1.5.2  总RNA提取和实时定量PCR(qRT-PCR)检测  按照Trizol试剂盒说明书，提取C3H10T1/2细胞和胫骨中的总RNA，借助Nano核酸分析仪测量提取的RNA的浓度和纯度，将反转录获得的DNA(cDNA)进行qRT-PCR，各组样本设3个复孔。qRT-PCR条件：94 ℃下4 min预变性，94 ℃下30 s变性，60 ℃下30 s退火和延伸，然后进行40个循环。根据相对定量2^-??Ct法评价实验中Hoxa9、骨桥蛋白、骨钙素、Runx2及胶原蛋白Ⅰ mRNA的相对表达量。表1列出了实验中所有特异性引物。

2.1.1  不同诱导时相骨髓间充质干细胞中Hoxa9基因表达情况  实验分别对成骨诱导后0，7及14 d骨髓间充质干细胞中Hoxa9 mRNA及蛋白水平进行检测。结果发现：随着诱导时间的延长Hoxa9 mRNA相对表达在降低，且各个诱导时相的差异有显著性意义(P < 0.01)；Western Blot结果显示Hoxa9蛋白相对表达也随着诱导时间的延长呈明显的降低，且各个诱导时相的差异也有显著性意义(P < 0.01)，见图1。

2.1.2  不同转染组骨髓间充质干细胞中Hoxa9 mRNA相对表达及细胞增殖变化  qRT-PCR结果发现：与对照组及MSCV阴性转染组相比较，MSCV-Hoxa9转染组中细胞内Hoxa9 mRNA水平显著上调(P < 0.01)；与对照组及sh-对照组相比较，用shHoxa9转染的骨髓间充质干细胞中Hoxa9的表达明显降低(P < 0.01)。CCK8检测结果表明：与对照组相比较，MSCV-Hoxa9组骨髓间充质干细胞的增殖显著增高(P < 0.01)；相反，shHoxa9组骨髓间充质干细胞的增殖明显被抑制(P < 0.01)，见图2。

2.1.3  Hoxa9对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响  骨髓间充质干细胞分组及处理情况同1.4.1，成骨诱导分化培养基诱导培养14 d，茜素红染色检测骨髓间充质干细胞矿化程度，碱性磷酸酶染色检测两组细胞成骨分化能力。结果发现：MSCV-Hoxa9组骨髓间充质干细胞中钙化结节的数量显著低于对照组及各阴性转染组(P < 0.01)；碱性磷酸酶染色染色结果显示MSCV-Hoxa9组成骨分化能力低于对照组及各阴性转染组，碱性磷酸酶活性定量分析结果显示，MSCV-Hoxa9组成骨分化能力明显低于对照组及各阴性转染组(P < 0.01)。而shHoxa9组骨髓间充质干细胞的钙化结节数、成骨分化能力及碱性磷酸酶活性显著高于对照组及各阴性转染组(P < 0.01)。表明Hoxa9对骨髓间充质干细胞的钙化和碱性磷酸酶表达均具有调节作用，见图3。

2.1.4  不同转染组骨髓间充质干细胞中成骨分化相关基因及蛋白表达情况  qRT-PCR检测结果显示，与对照组及各阴性转染组相比较，MSCV-Hoxa9组细胞中骨桥蛋白、骨钙素、Runx2和胶原蛋白Ⅰ基因的mRNA相对表达显著下调(P < 0.05)；而shHoxa9组骨髓间充质干细胞骨桥蛋白、骨钙素、Runx2和胶原蛋白Ⅰ基因的mRNA相对表达明显高于对照组及各阴性转染组，且差异也具有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

Western blot检测结果显示：在成骨分化过程中，与对照组及各阴性转染细胞相比，shHoxa9转染的骨髓间充质干细胞中成骨相关蛋白骨桥蛋白、骨钙素、Runx2及胶原蛋白Ⅰ的相对表达显著上调(P < 0.05)，而MSCV-Hoxa9组细胞中骨桥蛋白、骨钙素、Runx2和胶原蛋白Ⅰ蛋白的相对表达显著下调(P < 0.05)，见图5。

2.2.1  Hoxa9基因对大鼠胫骨骨折愈合的影响  为研究Hoxa9在体内的功效，将大鼠胫骨骨折模型用于实验。X射线片检查显示：对照组大鼠骨折线清晰；与对照组相比，pNGVL-1-Hoxa9组骨折线更明显；shHoxa9组的骨折线在治疗4周后几乎消失，见图6A。

苏木精-伊红染色显示：对照组中纤维性愈合损伤组织和骨性愈合损伤组织增加，而pNGVL-1-Hoxa9组中骨性愈合损伤组织较对照组更加明显，见图6B。治疗4周后，经shHoxa9组大鼠显示骨的大小和数量明显增加，见图6B。用Masson和碱性磷酸酶染色检测组织间胶原纤维和愈合损伤组织内的软骨。如图6B所示，在骨折治疗后28 d，shHoxa9组的胶原纤维面积较大，而软骨面积明显小于对照组，与苏木精-伊红染色结果一致。

2.2.2  各组体内成骨相关基因表达情况  实验进一步评估了治疗4周后Hoxa9对愈合损伤组织中成骨相关基因mRNA的影响。由愈合损伤组织的RT-PCR结果表明：与对照组及各阴性组相比较，shHoxa9组骨桥蛋白、骨钙素、Runx2和胶原蛋白Ⅰ基因的mRNA相对表达明显上调(P < 0.05)；而MSCV-Hoxa9组骨桥蛋白、骨钙素、Runx2和胶原蛋白Ⅰ基因的mRNA相对表达显著下调(P < 0.05)，见图7。

有研究显示，在西方国家骨折的总发生率为每10万人中有300-400例的比例存在^[1]。高能创伤是胫骨骨折的主要原因，其中包括机动车辆事故和其他日常危险事件^[2]。严重的胫骨骨折伴有较高的延迟愈合或不愈合率，绝大多数会造成患者出现残疾及预后不良等后遗症^[3]。也有研究发现骨髓间充质干细胞的成骨分化有助于代谢和骨折愈合^[4]。近年来，基因治疗在成骨分化和骨折愈合中的应用已备受各界学者的青睐。

人类疾病中已发现有39种HOX基因异常表达，其中许多基因能够影响细胞进程，包括细胞增殖、侵袭和凋亡^[5-7]。同源盒蛋白是果蝇中描述的含同源域的转录因子家族，其在细胞发育过程中产生同源转化，影响细胞的增殖与分  化^[8]。Hoxa9又称为含同源结构域的转录因子，在人类急性白血病^[9]、胶质母细胞瘤^[10]、非小细胞肺癌和骨髓增生异常综合征等疾病中均发挥调节作用^[11-12]。近期研究发现Hoxa9通过转录调节EPHB4表达来调节子痫前期发病过程中滋养细胞的迁移和侵袭^[13]，也可促进人类胚胎干细胞的造血作用^[14]。且Hoxa9在原始造血细胞中优先表达，而在分化过程中被下调^[15]。同时，最近有研究显示Hoxa10基因受到miRNA的调节后与成骨分化存在一定关联性^[16]。然而，有关Hoxa9在成骨分化和大鼠胫骨骨折愈合中的表达和功能尚未见报道，这也是实验进行创新性探索的一个关键点。

基于此，实验旨在通过构建Hoxa9过表达细胞模型及大鼠胫骨骨折动物模型探讨Hoxa9在成骨分化和大鼠胫骨骨折愈合过程中的作用，为骨折损伤的治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验及动物体内实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年6月至2019年10月在甘肃省人民医院SPF级动物实实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验细胞  小鼠骨髓间充质干细胞系(C3H10T1/2)购自于ATCC细胞库(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)，并根据ATCC推荐的培养环境培养。

1.3.2  实验动物  健康6-8周龄40只SPF级(无特定病原菌)SD大鼠，体质量250-280 g，购自北京维通利华生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。动物放置于SPF级动物房进行饲养，自由进食与饮水。

1.4  实验方法

1.4.1  体外实验

细胞培养：将小鼠骨髓间充质干细胞置于含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素(Life Technologies公司，美国)的DMEM完全培养基，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

分组及转染：用克隆Hoxa9 cDNA的MSCVneo载体反转录病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞系，以获得含Hoxa9过表达的稳定骨髓间充质干细胞系。 对于Hoxa9沉默，采用含有Hoxa9特异性shRNA的pGFP-V-RS载体转染骨髓间充质干细胞。并将非特异性shRNA载体转染骨髓间充质干细胞作为阴性对照。通过Lipo2000转染试剂进行细胞转染，转染48 h后，向细胞添加质量浓度1 g/L嘌呤霉素以去除未转染的细胞。

实验共分5组，分别为未转染对照组、过表达对照组(MSCV组)、过表达组(MSCV-Hoxa9组)、阴性对照组(sh-对照组)、敲低Hoxa9组(sh-Hoxa9组)。取对数生长期的小鼠骨髓间充质干细胞，以2×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于6孔板中，用完全DMEM培养液于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，待其细胞融合度约为80%时，弃去原培养液，换成2 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基(不含抗生素)，向MSCV组、MSCV-Hoxa9组、sh-对照组、sh-Hoxa9组6孔板中分别依次加入含5 mg/L MSCVneo、Hoxa9 cDNA的MSCVneo、Hoxa9特异性shRNA的pGFP-V-RS、非特异性shRNA载体Lipo2000混合液250 μL，用移液枪轻轻吹打混匀，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养继续培养48 h，向细胞添加质量浓度1 g/L嘌呤霉素以去除未转染的细胞。对照组细胞用完全DMEM培养液随行培养48 h。构建稳定的细胞系用于下一步实验。

将细胞(转染和未转染)接种在培养皿中，常规培养基培养3 d，每隔1日换液1次。待细胞浓度达80%时，弃去原培养基，用含有5 mmol/L的β-甘油磷酸酯，100 nmol/L地塞米松和50 mg/L抗坏血酸的成骨分化培养液培养，上述试剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。分别诱导0，7，14 d后，将细胞用于增殖和成骨分化相关实验。

1.4.2  体内实验

建模：大鼠适应性饲养1周后，采用骨缺损法制造胫骨骨折模型。具体手术方法为：采用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(腹腔注射)麻醉大鼠。用三点弯曲法制造胫骨中段骨折，手术切口采用4 mm皮肤切口，用解剖刀片(#15)在膝关节处进行手术切除。暴露胫骨，并通过胫骨至前交叉韧带的附着和半月板前角之间手动引入尖锐探头，以确定髓内针入口的面积。25 G针插入到胫骨远端，针的穿透深度约为22 mm。髓内钉完全穿过胫骨后，用骨切割器将多余的近端针头切断。切口用尼龙缝线闭合。为了改变大鼠胫骨的骨折，构造了3点弯曲钳，尺寸为10.0 mm×0.1 mm。将3点弯曲钳的2个支撑爪设定为7 mm。使用钳子后，目视控制位置，钳子闭合，直到听到裂纹声，钳子的阻力突然下降。此后立即释放了压力。应用上述原理建立大鼠胫骨骨折模型^[17]。通过X射线片检查确认骨折。大鼠皮下注射丁丙诺啡(0.5 mg/kg)镇痛。

分组及干预：将40只骨折大鼠随机分为5组，每组8只：①对照组(无处理)；②pNGVL-1组(空载体注射)；③pNGVL-1-Hoxa9组(过表达Hoxa9注射处理)；④Sh-对照组(敲低空载体注射处理)；⑤shHoxa9组(敲低Hoxa9注射处理)。待大鼠胫骨骨折模型构建成功后，向各组大鼠局部骨折部位按照5 mg/kg治疗剂量依次注射含pNGVL-1，pNGVL-1-Hoxa9，pCMV5.0及pCMV5.0-shHoxa9转染混合物，对照组大鼠于相同部位注射不含任何质粒的转染试剂。4周后，颈椎分离处死所有接受治疗的大鼠，收集各组组织样本，进行组织和分子学相关分析；收集骨样品，采用Faxitron X射线系统(美国Faxitron公司)进行检查，由2名专业影像学专家评估骨折愈合情况。

1.5  主要观察指标

1.5.1  细胞增殖情况检测  取对数生长期的不同组骨髓间充质干细胞以1.5×10⁷ L^-1细胞浓度接种至96孔板，每组6个复孔。待其贴壁后换无血清培养液，施加相应处理后，以CCK-8法检测细胞活力。每孔加入含CCK-8试剂100 μL无血清DMEM培养基，于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱内继续培养1.5 h，在紫外线450 nm波长用酶标仪检测各组的吸光度值。计算细胞的存活率=(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%，实验重复3次。

1.5.2  总RNA提取和实时定量PCR(qRT-PCR)检测  按照Trizol试剂盒说明书，提取C3H10T1/2细胞和胫骨中的总RNA，借助Nano核酸分析仪测量提取的RNA的浓度和纯度，将反转录获得的DNA(cDNA)进行qRT-PCR，各组样本设3个复孔。qRT-PCR条件：94 ℃下4 min预变性，94 ℃下30 s变性，60 ℃下30 s退火和延伸，然后进行40个循环。根据相对定量2^-∆∆Ct法评价实验中Hoxa9、骨桥蛋白、骨钙素、Runx2及胶原蛋白Ⅰ mRNA的相对表达量。表1列出了实验中所有特异性引物。

1.5.3  蛋白质印迹分析检测  将骨髓间充质干细胞以    2× 10⁸ L^-1细胞浓度接种在6孔板中，用含成骨分化培养基培养以诱导成骨分化。培养14 d后收集各组细胞。采用含有体积分数1%蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA缓冲液在冰浴下裂解骨髓间充质干细胞30 min，于4 ℃，15 000×g离心10 min，收集各组蛋白质。利用BCA试剂盒测定各组蛋白质含量。每组样品以40 µg总蛋白质置于SDS-PAGE凝胶上进行电泳。待电泳结束后，将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上。体积分数5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，随后在4 ℃孵育含下列抗体：Hoxa9(1∶500)，骨桥蛋白(1∶500)，骨钙素(1∶500)， Runx2(1∶800)，胶原蛋白Ⅰ(1∶1 000)和β-Actin(1∶1 200)的一抗稀释液过夜，所有抗体均为小鼠种属的多克隆抗体，购自美国Abcam公司。次日用TBST漂洗3次，每次10 min。采用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1∶7 000)稀释液在室温下孵育1 h。最后应用增强的化学发光试剂盒ECL进行显影曝光。采用Image-J软件分析Hoxa9、骨桥蛋白和骨钙素等蛋白的灰度值相对表达情况。

1.5.4  细胞免疫组织化学染色检测  用PBS洗涤诱导14 d的骨髓间充质干细胞3-5次，在体积分数70%乙醇中固定   1 h，用PBS冲洗两三次。随后将细胞用茜素红S于37 ℃孵育10 min，用超纯水轻轻冲洗去除多余的染料。使用光学显微镜鉴定钙沉积物。借助微孔板读数器(Bio-Rad公司，美国)定量与钙沉积物相互作用的茜素红S染色的吸光度。对于碱性磷酸酶染色，用光学显微镜拍摄图像。

1.5.5  组织染色检测  用体积分数10%甲醛溶液固定骨痂组织约24 h，用体积分数5%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脱矿3个月。骨痂组织经脱水、清洗后，石蜡包埋。石蜡包埋标本被切成5 μm厚度放在载玻片上。用苏木精-伊红、Masson或碱性磷酸酶染色，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行操作，测定愈合损伤组织中胶原基质和软骨的含量，可用于评价成骨细胞和骨小梁的形态变化。

1.6  统计学分析  应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量数据采用x(_)±s表示。组间数据差异比较采用单因素方差分析和Dunnett法分析，检验水准α=0.05。

目前骨折是临床常见病和突发病，多见于交通事故、跌倒和高处跌落等意外事故，且骨折发生类型较多、部位不确定^[18-20]，而股骨骨折和胫骨骨折在骨折损伤中较为常见。目前，对骨折的治疗多采用外科手术等疗法进行矫正治疗，但因为手法或年纪等因素存在部分预后不良等问题。因此，探讨骨折治疗的机制及新兴的靶向治疗药物已迫在眉睫。实验通过构建诱导成骨分化模型及大鼠体内胫骨骨折损伤模型探讨Hoxa9基因在骨折损伤治疗中的作用，为骨折的靶向治疗提供理论依据。

骨折损伤研究中关于Hoxa9基因调控作用的研究较少。研究发现骨髓间充质干细胞在体外的成骨分化包括细胞增殖、细胞外基质的成熟和基质的矿化3个阶段^[21]，且在这些阶段中涉及到多种重要转录因子的调控及蛋白的参与，如胶原蛋白Ⅰ、骨钙素、碱性磷酸酶及Runx2等一些关键的转录因子^[22-23]。在成骨分化过程中碱性磷酸酶高表达是钙结节形成的基础，在调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化与成熟的过程中Runx2发挥着至关重要的作用，有研究报道Runx2基因敲除的小鼠完全失去成骨分化能 力^[24]，骨桥蛋白可以促进钙和羟基磷灰石结合并沉积于胞外基质中，是成骨分化晚期的重要标志，可诱导钙结节的形成^[25]。研究报道Hoxa9基因可能是导致白血病的靶基  因^[26]，而有关骨折损伤中Hoxa9对上述转录因子的调节的相关报到较少。

实验探讨Hoxa9基因对体外成骨分化模型及大鼠体内胫骨骨折损伤模型中相关转录因子的影响。结果发现不管是在体外诱导成骨分化模型还是大鼠体内胫骨骨折模型中，过表达的Hoxa9基因可抑制骨髓间充质干细胞及骨组织中胶原蛋白Ⅰ、骨钙素、骨桥蛋白及Runx2等转录因子的mRNA及蛋白的相对表达，而沉默Hoxa9基因可促进骨髓间充质干细胞及骨组织中胶原蛋白Ⅰ、骨钙素、骨桥蛋白及Runx2等转录因子的基因及蛋白的相对表达，可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。此外，在体内形态学及免疫组织化学染色结果发现，Hoxa9基因过表达不利于大鼠胫骨骨折伤口的愈合，而敲低Hoxa9基因后有利于大鼠胫骨骨折愈合。这表明抑制Hoxa9基因的表达可明显促进了体内骨折损伤的愈合及骨髓间充质干细胞的成骨分化，这部分结果与鲍冲等^[24]研究者的结论是一致的。

Hoxa9基因在控制发育模式中起关键作用，并以严格调控的时间和组织特异性方式表达。有研究显示，Hoxa9介导的转录信号促进人胶质母细胞瘤中的细胞增殖，侵袭，生存力和对替莫唑胺的抗性^[27]。KO等^[28]也发现Hoxa9对上皮性卵巢癌的恶化会产生不同程度的影响，部分原因是通过诱导钙沉积蛋白促进腹膜内扩散导致这种现象。在实验中，作者发现在不同诱导的成骨模型中随着时间的延长Hoxa9基因相对表达量在递减，表明Hoxa9基因的表达与骨髓间充质干细胞的成骨分化呈负向调控的作用。进一步研究结果表明敲低Hoxa9基因后可以促进骨髓间充质干细胞的增殖并促进成骨分化。这与以往研究中发现的Hoxa9基因与造血功能存在相关性的现象可能存在联系，但其具体机制仍需进一步探讨^[29-30]。

综上所述，实验通过诱导成骨分化模型后发现Hoxa9基因出现显著降低。结合体内和体外研究进一步证明沉默Hoxa9基因能够影响骨髓间充质干细胞的成骨分化从而促进骨折愈合，但其所调控的通路及具体机制仍需进一步探讨。实验为胫骨骨折愈合治疗提供了一种全新的治疗思路及靶向治疗依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

同源盒基因：是一类控制胚胎发育和调节细胞分化的高度保守基因。同源盒A9基因位于同源盒A簇的5’端，其异常高表达与包括白血病、骨折损伤等疾病相关。

骨髓间充质干细胞：间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。

有研究显示胫骨骨折发生率较高且对人们生活质量造成不同程度的影响，因此实验通过构建Hoxa9过表达细胞模型及大鼠胫骨骨折动物模型探讨Hoxa9在成骨分化和大鼠胫骨骨折愈合过程中的作用，为骨折损伤的治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#