聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2214

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (4): 583-588.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2214

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聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性

唐萌萌¹，陈和春²，谢宏晨¹，张瑜²，谭晓霜¹，孙艺璇¹，黄毅娜¹

¹四川大学华西公共卫生学院/四川大学华西第四医院，四川省成都市 610041；²中国科学院成都有机化学有限公司，四川省成都市 610041

收稿日期:2019-05-28 修回日期:2019-05-29 接受日期:2019-08-23 出版日期:2020-02-08 发布日期:2020-01-07
作者简介:唐萌萌，女，1995，河南省许昌市人，汉族，四川大学华西公共卫生学院在读硕士，主要从事食品毒理学研究。
基金资助:
江苏省科技厅社会发展(面上项目)项目(BE2016661)；四川省科技支撑计划项目(14ZC2001)

Histocompatibility of poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)/cross-linked polyvinylpyrrolidone ureteral stent grafted into the rat bladder

Tang Mengmeng¹, Chen Hechun², Xie Hongchen¹, Zhang Yu², Tan Xiaoshuang¹, Sun Yixuan¹, Huang Yina¹

¹West China School of Public Health, Sichuan University/West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ²Chengdu Organic Chemistry Co., Ltd., Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2019-05-28 Revised:2019-05-29 Accepted:2019-08-23 Online:2020-02-08 Published:2020-01-07
About author:Tang Mengmeng, Master candidate, West China School of Public Health, Sichuan University/West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the Social Development Project of Science and Technology Department of Jiangsu Province (General Project), No. BE2016661; the Science and Technology Support Program of Sichuan Province, No. 14ZC2001

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
聚(L-丙交酯-ε-己内酯)管：以辛酸亚锡作为催化剂催化L-丙交酯和ε-己内酯的本体开环共聚合制得的生物医用材料，具有良好的可降解性、力学性能及生物安全性，作为支架构建的基础材料已被广泛研究，但由于其疏水性在组织工程中的应用受到限制。
交联聚乙烯吡咯烷酮：为一种亲水性聚合物，具有优良的生理惰性和生物相容性，同时具备很强的吸水能力，制备成输尿管支架后能降低支架表面的湿态摩擦，更重要的是利用自身非常好的吸水膨胀性，可在输尿管支架内部造成很高的压力，提高支架管的降解速率，并促使可降解组分聚(L-丙交酯-ε-己内酯)共聚物崩解成小碎片。

背景：随着组织工程学、材料学、生物力学等学科的发展，研制新型可生物降解输尿管支架管成为目前研究的重点。前期研究制备了聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架。

目的：探索聚(L-丙交酯-ε-己内酯)输尿管支架植入SD大鼠膀胱内的组织相容性。

方法：取雄性SD大鼠(四川省中医药科学院实验动物中心提供)60只，随机分为4组，每组15只：假手术组在膀胱外侧开一小口后直接缝合，未植入任何材料；其余3组在膀胱外侧开一小口后分别植入聚氨酯输尿管支架(对照组)、聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/8%交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架(实验1组)、聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/5%交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架(实验2组)，随后缝合切口。术后4，8，16周，大体观察膀胱局部解剖情况，苏木精-伊红染色观察各组埋植材料的组织相容性。实验经四川大学华西公共卫生学院分析测试中心实验动物伦理学委员会批准。

结果与结论：①大体观察：术后4，8，16周时，对照组、实验1组均出现不同程度的慢性炎症刺激反应，实验2组仅术后4周时出现慢性炎症刺激反应，对照组、实验1组术后4，16周的材料结石生成率高于假手术组(P < 0.05)，3组术后8周的材料结石生成率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；实验2组仅术后4周的材料结石生成率高于假手术组，其余时间点比较差异无显著性意义(P > 0.05)；②病理观察：术后各时间点，对照组、实验1组、实验2组均出现不同程度外膜异物、炎症反应及黏膜弥漫增生，3组间术后不同时间点的黏膜弥漫增生率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但均高于假手术组(P < 0.05)；③结果表明：聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架的结石生成情况和膀胱组织学反应与商品聚氨酯输尿管支架管相当，尤以加入5%交联聚乙烯吡咯烷酮配比的组织相容性较优。

ORCID: 0000-0003-3251-0657(唐萌萌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 组织相容性, L-丙交酯, ε-己内酯, 交联聚乙烯吡咯烷酮, 输尿管支架管, 膀胱, 病理

Abstract:

BACKGROUND: With the development of tissue engineering, materials science, and biomechanics, developing new biodegradable ureteral stent has become an issue of concern. The ureteral stent with poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)/crosslinked polypyrrolidone was prepared.

OBJECTIVE: To explore the histocompatibility of the ureteral stent grafted into the bladder of Sprague-Dawley rats.

METHODS: Sixty male Sprague-Dawley rats (provided by Laboratory Animal Center of Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine) were randomly divided into four groups, each group containing 15 rats. The sham operation group was directly sutured after opening a small incision on the outside of the bladder, and no material was implanted. The other three groups were implanted with polyurethane ureteral stent (control group), poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)/8% cross-linked polyvinylpyrrolidone ureter stent (experiment group 1), poly(L-lactide ε- caprolactone)/5% cross-linked polyvinylpyrrolidone ureteral stent (experiment group 2) after opening a small incision on the outer side of the bladder, followed by suturing the incision. At 4, 8, and 16 weeks after operation, the local anatomy of the bladder was observed. The histocompatibility of the materials in each group was observed by hematoxylin-eosin staining. The study was approved by the Ethical Committee of Laboratory Animal Analysis and Testing Center of West China School of Public Health, Sichuan University.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Gross observation: at 4, 8 and 16 weeks postoperatively, different degrees of chronic inflammation reaction occurred in the control group and experimental group 1. In the experiment group 2, chronic inflammatory reaction appeared at 4 weeks postoperatively. The stone formation rate in the control group and experimental group 1 was significantly higher than that in the sham operation group (P < 0.05) at 4 and 16 weeks postoperatively, which showed no significant difference at 8 weeks postoperatively among groups (P > 0.05). The calculus formation rate in the experimental group 2 was significantly higher than that in the sham operation group only at 4 weeks postoperatively, and had no significant difference at other time points (P > 0.05). (2) Pathological observation: different degrees of foreign body in the outer membrane, inflammatory reaction and diffuse hyperplasia of the mucosa were found in the control group, experimental groups 1 and 2 at different time points postoperatively. There was no significant difference in the rate of diffuse hyperplasia of the mucosa at different time points postoperatively among groups (P > 0.05), but higher than that in the sham operation group (P < 0.05). (3) These results indicate that the calculus formation rate and bladder histological reaction of poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)/cross-linked polyvinylpyrrolidone ureter stent are comparable with those of commercial ureteral stents, especially the addition of 5% cross-linked polyvinylpyrrolidone has better histocompatibility.

Key words: biomaterials, histocompatibility, L-Lactide, ε-caprolactone, cross-linked polyvinylpyrrolidone, ureteral stent tube, bladder, pathology

中图分类号:

唐萌萌, 陈和春, 谢宏晨, 张瑜, 谭晓霜, 孙艺璇, 黄毅娜. 聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 583-588.

Tang Mengmeng, Chen Hechun, Xie Hongchen, Zhang Yu, Tan Xiaoshuang, Sun Yixuan, Huang Yina. Histocompatibility of poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)/cross-linked polyvinylpyrrolidone ureteral stent grafted into the rat bladder[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(4): 583-588.

图/表（结果） 7

2.1 全身急性毒性反应术后连续观察72 h，各组大鼠术后逐渐恢复正常活动，未观察到明显异常反应。整个实验期间所有大鼠活动、摄食、饮水、尿便正常。实验开始阶段，各组间大鼠体质量经方差分析比较差异无显著性意义(P > 0.05)。实验过程中0-2周各组大鼠体质量均无明显差异(P > 0.05)，表明膀胱手术和植入各类材料对动物的生长发育无不良影响，具体情况见表2。

2.2 膀胱植入材料后的解剖学大体观察结果术后4，8，16周，各组大鼠腹腔内主要脏器均未见明显异常。

术后4周时，与假手术组相比，其余3组均出现不同程度的慢性炎症刺激作用，表现为膀胱壁增厚、与周围组织粘连等，其中对照组、实验2组最为明显；假手术组结石生成率为0，其余3组结石生成率均为80%，均显著高于假手术组 (P < 0.05)。术后8周时，与假手术组相比，对照组、实验1组植入后均出现不同程度的慢性炎症刺激作用；假手术组结石生成率为40%，对照组、实验1组结石生成率均为100%，实验2组结石生成率为80%，各组间结石生成率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。术后16周时，与假手术组相比，对照组、实验1组材料植入后均出现不同程度的慢性炎症刺激作用，导致膀胱壁增厚、充盈、不同程度充血及与周围组织粘连，结石生成率均显著高于假手术组(P < 0.05)；实验2组结石生成率与假手术组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，结果见表3。解剖大体观察结石生成情况见图1。

2.3 膀胱植入材料后的组织病理学观察结果术后4，8，16周，各植入材料组和假手术组的膀胱组织病理检查均发现膀胱内膜黏膜弥漫增生，见图2-4。

术后4周时，与假手术组相比，其余3组植入后均出现不同程度外膜异物及炎症反应，膀胱内膜的上皮均出现类似程度增厚(由2-4层增加为7层)，上皮伸入至外膜呈弥漫性黏膜上皮增生，3组的黏膜弥漫增生率均为80%，假手术组为20%。术后8周时，各组出现不同程度的外膜异物、炎症反应及内膜弥漫增生，对照组、实验1组、实验2组的黏膜弥漫增生率依次递减，分别100%，80%，60%，假手术组为40%，对照组还出现2例明显外膜出血现象。术后16周时，各组膀胱肌层均厚、黏膜细胞均大，仍出现不同程度的黏膜弥漫增生，实验1组黏膜弥漫增生率最高为100%，对照组、实验2组次之，均为80%，假手术组为20%。经确切概率法比较：相同时间点下，不同材料组间弥漫黏膜增生率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；除实验1组术后16周的黏膜增生率明显高于假手术组(P < 0.05)外，其余相同时间点下，各实验组与假手术组黏膜增生率比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

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引言

输尿管支架管作为上尿路疾病治疗中最常用的植入材料，具有支撑和内引流双重作用，可缓解输尿管梗阻、防止植入后漏尿和输尿管狭窄^[1]。1978年输尿管支架问世，其后在近40年的应用中取得较好临床疗效的同时，也存在着诸多并发症或不足，如输尿管尿液返流^[2]、置管后感染^[3]、在体内长时间存在会引起管周结石等症状^[4-8]，其中最常见的疾病为泌尿系医源性病变，发病率0.5%-10%^[9-11]，严重影响了患者生活质量。

近年来随着组织工程学、材料学、生物力学等学科的发展，可降解材料已成为研究热点^[12-15]。其中，聚(L-丙交酯ε-己内酯)[Poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)，PLLCA]管为一种经辛酸亚锡催化L-丙交酯和ε-己内酯的本体开环共聚合制得的高分子材料可降解管。L-丙交酯被FDA批准为可用于人体的可降解的高分子材料，具有良好的可降解性、力学性能及生物安全性，已成为内固定材料的良好素材^[16-22]；ε-己内酯作为典型的半结晶型脂肪族生物可降解聚酯，具有可降解性、生物相容性及热稳定性好等特点，二者的复合物作为支架构建的基础材料已被广泛研究^[10，23-25]，但由于其疏水性在组织工程中的应用受到限制^[26]。交联聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVPP)为一种亲水性聚合物，具有优良的生理惰性和生物相容性，同时具备很强的吸水能力^[27-28]，制备成输尿管支架后，能降低支架表面的湿态摩擦，更重要的是利用自身非常好的吸水膨胀性，可在输尿管支架内部造成很高的压力，提高支架管的降解速率，并促使可降解组分PLLCA崩解成小碎片^[29]。实验拟以Urovision 5F UV1305570商品聚氨酯输尿管支架为对照，评价PLLCA和不同比例PVPP构建输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年9至12月在四川大学华西公共卫生学院实验动物中心与四川大学华西公共卫生学院分析测试中心实验室完成。

1.3 材料 Urovision 5F UV1305570商品聚氨酯输尿管支架材料介绍，见表1。PLLCA/8% PVPP、PLLCA/5% PVPP由中国科学院成都有机化学有限公司提供。

实验动物：成年SPF级雄性SD大鼠，体质量180-200 g，由四川省中医药科学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(川)2018-15，在四川大学华西公共卫生学院实验动物中心屏障级(IVC)动物房内饲养，许可证号：四川省实验动物管理委员会SYXK(川)2013-011号。基础饲料为成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK(川)2014-028，饮水为纯水，整个实验过程中动物自由摄食饮水，室温21-23 ℃，相对湿度46%-57%。60只SD大鼠适应性喂养 3 d后，按体质量分层随机分为假手术组、对照组、实验1组、实验2组，每组15只。实验经四川大学华西公共卫生学院分析测试中心实验动物伦理学委员会批准。

实验用主要仪器和试剂：戊巴比妥钠(Sigma)；BSA224S电子天平(德国赛多利斯股份公司)；双抗(SV30010 HyClone)；带线缝合针(3/8弧2*6尼龙线8-0，宁波医用缝针有限公司)；生理盐水(科伦药业股份有限公司)；病理取材台HD-1580(湖北慧达仪器有限公司)；包埋热台(莱卡EG 1150H)；包埋冻台(莱卡EG 1150C)；脱水机(莱卡ASP 200S)；石蜡切片机(莱卡RM 2235)；烤片机(莱卡HI1210)；漂片机(莱卡HI1220)；体视显微镜(莱卡EZ4HD)；染色机(莱卡ST5010)。

1.4 实验方法

1.4.1 材料的制备由中国科学院成都有机化学有限公司制备^[30-31]：见下列反应式，以辛酸亚锡作为催化剂催化L-丙交酯和ε-己内酯的本体开环共聚合制得生物医用材料PLLCA，在PLLCA弹性体中加入占总质量5%或8%的PVPP，还添加了占总质量20%的硫酸钡。同时使用Urovision 5F UV1305570商品聚氨酯输尿管支架作为对照材料。3种材料均为3-6 mg的白色中空管状。

1.4.2 膀胱植入方法将60只成年SD雄性大鼠以戊巴比妥钠30 mg/kg进行术前麻醉，手术区备毛消毒后，在耻骨联合上方约2 cm处切开皮肤和腹部肌肉层，暴露出膀胱，在膀胱外侧开一小口，假手术组直接缝合，未植入任何材料；对照组将消毒、称质量后的聚氨酯管状材料植入膀胱；实验1组将消毒、称质量后的PLLCA/8%PVPP植入膀胱；实验2组将将消毒、称质量后的PLLCA/5%PVPP植入膀胱，用荷包缝合术缝合膀胱，滴注青-链霉素双抗以抗感染；对肌肉和皮肤进行分层缝合，消毒伤口，术后动物进行密切观察。

1.5 主要观察指标术后4，8，16周，各组取5只大鼠，采用戊巴比妥钠60 mg/kg进行麻醉，剖开膀胱，取出材料称质量，并观察膀胱局部解剖情况：材料和组织界面关系、结石生成情况、膀胱形态、膀胱壁厚度等。各时间点各组5只大鼠的膀胱，经体积分数10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋后切5 μm厚组织切片后进行组织学检查。

1.6 统计学分析所有数据经Excel整理后用SPSS 21.0软件进行统计学分析，多组比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One-Way ANOVA)。进一步进行组间两两比较时，若方差齐，采用Dunnet-t 检验；若方差不齐，采用Games-Howell检验；多组率的比较采用确切概率法。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验通过SD大鼠观察PLLCA/PVPP输尿管支架不同时间点的组织相容性和结石生成情况，以商品聚氨酯输尿管支架为对照。结果显示3种材料SD大鼠膀胱植入后，大鼠均未发生急性毒性反应；从术后4周开始，3种材料植入后均出现不同程度的膀胱慢性炎症刺激作用，3组结石生成率均为80%，显著高于假手术组(P < 0.05)；术后8周时，各实验组与假手术组结石生成率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；术后16周时，与假手术组相比，对照组、实验1组植入后均出现不同程度的慢性炎症刺激作用，导致膀胱壁增厚、充盈、不同程度充血及与周围组织粘连，结石生成率均显著高于假手术组(P < 0.05)；实验2组的结石生成率与假手术组比较无差异无显著性意义(P > 0.05)。

植入后每组材料均有结石生成，无论是植入材料合并手术引发结石还是手术诱发结石，膀胱组织学检查均表现为内膜黏膜向固有层下陷生长，黏膜层增厚，层次增加达7层以上，有的部分黏膜向下生长，伸入肌层达外膜，形成憩室。通过对弥漫黏膜增生率统计分析发现，各时间点不同材料组间弥漫黏膜增生率无显著差异(P > 0.05)。由各时间点结石生成率及膀胱黏膜弥漫增生率两项指标可综合判定，PLLCA/PVPP输尿管支架管的结石生成情况和膀胱组织学反应与商品聚氨酯输尿管相当，尤以PLLCA/5% PVPP配比组织相容性较优，推测可能与其较弱的吸水膨胀性能^[32]、较少的表面正电荷有关^[33]，这也与尹卫民^[34]进行可控性膨胀材料治疗短鼻畸形的实验结果一致。

输尿管支架管是治疗良恶性泌尿系统疾病最常用的医疗器械之一，但该治疗常伴有结石、感染等并发症^[35]，由于这些并发症限制了支架的功能，因此新的支架材料和设计是组织工程输尿管修复重建研究的热点。理想的支架材料应具有以下性能：良好的生物相容性，可靠的机械性能，能抵抗腹膜内及腹膜外感染等^[36-37]。

QI等^[38]研究发现生物复合材料左旋聚乳酸/聚己内酯/羟基磷灰石纳米纤维支架是成骨细胞增殖、分化和矿化的一种有前景的候选材料，有可能用于骨组织再生。姚海军等^[39]通过体外实验及裸鼠皮下植入实验法发现，左旋聚乳酸/聚己内酯复合支架材料安全无毒，与人脂肪来源干细胞生物相容性好，可作为种子细胞的载体用于组织工程膀胱缺损修复的研究。姚丹等^[40]通过猪双侧后肢股部植入聚乳酸/聚己内酯发现，富血小板血浆与聚乳酸/聚己内酯联合应用为新生组织生长提供物理支架，促进转化生长因子β和血管内皮生长因子的mRNA和蛋白表达，促进微创猪深部软组织缺损的愈合。综上所述，目前国内外关于含聚左旋丙交酯/己内酯成分可降解材料的组织相容性研究，相关的动物实验模型不一、植入部位各不相同，而对于通过SD大鼠探究材料植入膀胱后组织相容性的研究甚少，对于PLLCA材料添加不同比例PVPP输尿管支架的组织相容性探究亦未见相关报道，此次实验填补了国内这方面研究的空白。

目前膀胱结石动物模型的建立方法可归纳为：药物诱导膀胱结石、植入性膀胱结石和感染性膀胱结石3种^[41]，其中药物以三聚氰胺、抗生素为主；植入材料一般为金属锌，微孔树脂为新型植入材料；感染菌群一般为变形杆菌，异物感染包括手术缝线等。张薇等^[42]研究发现三聚氰胺灌胃大鼠的膀胱结石形成率最高为60%；曹建英等^[43]通过“膀胱穿线法”构建膀胱结石大鼠模型，膀胱结石生成率为100%。此次实验相较于曹建英等研究的结石生成率较低，推测与实验材料的抗结石性、实验方法并非专门造模有关，其中术后8周时结石生成率较高，也有个体差异的影响。

输尿管支架在植入期间的组织相容性决定于多种理化因素，包括支架管的分子构成、表面光滑程度、电荷特征、加工过程中的添加成分及是否伴有感染及植入时间等。实验通过SD大鼠比较PLLCA/PVPP输尿管支架和商品聚氨酯输尿管支架不同时间点的组织相容性和结石生成情况，初步表明PLLCA材料组合PVPP具有较理想的组织相容性。此次实验中相对于8%PVPP材料，5%PVPP材料表面有较弱的吸水膨胀性能，故细菌在其材料表面的初始黏附水平低；PVPP带正电，大多数细菌表面都带负电，故5%PVPP材料表面相对于8%PVPP材料所带正电荷较少，更不利于细菌的黏附和生物膜的形成，初步推测这是5%PVPP配比组织相容性较优的原因。下一阶段会在已有啮齿动物实验的基础上，采用非啮齿动物种类家兔进一步观察可降解管植入体内的安全性。因为家兔灵敏的免疫反应炎症有助于进一步探究可降解输尿管支架的生物相容性^[44-45]，从而更好地预测该支架植入人体的效果，为其临床研究提供实验室依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚(L-丙交酯-ε-己内酯)/交联聚乙烯吡咯烷酮输尿管支架植入大鼠膀胱后的组织相容性

Histocompatibility of poly(L-lactide-co-ε-caprolactone)/cross-linked polyvinylpyrrolidone ureteral stent grafted into the rat bladder

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