葛根素干预激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的Wnt信号途径

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.10.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外学者研究证明，激素性股骨头缺血性坏死的发病机制与体内脂质代谢紊乱，尤其是大剂量激素诱导下骨髓间充质干细胞的成脂分化有关。目前葛根素抑制激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的Wnt信号转导途径还未经证实。
目的：观察葛根素干预激素诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化过程中Wnt信号途径相关基因及关键蛋白β-catenin表达的变化。
方法：第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞随机分为空白组、激素组、葛根素低、中、高剂量组，5组干预6 d后RT-PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路主要成员Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA的表达，Western blot法对β-catenin蛋白的表达进行检测分析。
结果与结论：与激素组比较，葛根素各干预组Wnt10b mRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达水平均显著升高；GSK3β mRNA的表达水平显著降低。提示葛根素对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用可能是通过调节信号通路的Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达来实现的。葛根素防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头局部的微循环，同时还与其抑制激素诱导下骨髓间充质干细胞的成脂分化有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 葛根素, 激素, 成脂分化, Wnt, 基因, 蛋白, 福建省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recently, glucocorticoid-induced necrosis of femoral head has been much studied. However, the precise Wnt signaling pathway by which puerarin suppresses adipogenic differentiation of glucocorticoid-induced bone marrow mesenchymal stem cells adipogenic differentiation of glucocorticoid-induced bone marrow mesenchymal stem cells remains unconfirmed.
OBJECTIVE: To investigate the expression of Wnt signaling pathway related genes and the key factor protein, β-catenin, during adipogenic differentiation of glucocorticoid-induced rat bone marrow mesenchymal stem cells treated by puerarin.
METHODS: The third generation of bone marrow mesenchymal stem cells were cultured with Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing blank serum (blank control group), dexamethasone (hormone group), dexamethasone with puerarin low dose group, the middle dose group and high dose group. After 6 days of culture, in the above five groups, the expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway members, Wnt10b mRNA, GSK3β mRNA, β-catenin mRNA, were detected using RT-PCR assay, and the expression of β-catenin protein was detected using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the Wnt10b mRNA, β-catenin mRNA and β-catenin protein expressions were significantly higher in puerarin groups, but GSK3β mRNA expression was significantly lower in the puerarin groups. These findings suggest that puerarin effects on inhibition of adipogenic differentiation of glucocorticoid-induced bone marrow mesenchymal stem cells probably are realized through the activation of Wnt/β-catenin signal pathway and regulation of the key factor Wnt10b mRNA, GSK3β mRNA, β-catenin mRNA, and β-catenin protein expressions. The mechanism by which puerarin prevents glucocorticoid-induced necrosis of femoral head not only improves local microcirculation of the femoral head, but also relates to its inhibitory effects on adipogenic differentiation of glucocorticoid-induced bone marrow mesenchymal stem cells.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, hormones, adipogenesis, Wnt proteins

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2012年2至6月在福建中医药大学中西医结合研究院实验室完成。

材料：

实验动物：4周龄SD大鼠，SPF级，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求^[3]。

实验方法：

骨髓间充质干细胞体外培养与传代：取4周龄SD大鼠8只，剖取双侧股骨和胫骨，用体积分数15%胎牛血清冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，参照文献[4]的全骨髓细胞贴壁培养法，通过细胞贴壁分离、传代，获取并纯化骨髓间充质干细胞。置 37 ℃、体积分数体积分数5%CO₂、95%空气的CO₂培养箱中培养。每隔2 d换液1次。原代细胞培养 6-9 d融合传代，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，吹打成单细胞悬液，以5×10⁷ L^-¹的细胞浓度，传3代后进行以下实验。

骨髓间充质干细胞鉴定：参照文献[5]的鉴定方法，取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞细胞表面标志抗原CD45和CD90阳性表达率。

骨髓间充质干细胞药物分组干预：传3代骨髓间充质干细胞随机分葛根素低剂量组、葛根素中剂量组、葛根素高剂量组、激素组和空白组。各组不同浓度培养液制备：①空白组：含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基100 mL (体积分数15%胎牛血清100 mL)。②激素组：体积分数15%胎牛血清100 mL+0.1 mL×10^-³ mol/L地塞米松储存液。③葛根素低剂量组：体积分数15%胎牛血清99.5 mL+ 0.1 mL × 10^-³ mol/L地塞米松储存液+0.5 mL×10^-³mol/L葛根素储存液。④葛根素中剂量组：体积分数15%胎牛血清 99 mL+ 0.1 mL×10^-³ mol/L地塞米松储存液+1 mL×10^-³ mol/L葛根素储存液。⑤葛根素高剂量组：体积分数15%胎牛血清98 mL+ 0.1 mL×10^-³ mol/L地塞米松储存液+2 mL×10^-³ mol/L葛根素储存液。干预6 d后各组细胞行油红O染色光镜下观察成脂分化的程度及检测成脂标志物。

RT-PCR对Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA和β-catenin mRNA表达的测定：

总RNA提取：5组细胞干预6 d后，每组取6个样本，按TrizolReagent说明书操作，用Trizol一步法提取细胞总RNA，用核酸蛋白定量仪测定RNA纯度和含量。

按照Promega A3500试剂盒换算进行20 μL反应体系进行反转录过程。根据GenBank的目的基因序列，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计目的基因引物序列，北京鼎国生物技术有限公司合成，序列分别为：Wnt10b：上游引物：5’-GCT CGG ATT TCG GTT AAT CA-3’下游引物：5’-AAC CTT TCC CTT TGG AAG GA-3’；GSK3β：上游引物：5’- AAA GTG CAT CGC TGG CTT AT-3’下游引物：5’- GTC GAC GGT TTG TTT CCA AT-3’；β-catenin：上游引物：5’- AAG GAA GCT TCC AGA CAT GC-3’下游引物：5’- AGC TTG CTC TCT TGA TTG CC-3’；GAPDH：上游引物：5’-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC-3’下游引物：5’-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3’。应用一步法进行RT-PCR反应。反应条件：①94 ℃灭活反转录酶4 min。②94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，第②步骤共循环36次。③终末72 ℃延伸10 min。④4 ℃保存产物。各组RT-PCR产物应用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照后进行密度扫描，应用凝胶自动成像分析系统，计算待测基因与内参GAPDH的灰度值比，表示待测基因的相对表达量。

Western blot对β-catenin蛋白表达的测定：5组细胞干预6 d后，每组取6个样本，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入预冷的蛋白裂解液在冰上裂解0.5 h， 15 000 ×g离心15 min，吸弃上清液；BCA试剂盒测定蛋白质浓度。50 µg总蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭非特异性抗体，然后加入一抗，4 ℃过夜。次日用TBS/T洗膜3次，再加入二抗室温孵育2 h，ECL显色。以β-actin作为内参对照，Quantity One图像分析软件分析目标条带的吸光度值，即各目的蛋白相对表达量。

主要观察指标：葛根素低剂量组、葛根素中剂量组、葛根素高剂量组、激素组和空白组细胞β-catenin蛋白的相对表达量。

统计学分析：统计学处理者为张占勇，采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

临床组织学及病理学研究证明，激素性股骨头缺血性坏死的早期病理变化是股骨头骨髓内造血组织减少，脂肪组织增多，骨小梁内骨细胞数目减少。激素性股骨头缺血坏死的脂肪代谢紊乱，被认为可能与激素诱导下骨髓间充质干细胞成脂分化有关^[6-8] 。
骨髓间充质干细胞是一种多潜能干细胞，在生理状态下，大多分化为成骨细胞，很少分化为脂肪细胞^[9] ，但在一定的物理或化学条件下可促使其分化为脂肪细胞。许多研究已表明骨髓成骨细胞和脂肪细胞在分化上存在着反变关系^[10] ，两者之间保持着动态的平衡，当这种平衡被打破时，骨髓间充质干细胞倾向于脂肪细胞分化，从而导致向成骨细胞的分化减少。已有学者采用降脂类药物对股骨头缺血性坏死进行了实验研究及临床的防治并取得较好效果^[11] ，其机制可能与抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化进而间接促进成骨转化有关^[12] ；同时，通过组织学和病理学的观察，在激素性股骨头缺血性坏死早期其病理变化均表现为股骨头骨髓内脂肪细胞异常增殖、肥大，骨细胞脂肪变性、坏死^[13] 。近年来有大量实验证实骨髓间充质干细胞有同时向成脂和成骨方向分化的能力，大剂量激素能够诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，使成骨分化减少，成骨细胞与脂肪细胞两者可以相互转换，并且存在“此消彼长”的关系，脂肪细胞标志物表达增加往往伴随着成骨标志物表达减少，因此通过抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化并促进其分化为更多的成骨细胞，从而有效地促进骨形成，减少骨髓腔内脂肪细胞的堆积，降低产生骨内高压以及静脉淤积，从而防治股骨头坏死。
Wnt信号通路以其启动蛋白为Wnt蛋白而命名，与细胞的分裂、生长、分化、凋亡密切相关^[14] 。根据Wnt蛋白转导信号的途径、方式，可分为经典Wnt信号途径和另外2条细胞平面极性通路和Wnt/Ca ²⁺通路的非经典Wnt信号途径^[15] ，在经典Wnt通路中，主要通过稳定积蓄β-catenin使之进入核内，激活靶基因^[16] 。具体机制可能是Wnt蛋白与其特异性受体卷曲蛋白及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白结合后，激活散乱蛋白，使 GSK-3β、APC和Axin形成的蛋白复合物的活性受到抑制，导致内源性β-catenin在细胞质中积聚并进入细胞核，与其下游信号分子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(Tcf/Lef)等互相作用，激活经典Wnt信号途径的相关靶基因，发挥调控作用^[17]。Wnt通路的激活不仅可以抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，同时还可以促进其向成骨细胞分化^[18] 。近些年，有的学者已证明Wnt信号通路对脂肪细胞的分化具有直接调节作用^[19-20] 。在针对wnt10b转基因肥胖型鼠的研究结果亦提示，Wnt/β-catenin信号通路的启动蛋白之一wnt10b能抑制脂肪组织的发育、生成，而且其效果在白色或棕色脂肪没有差异^[21] ，在成脂分化过程中，Wnt抑制因子DKK1的短暂上调，均会观察到LRP5和LRP6的短暂下调，间接说明Wnt信号通路抑制脂肪细胞分化^[22] 。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心成员，通过GSK3β的磷酸化及泛素蛋白酶体系统进而降解，使之游离在胞浆保持较低浓度，无法转运到细胞核内产生生物学效应^[23] ，因此β-catenin是Wnt信号转导途径的正向调节因素，而GSK-3β等是负向调节因素^[24] ，GSK-3β通过抑制Wnt通路，调节细胞的增殖、分化和凋亡。
据《本草纲目》载：“葛根，性凉、气平、味甘，主入脾胃经。有发表解肌，升阳透疹，清热、降火、排毒诸功效”。葛根在中药中虽然归属解表药，但临床应用方面，葛根具有良好的扩张冠状动脉、抗心肌缺血、抗血小板凝聚和保护血管等类似活血化瘀中药的作用。其主要有效成分为葛根素。现代药理研究提示葛根提取物葛根素具有良好的降脂^[25] 、抑制动脉硬化，促使血管软化^[26] 、改善缺血再灌注损伤^[27] 、抗血小板凝聚、扩张冠状动脉、抗心肌缺血和保护血管内皮细胞等药理作用^[28] 。很多学者对葛根素药理作用机制进行了大量深入的研究，王久亮等^[29]发现葛根素对大鼠成骨细胞有增殖和分化的影响，作用机制是通过影响碱磷酸酶活性促进成骨细胞分化，通过雌激素受体介导促进成骨细胞的骨形成效应。殷晓雪等^[30]采用小鼠骨髓干细胞定向诱导分化的成骨细胞模型研究也证实葛根素能够促进成骨细胞增殖，提高碱性磷酸酶活性。李灵芝等^[31]在研究中也证实葛根素能够抑制破骨细胞性骨吸收，也能促进骨形成。亦有研究发现葛根素可以通过骨保护素/ RANKL系统促进成骨细胞的增殖和分化^[32] ，通过抗氧化作用，抑制细胞凋亡，发挥对H2O2诱导骨髓间充质干细胞发生氧化损伤的保护作用^[33] 。葛根素抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化也已被课题组先前的研究及其他学者相关研究所证实^[34-35] 。
本实验结果表明，骨髓间充质干细胞经地塞米松处理后，信号通路中的关键因子Wnt10b mRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达均有不同程度的明显下调，而在葛根素干预后则能使上述指标明显上调，而GSK3β mRNA的表达则几乎与此相反，从葛根素各剂量组之间比较也可见有剂量上的差异，中剂量组干预效果最好，低剂量组相对较差。研究结果提示，葛根素对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用可能是通过上调Wnt/β-catenin信号传导通路的关键因子Wnt10b mRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达，或降低GSK3β mRNA的表达从而使骨髓间充质干细胞保持未分化状态，保留干细胞特性而干预激素性股骨头缺血性坏死的发生发展。提示葛根素防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头局部的微循环，同时还与其抑制激素诱导下的骨髓间充质干细胞成脂分化有关。但这些关键因子具体是如何作用还有待于进一步的研究和证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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