2.1  不同单侧输尿管梗阻结扎方法成模结果比较  手术方案比较实验中，20只雄性SD大鼠于术后14 d处死、解剖并统计成模率，结果见表1。①假手术组大鼠术后存活率100%，创口愈合良好，14 d解剖时1只大鼠手术部位有轻度脏器粘连，术后并发症发生率20%；②传统单侧输尿管梗阻组术后第3天1只大鼠死亡，解剖见腹腔感染与脓液，存活率80%，成模率100%，14 d解剖时1只大鼠手术侧睾丸萎缩、1只大鼠肝脏硬化衰竭，并发症发生率60%；③改良单侧输尿管梗阻组术后存活率100%，成模率100%，14 d解剖时1只大鼠肝脏部位轻度粘连，术后并发症发生率20%，较传统组存活率高且并发症发生率低；④不游离输尿管结扎组，术后存活率100%，成模率60%，14 d解剖时发现中度腹腔脏器粘连2只，术后并发症发生率40%，较传统组存活率高，但成模率下降，存在一定并发症发生率。

2.2  改良单侧输尿管梗阻成模大鼠尿液分析结果  病理生理数据分析实验中，大鼠尿液分析结果见表2。假手术组与改良组大鼠尿液指标未见明显异常，均在实验动物正常值范围内，不具有生物学意义。

2.3  改良单侧输尿管梗阻成模大鼠血液生化分析结果  病理生理数据分析实验中，大鼠血液生化分析结果见表3。术后14 d时，假手术组各指标均在实验动物正常值范围内，改良组雌雄性大鼠的谷草转氨酶、白蛋白、尿素氮指标均偏离正常值范围，建模成功。改良组雌性大鼠的谷草转氨酶、碱性磷酸酶、血糖、尿素氮、肌酐、三酰甘油、钾离子、胆碱酯酶水平，以及雄性大鼠的碱性磷酸酶、血糖、尿素氮、三酰甘油水平明显高于假手术组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。雌性大鼠白蛋白水平以及雄性大鼠谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、胆碱酯酶水平明显低于假手术组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.4  改良单侧输尿管梗阻成模大鼠血细胞分析结果  病理生理数据分析实验中，大鼠血细胞分析结果见表4。术后14 d时受炎症影响，假手术组雌雄性大鼠的中性细胞比率、淋巴细胞百分比、单核细胞百分率指标，改良组雌性大鼠中性细胞比率、单核细胞百分率、血红蛋白以及雄性大鼠中性细胞比率、淋巴细胞百分比、单核细胞百分率指标均偏离正常值范围。与假手术相比，改良组雌性大鼠白细胞与中性细胞比率指标升高而淋巴细胞百分比、碱性粒细胞百分率、血红蛋白指标降低(P < 0.05)，雄性大鼠的中性细胞比率指标升高，而淋巴细胞百分比、碱性粒细胞百分率、血红蛋白指标降低(P < 0.05)。

2.5  改良单侧输尿管梗阻成模大鼠组织病理结果  大鼠肾脏组织病理学结果见图2，改良组大鼠术后14 d与21 d大体解剖时，未梗阻侧肾脏未见异常病变，梗阻侧肾脏可见明显的输尿管膨大、肾盂积液、肾脏充盈肿大病理现象，见图1D，E，部分梗阻侧肾周见肉芽包裹体。术后21 d与14 d相比，梗阻侧肾脏组织进一步萎缩退化，多形成空囊，可供病理检测样本组织减少，见图1F。

术后14 d，假手术组大鼠肾脏组织病理切片的苏木精-伊红染色结果无明显异常改变，肾小球与肾小管结构清晰完整，见图2a，b，改良组大鼠梗阻侧肾脏肾盂积水、肾小盏结构消失，肾小管管腔扩张，肾小球完全蹋陷，微血管结构消失，见图2c-f，Masson染色时残余肾大盏与肾盂见大量蓝绿色胶原纤维沉积，见图2d，f，呈典型肾间质纤维化病理特征，不同性别SD大鼠间的组织病理结果未见差异。

肾纤维化是各种慢性肾病终末期共同的病理改变，包括肾小球硬化和肾间质纤维化^[1]。肾纤维化动物模型包括药物诱导模型、单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型、基因敲除模型等^[2-4]。药物诱导是采用氯化汞、马兜铃酸、阿霉素等有明确肾毒性的化合物，以灌胃或腹腔注射的方式直接损害动物肾脏，或破坏胰岛功能间接加重肾脏负担的方式进行造模。作为基础研究的常用造模方法，药物造模具有简便易行的优点，但实验周期长(1-3个月)、毒物诱发肾纤维化的病理过程与临床差异较大，受试动物常见多脏器损伤与代谢指标异常，干扰实验药物药效结果的判断。

与药物造模方法相比，以手术方法结扎动物输尿管，可使受试动物在2周内快速形成梗阻性肾病变，且无外毒素的干扰。输尿管梗阻会引起肾血流动力学和代谢的明显改变，肾小管损伤，细胞凋亡或坏死，间质巨噬细胞浸润并发展为肾间质纤维化，十分接近于人类自发的病理过程。许多可量化的病理生理指标在单侧输尿管梗阻术后1周时间内即可发生，因此通过手术产生的单侧输尿管梗阻，可以根据成模时间控制肾纤维化的严重程度，可进一步进行梗阻后再通的恢复实验研究，也可以结合基因敲除动物模型分析肾纤维化的发病机制，已成为研究肾纤维化机制和评估潜在治疗方法对肾脏疾病影响的重要模型，但传统的单侧输尿管梗阻手术方法并不完美^[5-7]。

早期的研究多选择家兔、狗与灵长类进行单侧输尿管梗阻操作，目前大鼠、小鼠等啮齿类已经成为单侧输尿管梗阻实验的首选动物^[8-10]。小鼠具有实验成本低、腹部脂肪少、输尿管游离结扎难度低的优点，见图1A，并且基因敲除小鼠单侧输尿管梗阻已被广泛用于肾纤维化分子机制的研究，近30年来报道明显增多^[7，11-15]。由于小鼠肾脏较小，可提供尿液分析与血液分析的实验样本量较少，大鼠仍然是当前药理与毒理学基础研究中使用最广泛的实验动物^[16-21]。大鼠在单侧输尿管梗阻手术成功后，肾间质纤维化成模率可达100%，但大鼠腹部脂肪较多且完全包裹输尿管，见图1B，单侧输尿管梗阻操作时输尿管的游离结扎具有一定难度，术后多见并发症，死亡率也较高^[22]。

传统的大鼠单侧输尿管梗阻结扎方式为：腹部备毛消毒，沿腹中线或手术侧腹部开创，分离暴露右肾，游离右肾近肾盂处输尿管，于紧靠肾盂处约1 cm的肾下极处(或输尿管上1/3水平)2次结扎，并剪断两结扎部位之间输尿管^[5]。该结扎方式类似于人类肾盂附近自发输尿管梗阻导致肾盂积液，最终发展为肾间质纤维化的发病特点，认可度较高。但由于大鼠该解剖部位的输尿管呈弧状、完全包裹于腹壁脂肪中，并且距离肝脏、脾脏、胰脏均较近，操作具有一定难度，繁琐的手术操作常导致动物术后并发胰腺炎、脏器粘连、腹腔感染，甚至死亡。此次实验采用游离输尿管中段，结扎2次，间距<1 cm，中间输尿管不剪断的改良操作方法，与传统大鼠单侧输尿管梗阻结扎方式以及不游离输尿管结扎方式进行比较，分析动物术后成模率、死亡率、并发症发生率的差异，并进一步检测改良单侧输尿管梗阻成模大鼠的主要病理生理指标，为该模型的基础研究提供背景数据支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  动物手术造模实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年4至8月在南京医科大学公共卫生学院江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心完成。

1.3  材料

1.3.1  造模动物  SPF级SD大鼠48只，雌性14只，体质量200-260 g，雄性34只，体质量300-430 g，购自南京医科大学医药实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-0002，饲养于江苏省医药农药兽药安全性评价与研究中心屏障环境，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2015-0009，环境温度20-26 ℃，相对湿度40%-70%，动物照明15-20 Lux，12 h/12 h明暗交替。辐照灭菌实验鼠维持饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证(2014)01008。

将检疫合格的大鼠分别进行手术方案比较实验(雄性20只)与病理生理数据分析实验(雄性14只，雌性14只)。实验方案经南京医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为IACUC-1711019。

1.3.2  实验试剂与仪器  水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；快速Masson染液(南京建成科技有限公司)；尿液分析试纸条(H11-II)(长春瑞迪医疗科技股份有限公司)；临检与病理检测仪器配套试剂(SIEMENS)；H-300尿液分析仪(长春瑞迪医疗科技股份有限公司)；7100全自动生化分析仪(日立高新国际贸易有限公司)；ADVIA 2021i全自动血液分析仪(SIEMENS)；Tissue-TekVIP6全自动组织处理机(樱花医疗科技有限公司)；FINESSE325石蜡切片机(英国山顿)；Gemini AS全自动染片机(赛默飞)。

1.4  实验方法

1.4.1  单侧输尿管梗阻结扎方案  手术方案比较实验中，使用雄性SD大鼠20只，按体质量随机分为传统单侧输尿管梗阻组、改良单侧输尿管梗阻组、不游离输尿管结扎组、假手术组，共4组，每组5只。术前大鼠隔夜禁食，自由摄水。手术时以现配的100 g/L水合氯醛溶液按400 mg/kg给药体积腹腔注射麻醉，腹部备毛，以体积分数75%乙醇消毒手术部位皮肤，自腹中线右侧开创，使用眼科镊游离输尿管，见图1C。

①传统单侧输尿管梗阻组：于游离输尿管的近肾盂端(即上端1/3处)结扎2次，间距1 cm，中间剪断；②改良单侧输尿管梗阻组：于游离输尿管的中段(1/2处)结扎2次，间距<1 cm，中间不剪断；③不游离输尿管结扎组：不游离输尿管，结扎输尿管与包裹脂肪2次，间距1 cm，中间不剪断；④假手术组：腹部开创后暴露肾脏，游离输尿管但不结扎。各组术后分别缝合肌肉层与皮肤层，以碘伏消毒创口，每只大鼠注射4 500 U氨苄青霉素，继续禁食禁水4 h。

手术方案比较实验术后，每日观察并记录各组实验动物异常体征及死亡情况，于术后14 d时处死全部实验动物。实验过程中死亡的动物及实验结束时处死的动物均进行大体解剖观察，双侧肾脏及可见明显病变的脏器均使用甲醛固定，制片后进行病理组织学分析。

1.4.2  血液与尿液样本的采集与测定  病理生理数据分析实验中，使用SD大鼠28只，按体质量随机分为假手术组与改良单侧输尿管梗阻组(改良组)，每组14只，雌雄各半。术前隔夜禁食，100 g/L水合氯醛麻醉，假手术组大鼠腹部开创后缝合，不结扎输尿管；改良组大鼠游离输尿管后于中段(1/2处)结扎2次，间隔<1 cm，中间不剪断。

术后14 d，以导尿法收集大鼠尿液，检测尿胆原、胆红素、酮体、血、蛋白质、亚硝酸盐、白细胞、葡萄糖、比重、酸碱度参数指标；以医用采血管自腹主动脉采全血，检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、胆碱酯酶(CHE)血液生化指标，以及白细胞(WBC)、中性细胞比率(NEU%)、淋巴细胞百分比(LYM%)、单核细胞百分率(MONO%)、碱性粒细胞百分率(EOS%)、嗜碱性粒细胞百分率(BASO%)、血细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)全血细胞分析指标。

1.4.3  组织病理学检查  病理生理数据分析实验中，术后 14 d时每组处死10只(2组共20只)，术后21 d时每组处死4只(2组共8只)，解剖取双侧肾脏使用甲醛固定，见图1D-F，常规石蜡制片。苏木精-伊红染色法：苏木精染色5 min，1%盐酸乙醇30 s，0.5%伊红液染色3 min，清洗后脱水封固。Masson染色法：苏木精染色5 min，盐酸乙醇30 s分化，Masson丽春红酸性复红液5 min，2%冰醋酸浸片片刻，1%磷钼酸水溶液分化3-5 min，苯胺蓝染液染色3-5 min，清洗后脱水封固。

1.5  主要观察指标  ①手术方案比较实验：比较组间大鼠肾间质纤维化成模率、死亡率、术后并发症发生率的差异；②病理生理数据分析实验：比较两组大鼠的生理指标和肾脏组织病理形态。

1.6  统计学分析  使用cellSens Entry型成像系统进行动物肾脏组织病理切片图像采集。各组实验原始数据使用SPSS 10.0软件进行分析，血生化与全血细胞分析结果以x(_)±s表示，组间数据满足方差齐性时，采用t 检验统计处理，P < 0.05为差异有显著性意义；分率数据以卡方检验进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

啮齿类单侧输尿管梗阻建模是多种肾病药理实验的理想动物模型，术后成模时间短，梗阻侧肾脏组织呈典型间质纤维化病理特征，是研究肾间质纤维化机制的首选模型^[23-24]。传统大鼠单侧输尿管梗阻建模方法，动物死亡率较高，常见致死原因包括：①手术操作：输尿管包裹于大鼠腹腔后壁脂肪中，自腹腔开创结扎时需拨离肠道等脏器，若结扎部位接近肝脏、胰脏与脾脏，游离与结扎输尿管操作极易损伤周围脏器，导致术后并发胰腺炎、腹腔感染、肠道应激综合征，严重的并发症可导致动物死亡；②手术护理：动物在手术过程中失血、体温过低，术中无菌条件未达标，可导致术后腹腔感染、脏器粘连(成年大鼠更为明显)，影响大鼠愈后；③麻醉剂：水合氯醛是啮齿类动物手术常用麻醉剂，但不足以提供足够的镇痛作用，且可诱发大鼠肠梗阻、腹膜炎等肠道问题^[25]，因此单侧输尿管梗阻术后，大鼠常出现不同程度厌食、应激性高血糖现象，严重者可致死亡。

综上所述，单侧输尿管梗阻操作需要有经验的动物外科医生来进行，要求实验人员熟悉输尿管解剖结构、熟练剥离与结扎操作，以减少实验过程中的开创大小，尽可能缩短手术时间。手术过程中需严格控制麻醉剂用量，术后适当禁食禁水，以减弱麻醉剂对实验动物肠道功能的影响，提高存活率。实验动物术前禁食，严格消毒器械、备皮并消毒手术部位，在手术过程中使用恒温温控手术台、适当的麻醉剂、高质量双目显微镜操作，术后注射抗生素也可以降低发病率和死亡率^[5]。

多项研究表明，在输尿管近肾盂端双结扎，剪断中段的操作，虽然为最接近临床发病特征的结扎方式，但于输尿管近肾盂端和近膀胱端双节扎，甚至于输尿管下端结扎，同样可以建立大鼠单侧输尿管梗阻模型^[26-28]。HESKETH等^[28]实验表明，于输尿管近肾盂结扎和近膀胱结扎，对梗阻侧肾脏纤维化病程和病变并无实质性影响。刘克剑等^[22]研究也发现，在输尿管双栓结扎后采用中间不断开的改良方法，可以降低实验动物死亡率。

传统单侧输尿管梗阻结扎术中操作极易损伤附近脏器，操作具有一定难度。此次实验采用输尿管中段双节扎，中间不断开的改良操作方法，有效减低了操作难度，缩短了手术时间，降低了主要脏器术中受损的风险。较传统输尿管近肾盂端结扎相比，手术开创更小、输尿管游离更易、术后并发症更少、死亡率更低。采用苏木精-伊红染色与Masson染色法比较术后14，21 d大鼠肾脏组织切片的病理结果，证实改良单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化病理结果明确，具有与传统单侧输尿管梗阻一致的病理特点，术后成模大鼠尿素氮、谷草转氨酶、白蛋白血液生化指标显著升高，可以作为肾脏功能受损、肝脏负担加重的标志性指标。

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文题释义：

肾盂积液：输尿管完全或不完全梗阻时，由于尿液无法正常排出体外而导致肾盂积液。慢性肾盂积液引起的肾脏损伤是不可逆的，可由多种上尿路梗阻性疾病诱发，导致肾盂肾盏扩大，肾小管与肾小球结构与功能丧失，进而肾组织萎缩。

肾间质纤维化：是各种慢性肾病发展至终末期的共同病理特征，以肾小管间质瘢痕硬化为特征，最终导致肾脏组织功能完全丧失。该过程受到转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、内分泌等信号通路的调控，肾间质纤维化动物模型是研究相关药物药理机制的重要模型。

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通过对实验动物实施单侧输尿管梗阻术，模拟临床肾盂积液致肾间质纤维化的病理过程，是基础研究常用的药理实验建模方法。继狗、猴等大动物之后，家兔与大鼠、小鼠都有成功建模的报道。目前，大鼠、小鼠单侧输尿管梗阻分别是药物活性初筛、初步药理机制验证以及分子水平药理机制研究的首选动物模型。新的技术包括输尿管不完全梗阻、梗阻后再通术的应用，通过模拟临床不同病理阶段，进一步扩大了药理机制研究模型的种类，单侧输尿管梗阻仍为基础与经典的肾间质纤维化建模技术。如何建立稳定、成模率高、并发症少的大鼠单侧输尿管梗阻模型，有重要的基础研究意义。

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