1.1 设计 体外观察性实验。
1.2 时间及地点 实验于2016年10月至2018年3月在贵州医科大学完成。
1.3 材料 纳米羟基磷灰石与聚己内酯材料理化性能,见表1。
实验用主要试剂与仪器:澳洲胎牛血清购于美国Solarbio公司;0.25%胰蛋白酶、双抗溶液、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠购于美国Sigma公司;F12/DMEM培养基购于美国Hycolone公司;PBS、0.1%茜素红染液购于美国Solarbio公司;LIVE/DEAD™ Cell
Imaging Kit购于美国Thermo
Fisher公司;CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-PE购于美国Invitrogen公司;BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司;Thermo
3131型CO2培养箱、单通道可调微量移液器为美国Thermo
Fisher公司产品;流式细胞仪为美国Becton
Dickinson产品;电动移液器购于中国JOANLAB公司;Nikon TE-2000型倒置显微镜、荧光显微镜为日本Nikon公司产品;扫描电镜(S-3400N)为日本日立公司产品;共聚焦显微镜为日本Olympus FV
l000公司产品;酶标仪购于德国Hiperion
MPR4公司。
实验动物:健康4周龄SD大鼠3只,体质量90-100 g,由贵州医科大学动物实验中心提供。实验方案经贵州医科大学动物实验中心伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养及传代 取健康4周龄SD大鼠,颈椎脱臼法迅速处死,以体积分数75%乙醇全身浸泡,无菌下快速分离股骨和胫骨后置于加入双抗的PBS中,将骨头上附着的肌肉及筋膜剔除干净后,用眼科剪将股骨与胫骨的双侧骨骺端各剪一小口,用一次性无菌1 mL注射器吸取适量F12/DMEM完全培养基,缓慢冲出骨髓腔内的骨髓及细胞;将冲出的骨髓轻柔吹打、离心后用完全培养基重悬沉淀,接种于10 cm培养皿中,放入37 ℃、含有体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中进行贴壁培养,记为原代。48 h后全量换液,以后每二三天换液1次,每日使用倒置显微镜观察细胞生长状态。
待细胞铺满培养皿底至细胞融合成单层,细胞密度70%-80%融合时加入0.25%胰蛋白酶置于恒温培养箱中消化二三分钟,倒置显微镜下观察到大部分细胞都已变成球形、胞质回缩及细胞间隙增大时吸除胰蛋白酶,添加完全培养基终止消化,吹打离心后,加入F12/DMEM完全培养基重悬,按照1∶3的比例进行传代培养,记为P1;常规3 d换液1次,至细胞生长再次铺满瓶底汇合时,重复上述传代过程,传代细胞记为P2,选取第3-5代细胞用于后续实验。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定
流式细胞术鉴定:取第4代骨髓间充质干细胞,0.25%胰蛋白酶消化、离心后加入PBS重悬细胞并计数,调整细胞浓度为1×106/管,根据抗体说明书分别加入CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-PE干细胞表面标记物抗体,并设置空白对照,室温下避光孵育45 min,PBS洗涤2次后上流式细胞仪检测。
成骨诱导鉴定:传代培养至P4代后改用成骨诱导培养基(100 nmol/L地塞米松、50 µmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠)培养,此后每二三天均用成骨培养基换液,待成骨诱导2周后进行碱性磷酸酶染色,成骨诱导4周时进行茜素红染色。
1.4.3 3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架的制备 将500 mL氯仿放入三角烧瓶中,缓慢加入25 g纳米羟基磷灰石,搅拌器搅拌30 min后逐渐加入75 g聚己内酯颗粒材料,充分搅拌48 h,将制备好的溶液分装在3个直径10 cm的培养皿后,烘箱烘烤70 ℃ 2 h后置于60 ℃ 12 h;使用基于熔融沉积成型技术改造的挤出成型打印机,编写相关程序,设定支架纤维直径300 µm、孔径300 µm进行参数调节,将烘烤后的复合颗粒料加入料桶进行打印,成型后最终裁剪成10 mm×10
mm×2 mm大小,60Co辐照灭菌。同法制备3D打印聚己内酯支架。
1.4.4 支架的表征
微观形貌观察:将两种支架冷冻干燥及真空下喷金后,于扫描电镜下观察其微观形貌并拍照。
孔隙率测定:采用称重法于恒温25 ℃下测量两种支架的孔隙率,每组设置5个平行量;将支架质量设定为m0;比重瓶装满乙醇质量为m1;支架浸入乙醇后排出多余乙醇后质量为m2;将支架材料从乙醇中取出,剩余比重瓶及乙醇质量为m3;25 ℃下乙醇密度为ρ。支架体积V支=(m1+ m0-m2)/ρ,支架孔体积V孔=(m2-m3-m0)/ρ,孔隙率ε=V孔/ (V支+V孔)=(m2-m3-m0)/(m1-m3)。
力学性能检测:取两种支架,用万能力学试验机测定其弹性模量,按照操作说明选择合适的加载模块,设置好压缩速率室温下对材料进行压缩实验,压缩量程约为材料高度的一半,加载速率为1 mm/min,每组测定5个样品。
由力学理论可知,材料压缩弹性模量=应力/应变,其中应力=P/A,应变=h/L,公式中,P为载荷,A为材料的横截面积,h为压缩长度,L为试样的原始长度;整理数据,根据上述公式分别求出应力和应变,画出应力-应变曲线,截取在线性范围内的形变,较为固定的一段直线区域的斜率即为材料弹性模量。
1.4.5 支架的细胞相容性
细胞接种:取第4代骨髓间充质干细胞消化计数,以2×109 L-1的细胞浓度分别接种到3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架(实验组)与单纯聚己内酯支架(对照组)材料上,静置培养箱中2 h,待细胞贴壁之后添加培养基至正常体积。
细胞增殖活性检测:细胞与材料在24孔板中联合培养1,4,7 d进行CCK-8检测,每组设立4个复孔,至时间点时更换新鲜培养基500 µL,每孔分别加入CCK-8溶液 50 µL,恒温培养箱中孵育2 h,从24孔板中吸取100 µL孵育液转移到新的96孔板中,酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值。
Live/Dead染色:将两组细胞复合物支架培养第7天时进行Live/Dead染色;取5
µL钙黄绿素-AM及20
µL乙锭二聚体-1加到10
mL无菌PBS中,吸除培养基,无菌PBS轻柔冲洗3次,轻微吸干表面PBS,分别加入适量染色液,室温避光孵育30 min,激光共聚焦显微镜下拍照观察。
扫描电镜观察:将两组细胞-支架复合物培养第7天时进行扫描电镜观察;PBS漂洗2次,4%戊二醛4 ℃下固定 2 h,吸去固定液,PBS清洗2次;体积分数50%,70%,80%,90%,100%乙醇梯度脱水,每个梯度10 min;将样本轻轻粘在导电胶上,临界点干燥,真空喷镀,电镜观察拍照。
1.5 主要观察指标 骨髓间充质干细胞在两组支架上的增殖与生长情况。
1.6 统计学分析
使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,数据均以
x(_)±
s表示,所测数据进行方差统计分析,多组间比较采用单因素ANOVA,
P < 0.05为差异有显著性意义。