点之间比较差异有显著性意义(P < 0.05 )；3种材料对骨髓间充质干细胞分泌碱性磷酸酶均有促进作用，空白对照组、无涂层组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；喷羟基磷灰石组与喷钛粉联合羟基磷灰石组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；喷羟基磷灰石组、喷钛粉联合羟基磷灰石组与空白对照组、无涂层组两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

参考文献

[1] Kang L,Lin D,Ding Z,et al.Artificial disk replacement combined with midlevel ACDF versus multilevel fusion for cervical disk disease involving 3 levels. Orthopedics.2013;36(1):e88-94.

[2] 王逢贤,徐林,俞兴,等.新型国产颈椎间盘实验山羊模型的建立及初步研究[J].生物骨科材料与临床研究,2013,10(3):50-52.

[3] 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见. 2006-09-30.

[4] Tsuchiya S,Hara K,Ikeno M,et al.Rat bone marrow stromal cell-conditioned medium promotes early osseointegration of titanium implants.Int J Oral Maxillofac Implants.2013;28(5): 1360-1369.

[5] Garai S,Sinha A.Biomimetic nanocomposites of carboxymethyl cellulose-hydroxyapatite: Novel three dimensional load bearing bone grafts.Colloids Surf B Biointerfaces.2013;115C:182-190.

[6] Butcher A,Milner R,Ellis K,et al.Interaction of platelet-rich concentrate with bone graft materials: an in vitro study.J Orthop Trauma.2009;23(3):195-200.

[7] Bae SE,Bhang SH,Kim BS,et al.Self-assembled extracellular macromolecular matrices and their different osteogenic potential with preosteoblasts and rat bone marrow mesenchymal stromal cells.Biomacromolecules. 2012;13(9): 2811-2820.

[8] Phinney DG,Kopen Q,Isaacson RL,et al.Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice:variations in yield，growth，and diferentiation.J Cell Biochem.1999;72:570-585.

[9] Zhang MM,Jia GQ,Cheng JQ,et al.In vitro analysis and in vivo tracing of BrdU-labeled rat bone marrow mesenchymal stem cells.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban.2012;43(2): 266-270.

[10] Djouad F,Bony C,Häupl T,et al.Transcriptional profiles discriminate bone marrow-derived and synovium-derived mesenchymal stem cells.Arthritis Res Ther.2005;7(6): R1304-1315.

[11] Martin JY,Schwartz Z,Hummert TW,et al.Effect of titanium surface roughness on proliferation, differentiation and protein synthesis of human osteoblast-like cells(MG63).J Biomed Mater Res.1995;29:389-401.

[12] Chien CY,Tsai WB.Poly(dopamine)-assisted immobilization of Arg-Gly-Asp peptides,hydroxyapatite,and bone morphogenic protein-2 on titanium to improve the osteogenesis of bone marrow stem cells.ACS Appl Mater Interfaces.2013;5(15): 6975-6983.

[13] Malchau H,Herberts P,Ahnfelt L.Prognosis of total hip replacement in Sweden.Acta Orthop Scand.1993;64:497-506.

[14] 姜红江,王玉林.医用钛合金的表面改性[J].生物骨科材料与临床研究,2005,2(4):28-33.

[15] Hench LL.Bioceramics from concept to clinic.J Am Ceram Soc.1991;8(1):1487-1510.

[16] Mutsuzaki H,Sogo Y,Oyane A,et al.Improved bonding of partially osteomyelitic bone to titanium pins owing to biomimetic coating of apatite.Int J Mol Sci.2013;14(12): 24366-24379.

[17] Anselme K.Osteoblast adhesion on biomaterials.Biomaterials. 2000;21:667-681.

[18] Nakashima Y,Sato T,Yamamoto T,et al.Results at a minimum of 10 years of follow-up for AMS and PerFix HA-coated cementless total hip arthroplasty: impact of cross-linked polyethylene on implant longevity.J Orthop Sci.2013;18(6): 962-968.

[19] Shin J,Lee K,Koh J,et al.Hydroxyapatite coatings on nanotubular titanium dioxide thin films prepared by radio frequency magnetron sputtering.J Nanosci Nanotechnol. 2013;13(8):5807-5810.

[20] Lee TM,Yang CY,Chang E,et al.Comparison of plasma sprayed hydroxyapatitc coatings and zirconia-reinforced hydroxyapatite composite coatings: in vivo study.J Biomed Mater Res A.2004;71A(4):652-660.

[21] Antonov EN,Bagratashvili VN,Ball M,et al.Influence of target density on properties of laser deposited calcium phosphate coatings.Key Eng Mater.2001;192-195(22-26):107-110.

[22] Long LH,Kim HW,Lee SH,et al.Biocompatibility of titanium implants modified by microarc oxidation and hydraxyapatite coating.J Biomed Mater Res A.2005;73(1):48-54.

[23] Ma J,Wang C,Peng KM.Electrophoretic deposition of porous hydroxyapatite scaffold.Biomaterials.2003;24:(3)505-510.

[24] Lord G,Bancel P.Themadreporic cementless total hip arthroplasty.New experimental data and a seven-year clinical follow-up study.Clin Orthop Relat Res.1983;176:67-76.

[25] Zreiqat H,Valenzuela SM,Nissan BB,et al.The effect of surface chemistry modification of titanium alloy on signalling pathways in human osteoblasts.Biomaterials.2005;26:7579-7586.

[26] Millet P,Girardin E,Braham C,et al.Stress influence on interface in plasma-sprayed hydroxyapatite coatings on titanium alloy.J Biomed Mater Res.2012;60(4):679-684.

[27] Li HW,Sun JY.Effects of dicalcium silicate coating ionic dissolution products on human mesenchymal stem-cell proliferation and osteogenic differentiation.J Int Med Res. 2011; 39(1):112-128.

[28] Zeng XL,Li JF,Yang SH,et al.In Vivo Testing of Canine Prosthetic Femoral Components with HA-Ti Ladder-type Coating on Vacuum Plasma-sprayed Ti Substrate. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci.2013;33(4):543-550.

[29] Heimann RB,Schurmann N,Muller RT.In vitro and in vivo performance of Ti6Al4V implants with plasma-sprayed osteoconductive hydroxylapatite-bioinert titania bond coat "duplex" systems: an experimental study in sheep.J Mater Sci Mater Med.2004;15(9):1045-1052.

[30] Ker ED,Chu B,Phillippi JA,et al.Engineering spatial control of multiple differentiation fates within a stem cell population. Biomaterials.2011;32(13):3413-3422.

引言

材料方法

设计：材料筛选与细胞生物学特性实验。

时间及地点：实验于2013年4至9月在北京中医药大学附属东直门医院细胞室及清华大学机械工程系实验室完成。

材料：

实验动物：4周龄Wistar大鼠4只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号：11400700014577。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部关于善待实验动物的规定^[3]。

实验样品：规格为10 mm×10 mm×1.5 mm的正方形钛片，由清华大学机械工程系提供。将钛片分为3组，分别为无涂层组、喷羟基磷灰石组与喷钛粉联合羟基磷灰石组。制备过程：实验所用喷钛和羟基磷灰石涂层是在真空状态下，利用直流电弧放电，将1 500 ℃加热后的氮气部分电离成等离子体，高速喷射得到等离子射流，所要喷涂的钛、羟基磷灰石粉以氮气为载体，通过高速喷射到基底粗糙的钛合金基体表面而形成多孔涂层；钛粉联合羟基磷灰石涂层也是真空下，在钛合金基底和表面羟基磷灰石涂层之间喷涂2层钛粉与羟基磷灰石粉的复合中间涂层，中间层质量比分别为50%钛+50%羟基磷灰石，单层厚度为30-50 μm，涂层孔隙直径为200-500 μm，总厚度为150-200 μm。

实验方法：

材料的表征观察与表面处理：随机抽取3组样品中各3片，场发射扫描电镜下观察各组种植体的表面形貌；用X射线能谱仪测定涂层的元素组成及各元素含量。3种样品体在蒸馏水、丙酮溶液及体积分数70%乙醇溶液中超声波清洗机各清洗20 min，随后在蒸馏水溶液中超声波清洗10 min备用；所有试样在使用前用体积分数75%乙醇清洗，高温高压消毒30 min。

骨髓间充质干细胞的分离和扩增：取Wistar大鼠4只，用3.5%水合氯醛(100 g/mL)麻醉成功后用体积分数75%乙醇浸泡大鼠腹部及双下肢5 min，无菌条件下取双侧股骨和胫骨，保持髓腔完整，剔去肌肉组织后用PBS冲洗3次，超净台内剪开骨头两端，露出髓腔。用5 mL无菌注射器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，反复2次。收集冲洗液， 1 000 r/min离心5 min，离心半径为13.5 cm；弃上清，用含体积分数10%血清的L-DMEM培养基悬浮细胞，接种于75 cm²培养瓶，每只大鼠收集的细胞悬液接种3瓶。于 37 ℃恒温、体积分数为5%CO₂的饱和湿度细胞培养箱中培养，接种48 h后首次换液，此后每二三天换液1次。待原代细胞铺满瓶底面积80%以上时进行传代，以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化细胞，按1∶3的比例传代培养，传至第2代时备用^[4]。

骨髓间充质干细胞的鉴定：用流式细胞仪检测第3代细胞表面标志CD44、CD106的表达，以及造血类细胞表面标志CD45的表达情况。

骨髓间充质干细胞与材料体外复合培养：按上述方法将第2代骨髓间充质干细胞传代，待第3代骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底80%以上时，用0.25%胰酶1 mL消化 1 min，当细胞开始收缩变圆并开始悬浮时，加含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基5 mL终止消化，1 000 r/min离心5 min，离心半径为13.5 cm，弃上清，用含体积分数10%胎牛血清的培养基悬浮细胞。①调整细胞浓度为2×10⁸L^-¹，加样器取2 mL细胞悬液分别接种于放有3组样品的24孔培养板内，每样本设6复孔，分别于培养的第24，48小时后各终止培养3复孔。然后吸净培养液，PBS冲洗3次去除无活力的细胞；2.5%戊二醛固定和1%四氧化饿双重固定30 min；PBS冲洗2遍；乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，在临界点干燥，金溅射喷镀；扫描电镜观测细胞在样品表面的黏附情况^[5]。②取2块24孔板，设9个空白对照复孔，另将3组样品各9块分别放置于培养板中，加样器取细胞浓度为2×10⁸ L^-¹的细胞悬液 2 mL分别接种于空白对照组及放有3组样品的24孔培养板内；培养24 h后各组均更换为含成骨诱导剂的培养液(含1 mmol/L地塞米松、 1 mol/L β-甘油磷酸钠、50 mmol/L抗坏血酸)^[6]，每2 d换1次液，于接种后第3，5，7天各取3个样本，收集细胞裂解后离心的上清液50 µL，按照碱性磷酸酶试剂盒说明检测细胞碱性磷酸酶活性，取其平均值^[7]。

主要观察指标：①3种样品体表面形貌、孔隙率及元素组成。②骨髓间充质干细胞鉴定结果。③骨髓间充质干细胞在3种样品上的黏附。④3种样品对骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶分泌量的影响。

统计学分析：采用SPSS 18.0软件对实验所得数据进行ANVOA方差分析，并进行方差齐性检验，数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

3.1 骨髓间充质干细胞的分离、纯化 骨髓间充质干细胞在不同的诱导条件下能向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等中胚层及神经外胚层组织细胞分化，是良好的组织工程种子细胞，骨髓中的间充质干细胞相对含量很少，约占骨髓有核细胞的十万分之一^[8]，因此将骨髓中的间充质干细胞在体外分离、纯化、培养、鉴定，从而建立良好的细胞系，是获取组织工程种子细胞的常用方法。实验采用贴壁筛选法纯化骨髓间充质干细胞，是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长的骨髓间充质干细胞。经流式细胞仪鉴定其表面抗体CD44、CD106阳性表达率分别为95.0%和81.1%，符合做为组织工程种子细胞的标准^[9]。目前贴壁筛选法仍是分离和纯化骨髓间充质干细胞的常用方法，纯化的骨髓间充质干细胞可以用于检验医学种植体的生物相容性，在骨科内置物的筛选及研发方面也有重要的用途^[10]。

3.2 生物活性涂层的初步筛选 虽然大量资料证实钛合金具备良好的生物相容性，无毒、不致癌、不致畸、不诱发变态反应，与机体组织具有较好的相容性^[11]。但钛及其合金属于生物惰性材料，生物活性差，早期不能与骨形成化学结合；假体与宿主骨组织间仅仅是一种机械嵌顿及咬合，强度较低，不能产生坚强的化学键结合，容易产生假体松动，进而导致内固定失败^[12-13]。人工假体与宿主骨之间最为理想结合方式为骨键合^[14]，骨键合亦称生物活性结合，即人工假体只要其能与宿主骨组织产生直接的化学键性结合，就具备了生物活性，人工假体与宿主骨组织“长”成一体，人工假体与宿主骨组织界面结构连续而使得功能和力学传导呈连续性，这种结合方式使得强度能够达到乃至超过宿主骨组织及人工假体本身强度，同时可以明显减少达到骨性固定所需时间，使得人工关节假体获得长期稳定^[15]。

由于钛合金生物活性差，为了达到生物活性结合，对钛合金表面涂层进行改性提高其表面生物活性是目前研究热点之一^[16]。涂层表面的化学组成和表面形貌是影响细胞在其表面黏附的两个重要因素，细胞在生物材料表面的黏附是细胞-材料相互作用的第一步，其决定了细胞在材料表面的增殖、分化和凋亡^[17]。以羟基磷灰石为基质的涂层是目前应用较为广泛的一种，羟基磷灰石涂层作为一个重要的骨组织的生物活性物质，具有促进成骨细胞的生长、增殖和分化，以及钙盐沉积的作用，它在人工髋、膝关节假体中已经得到广泛应用^[18]。但羟基磷灰石涂层同时具有脆性大、易剥脱、在体内容易降解等缺点^[19]；针对于上述问题，对羟基磷灰石涂层化学组成和表面形貌进行改良以增加生物活性及羟基磷灰石与假体表面的结合强度成了许多专家研究的方向。现有多种方法都可以用来制备和改良羟基磷灰石涂层，如等离子喷涂法^[20]、激光熔覆法^[21]、微弧氧化法^[22]、电化学方法等^[23]，其中等离子喷涂技术是近年来应用最为广泛且较为成功的一种方法。实验所用喷钛和羟基磷灰石涂层是在真空状态下，利用直流电弧放电将1 500 ℃加热后的氮气部分电离成等离子体，高速喷射得到等离子射流，所要喷涂的钛、羟基磷灰石粉以氮气为载体，通过高速喷射到基底粗糙的钛合金基体表面而形成多孔涂层；钛粉联合羟基磷灰石复合涂层也是真空下在钛合金基底和表面羟基磷灰石涂层之间喷涂2层钛粉与羟基磷灰石粉的复合中间涂层。羟基磷灰石、钛粉联合羟基磷灰石涂层表面除了组成羟基磷灰石的Ca、P元素，还有少量的Si、C元素。有研究发现骨组织可以长入到百微米级的微孔结构中，最适宜骨组织长入的孔径在 150-700 μm^[24]。生物材料的化学组成也对细胞在其表面铺展起着重要作用^[25]，研究表明，少量的硅离子能够通过缩短细胞分裂周期而促进成骨细胞黏附、增殖和分化，同时还具有抑制破骨细胞活性的功能^[26-27]。钛粉联合羟基磷灰石涂层属于复合涂层，它具有生物活性高且与钛合金基体结合牢固的优点，Zeng等^[28]利用等离子喷涂技术制备3种人工髋关节涂层：常压下将羟基磷灰石喷涂在钛合金表面(HA+Ti+A组)、真空下下将羟基磷灰石喷涂在钛合金表面(HA+Ti+V组)、真空状态下将钛粉联合羟基磷灰石复合物喷涂在钛合金表面制备阶梯式涂层(Ti+HAG+Ti+V组)；通过手术将不同涂层的人工关节植入到12月龄比格犬体内，正常饲养28周后取材，发现Ti+HAG+Ti+V组在假体界面剪切强度和新生骨量方面均优于其他两组，Ti+HAG+Ti+V涂层假体能与周围骨组织密切结合，增强了假体稳定性。Heimann等^[29]在常压下利用等离子喷涂技术，将羟基磷灰石和二氧化钛喷涂于钛金属假体表面形成复合涂层，并将该涂层与单纯羟基磷灰石涂层假体进行动物实验对比研究，结果显示复合涂层假体有明显的骨长入且没有裂纹和分层，而在单纯羟基磷灰石涂层假体则观察到明显的裂隙和分层现象。

成骨细胞的前体细胞即开始表达碱性磷酸酶，在成熟成骨细胞中碱性磷酸酶的表达进一步增加。成骨细胞所分泌的骨型碱性磷酸酶是一种细胞外酶，可进入血液循环，能够反映成骨细胞形成骨基质的能力，在成骨细胞的细胞基质矿化过程中起关键作用^[30]。实验碱性磷酸酶试剂盒检测结果显示，含有Ca、P、Si元素的羟基磷灰石和钛粉联合羟基磷灰石涂层能够促进骨髓间充质干细胞早期的分化。

3.3 存在的问题与展望 实验结果表明，羟基磷灰石和钛粉联合羟基磷灰石涂层可以促进骨髓间充质干细胞在种植体表面的黏附和早期分化，且对细胞生长状态没有明显的影响，细胞生长状态较好。虽然羟基磷灰石和钛粉联合羟基磷灰石涂层对骨髓间充质干细胞分泌碱性磷酸酶活性的影响对比没有统计学意义，但在诱导细胞黏附和增加涂层与假体结合牢固程度方面，钛粉联合羟基磷灰石涂层优于其他两组。实验仍然存在以下不足：①虽然等离子喷涂技术得到了广泛应用，但它在高温下操作容易使涂层原有材料变性；它是线性喷涂，在形状复杂的基体上很难获得均匀的涂层；同时也有涂层易出现裂纹的报道。②实验所用涂层种类有限，是本实验存在的另外一个不足。当然实验只是为假体涂层的初步筛选和改进提供部分细胞实验资料，还在制备其他涂层，并进行筛选，以达到获得符合临床应用最佳涂层的目的。

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由于钛合金生物活性差，为了达到生物活性结合，对钛合金表面涂层进行改性提高其表面生物活性是目前研究热点之一。涂层表面的化学组成和表面形貌是影响细胞在其表面黏附的两个重要因素，细胞在生物材料表面的黏附是细胞-材料相互作用的第一步，其决定了细胞在材料表面的增殖、分化和凋亡。以羟基磷灰石为基质的涂层是目前应用较为广泛的一种，羟基磷灰石涂层作为一个重要的骨组织的生物活性物质，具有促进成骨细胞的生长、增殖和分化，以及钙盐沉积的作用，它在人工髋、膝关节假体中已经得到广泛应用。但羟基磷灰石涂层同时具有脆性大、易剥脱、在体内容易降解等缺点；针对于上述问题，对羟基磷灰石涂层化学组成和表面形貌进行改良以增加生物活性及羟基磷灰石与假体表面的结合强度成了许多专家研究的方向。现有多种方法都可以用来制备和改良羟基磷灰石涂层，如等离子喷涂法、激光熔覆法、微弧氧化法、电化学方法等，其中等离子喷涂技术是近年来应用最为广泛且较为成功的一种方法。实验所用喷钛和羟基磷灰石涂层是在真空状态下，利用直流电弧放电将1500℃加热后的氮气部分电离成等离子体，高速喷射得到等离子射流，所要喷涂的钛、羟基磷灰石粉以氮气为载体，通过高速喷射到基底粗糙的钛合金基体表面而形成多孔涂层；钛粉联合羟基磷灰石复合涂层也是真空下在钛合金基底和表面羟基磷灰石涂层之间喷涂2层Ti粉与羟基磷灰石粉的复合中间涂层。羟基磷灰石、钛粉联合羟基磷灰石涂层表面除了组成羟基磷灰石的Ca、P元素，还有少量的Si、C元素。有研究发现骨组织可以长入到百微米级的微孔结构中，最适宜骨组织长入的孔径在150-700μm。生物材料的化学组成也对细胞在其表面铺展起着重要作用，研究表明，少量的硅离子能够通过缩短细胞分裂周期而促进成骨细胞黏附、增殖和分化，同时还具有抑制破骨细胞活性的功能。钛粉联合羟基磷灰石涂层属于复合涂层，它具有生物活性高且与钛合金基体结合牢固的优点，Zeng等利用等离子喷涂技术制备3种人工髋关节涂层：常压下将羟基磷灰石喷涂在钛合金表面(HA+Ti+A组)、真空下下将羟基磷灰石喷涂在钛合金表面(HA+Ti+V组)、真空状态下将钛粉联合羟基磷灰石复合物喷涂在钛合金表面制备阶梯式涂层(Ti+HAG+Ti+V组)；通过手术将不同涂层的人工关节植入到12个月龄比格犬体内，正常饲养28周后取材，发现Ti+HAG+Ti+V组在假体界面剪切强度和新生骨量方面均优于其他两组，Ti+HAG+Ti+V涂层假体能与周围骨组织密切结合，增强了假体稳定性。Heimann等在常压下利用等离子喷涂技术，将羟基磷灰石和二氧化钛喷涂于钛金属假体表面形成复合涂层，并将该涂层与单纯羟基磷灰石涂层假体进行动物实验对比研究，结果显示复合涂层假体有明显的骨长入且没有裂纹和分层，而在单纯羟基磷灰石涂层假体则观察到明显的裂隙和分层现象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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人工颈椎间盘不同涂层影响骨髓间充质干细胞的黏附及分化

Effects of different cervical artificial disc coatings on adhesion and differentiation ability of rat bone marrow mesenchymal stem cells

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[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[3]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[4]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[5]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[6]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[7]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[8]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[9]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[10]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[11]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[12]	杨亚楠, 李峻峰, 王立, 刘恒全, 赖雪飞. 柠檬酸钙：一种有趣的有机钙生物医用材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1609-1615.
[13]	王刚, 李东辉, 白志明. 长段输尿管损伤替代治疗的方法、材料及修复重建的演变历程[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1299-1305.
[14]	李黎, 马力, 李鹤. 磁性壳聚糖微球的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 577-582.
[15]	唐萌萌, 陈和春, 谢宏晨, 张瑜, 谭晓霜, 孙艺璇, 黄毅娜. 聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 583-588.