2.1  实验动物数量分析  实验选用青脚麻鸡24只，分为2组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2  术后一般情况  术后24只青脚麻鸡均存活。

实验组3只青脚麻鸡因感染出现股骨头处的脓包(图3)；对照组有1只出现相同感染。通过抗感染治疗后，1周左右脓包均消退。造模后3 d，所有青脚麻鸡均能站立行走，且无明显跛行，关节未见明显畸形表现，也无关节脱出，切口愈合良好。

2.3  传统影像学检查结果  造模1个月后，X射线结果显示，实验组的股骨头骨皮质变薄，骨小梁不清晰，且股骨头顶端植入部位可见明显的塌陷关节面塌陷(图4A)；对照组的股骨头，骨小梁清晰，股骨头光滑，未见明软骨塌陷(图4B)；未处理组股骨头骨皮质厚，骨小梁清晰，且股骨头表面光滑，未见明显软骨塌陷(图4C)。

从CT扫描的结果来看，实验组在显示出明显的股骨头塌陷，股骨头表面欠光滑，骨小梁看不清(图5A)；对照组的股骨头表面较光滑，有轻微塌陷(图5B)；未处理组的股骨头表面圆润光滑，未见明显软骨塌陷(图5C)。

2.4  体外股骨头标本大体观察  随机选取12只未处理组股骨头，将3组取出的股骨头标本清理完整并放入含有40 g/L多聚甲醛的标本袋中冷冻保存。实验室取出股骨头标本进行大体观察、测量和记录。结果显示，未处理组的股骨头生长良好，表面均匀光滑，无增生和凹陷(图6A)；对照组的股骨头表面大致光滑，但可见部分软骨增生，未见明显凹陷(图6B)；实验组的股骨头可见表面欠光滑，且可见一明显的塌陷，按之可见塌陷内坏死组织，为软化的松质骨和股骨头表面软骨组成(图6C)。

2.5  microCT检查  microCT采用微焦点X射线球管对微小物体进行扫描，成像范围较CT小，但其分辨率高，可以有效计算出被测骨质的骨小梁密度，microCT影像学结果见图7。

根据microCT影像学结果可以看出，未处理组的骨小梁完整且分布均匀，无明显骨小梁增粗或塌陷的表现；对照组的骨内壁完整，骨小梁无明显增粗或缺失；实验组的骨内壁大面积缺失，骨小梁紊乱且数量低。根据microCT的实验数据统计均数和标准差并分析结果。

表1显示，对于骨体积分数，对照组和未处理组对比差异无显著性意义(P > 0.05)，而实验组分别与对照组和未处理组对比差异有显著性意义(P < 0.05)；平均小梁数量未处理组>对照组>实验组，差异均有显著性意义(P < 0.05)；平均小梁厚度实验组和对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，未处理组显著低于其他2组(P < 0.05)；平均小梁间距3组数据差异均有显著性意义(P < 0.05)。因此，根据统计结果可以看出：与对照组和未处理组相比，造模后的实验组的骨小梁增粗、骨小梁数量减少、骨小梁间距增加、骨体积分数增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.6  病理切片染色结果  未处理组的股骨头和对照组股骨头在×400倍镜下形态接近，未有明显坏死征象，但是同一个视野下对照组软骨下小血管的数量较未处理组少，而实验组股骨头在镜下表现为软骨下小血管的数量较对照组和未处理组有明显减少，细胞排列紊乱，血管内壁可见有增生，可以看到空骨陷窝，同时还能看到骨小梁紊乱且形态不规则。见图8。

股骨头坏死是骨外科的常见疾病，因其致残率高，以致严重影响患者的生活质量^[1]，早期若没有经过有效的治疗，75%的患者将在3年后发生股骨头塌陷，最终导致严重的髋关节骨性关节炎^[2-3]。股骨头坏死的病理机制主要是各种原因引起的股骨头血液循环障碍，从而进一步导致骨细胞的缺血坏死和骨小梁断裂，最终导致股骨头塌陷的一系列病理变化^[4-5]。股骨头坏死的发病原因可以分为两种：创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死^[6]，前者主要由股骨颈骨折、髋臼骨折、髋关节脱位等外伤因素作用引起的周围血管损伤后导致的股骨头缺血坏死^[7]；后者的发病原因和机制较为复杂，研究表明可能与皮质类固醇激素的大量使用、酗酒、病毒感染、肥胖、骨质疏松等有关^[8-9]。然而，对于股骨头坏死的病理机制尚未有明确定论^[10]，因此，对股骨头坏死的病理机制的研究迫在眉睫，而该研究的实施首先需要解决股骨头坏死造模的问题。目前，文献中报道的股骨头坏死动物模型的选择多种多样，主要有大鼠、新西兰兔、比格犬和山羊等，但均有其局限之处。

此次实验创造性的选择青脚麻鸡作为实验动物，该动物具有生长速度快和双足负重等优势。采用乙醇反复多次浸润青脚麻鸡股骨头内松质骨的方法进行股骨头坏死的造模，该种方法可以成功诱导人工骨小梁的破坏。一方面对动物股骨头进行钻孔导致的机械性损伤可引起骨坏死^[11]，另一方面，相关文献研究表明乙醇可引起脂质代谢紊乱，增加骨内压或引起内源性糖皮质激素水平升高等方式最终进展为股骨头坏死^[12-15]。实验希望通过青脚麻鸡建立一个简单、易用的股骨头坏死动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年4月至2019年2月在山东省医学科学院药物安全评价中心和山东省医学科学院药物研究所完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康青脚麻鸡24只，由山东省医学科学院药物安全评价中心动物房提供，年龄平均为2个月，体质量平均2 kg。

1.3.2  实验器材  电动环钻(SAEYANG MICROTECH)由山东省医学科学院药物安全评价中心提供；数字化X射线摄影系统(Medical Instrument System Co.,Ltd.)与全身用X射线计算机体层摄影装置(航卫通用电气医疗系统有限公司)均由山东省医学科学院颈肩腰腿痛医院提供；显微计算机断层摄影扫描(microComputed Tomography，microCT)设备(SCANCOMedicalAG公司)由上海诺辰生物技术有限公司提供。

1.4  实验方法

1.4.1  实验分组  24只青脚麻鸡(48侧股骨头)随机分成实验组和对照组。任选青脚麻鸡的一侧股骨头作为手术侧，其对侧为未处理组不对任何手术处理。其中实验组采用乙醇灼烧青脚麻鸡手术侧股骨头松质骨后将原骨植入，对照组直接在手术侧将原骨植入。实验组、对照组及未处理组每组12侧股骨头(未处理组随机选12侧)。

1.4.2  造模方法和技术路线  技术路线见图1。

造模前8 h禁饮禁食，造模开始前完全随机挑选1只青脚麻鸡，称质量并记录，将鸡固定好后从其一侧的翅根筋脉缓慢注射3%的戊巴比妥钠诱导麻醉(图2A)，麻药量为(体质量×1.2) mL，可视麻醉效果适当增减，当用镊子夹持一侧跖骨垫而鸡无明显抵抗反应时则表明麻醉成功。此时随机选取一侧作为手术侧，将鸡摆成侧卧位且手术侧朝上，将手术侧髋部股骨头中心周围5 cm范围内进行脱毛和备皮处理。

处理完后将鸡取上述体位摆放在温控手术台上，固定鸡翅和鸡头部，对备皮区域使用医用碘伏进行术前常规消毒处理，继而铺无菌洞单，将手术侧髋部股骨头处从洞中露出。使用无菌手术刀从股骨头后背侧进刀围绕髋关节做弧形切口，直到前背侧并向下延伸1.0-2.0 cm(图2B)，然后使用无菌血管钳和无菌电刀逐层分离皮下组织、筋膜、肌肉，直至显露髋关节。

切开髋关节囊和股骨头韧带，并配合外旋操作将股骨头从关节囊内脱出。此时，使用空心电钻对准股骨头顶端垂直进行钻孔(图2C)，钻孔深度为距离股骨头表面5 mm，然后将钻出的组织浸润在有生理盐水的玻璃皿内(图2D)。此时实验组使用小棉球蘸取体积分数为99.7%的无水乙醇后填塞入孔内，将孔填满，灼烧1 min后取出小棉球，此操作循环3次，确保松质骨和无水乙醇充分接触，然后将取出的组织完整放回孔内。对照组则直接将取出的骨组织填塞回孔内。使用骨蜡封闭缝隙，确保股骨头表面光滑完整。

手术结束后使用生理盐水冲洗创口，分层闭合创口并缝合创口。术后使用医用碘伏对创口进行消毒(图2E)，并且肌注头孢曲松钠2.0 mL预防感染。

1.4.3  造模后的处理  造模后详细记录下每只鸡的一般状况，如有无跛行、感染、死亡等，并且于术后1个月行X射线和CT检查，麻醉后进行解剖观察大体情况，并切除股骨头行离体标本的microCT检查，观察骨密度变化。

1.5  主要观察指标

1.5.1  一般情况  造模后观察鸡的存活情况，活动状态，步态，性情，饮食，切口情况，是否存在感染，是否存在关节肿胀或脱出，是否有明显畸形等情况。

1.5.2  传统影像学检查  造模后1个月行双髋X射线检查和CT扫描检查，整体观察双下肢左右是否对称，是否有畸形，进一步观察股骨头的生长情况，外形、大小是否正常，有无股骨头塌陷，股骨头是否有修复的情形，以及股骨头和对应的植入物之间的结合程度等。

1.5.3  体外标本大体观察  传统影像学检查结束后，麻醉后处死所有的实验鸡，即刻取出所有手术侧股骨头。观察股骨头有无断裂、塌陷、缺血、萎缩，表面是否光滑，手术部位的植入物是否在位，有无植入物的脱出，与髋臼之间的活动情况等。

1.5.4  microCT检查  对取出的股骨头样本行microCT检查。观察骨体积分数(BV/TV)即单位体积内骨小梁体积占整个松质骨体积的百分数、平均骨小梁数量(Tb.N)、平均骨小梁厚度(Tb.Th)和平均骨小梁间距(Tb.Sp)等参数，用来评价股骨头骨密度的变化。

1.5.5  病理切片染色  对取出的股骨头进行脱钙处理，将已经脱钙完毕的离体骨样本送往病理实验室进行切片处理，然后使用苏木精-伊红染色，观察相应股骨头的组织细胞形态学特征。

1.6  统计学分析  实验数据结果采用SPSS 25.0统计软件，数据以x(_)±s表示。3组样本各数据之间采用最小显著差异(LSD)t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

此次研究通过对青脚麻鸡股骨头局部钻孔并使用乙醇灼烧，成功建立了股骨头坏死动物模型。结果表明对照组的股骨头表面较未处理组有改变但不明显，而实验组的股骨头表面出现了明显的软骨塌陷。另外，microCT统计学结果显示单纯对股骨头造成人工骨缺损(对照组)并不能导致明显的骨体积分数的升高，而用乙醇处理后的股骨头(实验组)则出现了明显的骨体积分数的升高；3组骨小梁数量相比，实验组和对照组的平均骨小梁数量较未处理组均出现了明显的减少。组织病理切片染色的结果显示未处理组和对照组未有明显坏死征象，但对照组的软骨下血管的数量较未处理组减少，而实验组表现为骨小梁紊乱不规则，软骨下血管明显减少，且能看到空骨陷窝。结合上述microCT统计学和组织病理切片染色的结果可以看出，人工制造的股骨头骨缺损会导致平均骨小梁数量的减少，但并没有发展为股骨头坏死阶段，而乙醇灼烧则会进一步减少骨小梁的数量，并且最终发展为股骨头坏死，此为股骨头坏死的病理学特征之一^[13]。同时未处理组股骨头未见明显骨修复反应，而对照组和实验组均出现了不同程度的骨修复反应，且实验组的骨修复表现较对照组明显。实验结果显示实验组的股骨头出现了明显的股骨头坏死，且其形态学改变与人类相似。此外，使用该方法造模后的动物均出现了不同的骨修复反应，这表明该方法不会影响造模动物的股骨头坏死后骨组织的正常修复反应。

目前已有学者使用其他动物建立了股骨头坏死的模型，但均有优缺点。OKAZAKI等^[14]通过给雄性Wistar大鼠喂食含有体积分数5%乙醇的液体饮食模拟人酗酒的行为，仅在1周后便有部分大鼠出现了股骨头坏死，该方法虽然可以在一定程度上模拟人酗酒状态下股骨头的病理生理进程，但坏死率不高，且均为早期骨坏死表现，不适用于晚期股骨头坏死的研究^[15]。陈东等^[10]使用骨穿针套管将无水乙醇注入到新西兰兔的股骨头中心，6周时出现了关节面塌陷，新月体形成，成功建立了兔股骨头坏死的模型，然而由于新西兰兔长期处于蹲卧位，日常下肢基本不负重，这与人类下肢的负重情况差距甚大。ZHU等^[16]直接将无水乙醇注入到山羊的双侧股骨头中央，并在25周时观察到了明显的股骨头破坏征象，成功诱导了山羊股骨头坏死模型。MOTOMURA等^[17]同样将无水乙醇注入绵羊股骨头中心，最终羊股骨头中心出现了坏死。WANG等^[18]使用同样方法对成年犬股骨头中心注射无水乙醇成功建立犬的股骨头坏死模型。ZHU，MOTOMURA和WANG由于实验本身的操作限制，因此这3位学者均选择大型哺乳类动物进行实验，但是这些哺乳动物均属于四足负重的动物，与人类的生物力学特征不相符，无法完全模拟人类股骨头坏死后在双足负重状态下的股骨头坏死和修复情况。范猛等^[19]对成年鸸鹋股骨头中心局部注射无水乙醇并成功观察到骨坏死和骨修复反应，鸸鹋为双足负重动物，符合人类的生物力学特性，且该实验结果符合预期。但是鸸鹋体积大，价格贵，饲养要求高等^[20]，无法满足大多数科研的需求。

此次实验选择青脚麻鸡作为实验动物，其主要有以下几个优点：①青脚麻鸡相较于其他品种的鸡，股骨头较大，易于手术操作和术后观察；②青脚麻鸡为双足负重类动物，且其长期处于站立位，股骨头受到的机械应力与人体的生物力学特征相符，能更好地模拟人在负重情况下的股骨头坏死和修复的表现；③青脚麻鸡易获得，易饲养，易搬运，易检测，且死亡率低；④青脚麻鸡生长速度快^[21]，往往短期内就能得到结果，如实验的青脚麻鸡术后1 d大部分即可站立，3 d所有实验鸡都可直立行走，这能一定程度加快实验进程；⑤青脚麻鸡价格低廉，能很大程度减轻科研的经费压力。此外，实验采用单侧股骨头行造模手术，对侧作为空白对照，该造模方法有以下2个优势：①对一侧股骨头造模可以保证对侧下肢的完整性，以利于鸡术后的站立和行走；②使用对侧对照可不用另设未处理组，可以降低实验动物的数量。且实验还有一组原骨取出后直接放回的对照组，此组可以排除因为单纯的人为股骨头骨缺损而对实验造成的干扰和影响。

综上所述，选择青脚麻鸡作为实验动物，通过乙醇灼烧进行造模的方法简单、易行，其造模时间短、恢复速度快，短期内便可出现股骨头坏死现象，且后期出现了坏死骨的修复反应，与人类股骨头坏死的病理生理特征相近，为以后建立双足直立禽类股骨头坏死动物模型提供了可靠的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

microCT：又称为显微CT技术，区别于普通临床CT及microCT，其扫描分辨率高达微米级别，具有很好的“显微”功能。因此在骨组织研究领域，microCT可以很好地研究骨结构和骨密度的数量性指标及微细改变，可指导组织工程、基因工程等科学研究，已逐渐发展为可加强甚至代替组织学分析的一种成熟的技术。

骨体积分数(BV/TV)：是microCT用于骨分析时的参数之一。该参数是骨组织体积与组织体积的比值，可以直接反映骨量的变化情况。对于髓内松质骨而言，该比值能够反映不同样本骨小梁的多少，该值升高说明骨合成大于骨分解，骨量增加，反之亦然。因此该参数在评价骨量和骨代谢方面具有重要的价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

目前已有学者使用其他动物建立了股骨头坏死的模型，但均有优缺点。Okazaki等通过给雄性Wistar大鼠喂食含有体积分数5%乙醇的液体饮食模拟人酗酒的行为，仅在1周后便有部分大鼠出现了股骨头坏死，该方法虽然可以在一定程度上模拟人酗酒状态下股骨头的病理生理进程，但坏死率不高，且均为早期骨坏死表现，不适用于晚期股骨头坏死的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程