不同剂量金雀异黄酮对骨关节炎模型大鼠关节疼痛、炎症的抑制作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2920

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

金雀异黄酮：又称染料木素，是一种多酚类化合物，来源于大豆和红三叶草等植物，分子结构与17β-雌二醇类似，因其对雌激素受体有高度亲和力而被认为是植物雌激素，具有抗氧化能力，可抑制酪氨酸蛋白激酶活性，具有诱发细胞凋亡、增加抗癌效果、抑制血管生成等作用。同时它也是类黄酮中的一种，因此常被称为大豆异黄酮，目前被认为是一种有潜力的癌症预防化合物，在预防癌症方面有显著作用。

Wistar大鼠：是大鼠中的一种，1907年由美国维斯塔尔(Wistar)研究所养育成，现已是世界各国实验室中常见的大鼠，也是中国使用最广泛、用量最大的一种大鼠，其主要的特点是：头宽耳长，尾长度小于身长；繁殖力强，产仔多，生长发育快；性情温顺；抗传染病能力强；自发性肿瘤发生率低。

背景：金雀异黄酮是一种大豆制品衍生物，具有预防骨质疏松和抑制癌症的作用，其对骨关节炎的作用目前尚无相关报道。

目的：分析不同剂量金雀异黄酮对骨关节炎的效果并探讨其机制。

方法：采用木瓜蛋白酶法建立雄性Wistar大鼠右膝骨关节炎模型，分5组干预：低、中、高剂量组分别灌胃给予4.5，9，18 mg/(kg·d)的金雀异黄酮，阳性对照组灌胃给予15 mg/(kg·d)的双氯芬酸钠，对照组灌胃给予纯净水，连续给药35 d。给药后第7，14，21天检测右膝膝关节直径；给药后第1，3，5周检测右膝关节液中炎性因子水平。分别于雄性Wistar大鼠皮肤表面涂纯净水、金雀异黄酮胶体和0.8%甲醛，建立皮肤刺激模型，观察皮肤出现红肿及皮疹情况。采用醋酸法建立雄性Wistar大鼠疼痛翻滚模型，醋酸注射3 min后分组干预，干预方式同骨关节模型，记录前20 min与后20 min大鼠肢体翻滚次数，判断止痛效果。实验方案经南方医科大学动物实验伦理委员会批准。

结果与结论：①相同时间点内，中、高剂量组与阳性对照组膝关节直径小于对照组(P < 0.05)，前3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；②相同时间点内，中、高剂量组与阳性对照组基质金属蛋白酶3、白细胞介素6、白细胞介素1β水平均低于对照组(P < 0.05)，前3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③金雀异黄酮凝胶涂于大鼠皮肤表面后皮肤无皮疹及红肿；④前20 min与后20 min内，9，18 mg/kg的金雀异黄酮可缓解大鼠疼痛，其止痛效果和双氯芬酸钠无明显差别；⑤结果表明，金雀异黄酮对皮肤无刺激性，在一定剂量范围内具有止痛、抗炎、消肿和抗骨关节炎的功效。

ORCID: 0000-0002-8891-7977(曾小云)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 软骨, 鼠, 骨关节炎, 因子, 实验, 动物

Abstract:

BACKGROUND: Genistein is a soy product derivative that can prevent osteoporosis and inhibit cancer. There is no relevant report on its role in osteoarthritis.

OBJECTIVE: To study the effects of different doses of genistein on osteoarthritis and to explore its mechanism.

METHODS: A model of right knee osteoarthritis was established in male Wistar rats by using papain method. The experiment was divided into five groups: low, medium and high dose groups were administered with 4.5, 9, and 18 mg/(kg•d) genistein, respectively; a positive control group was given 15 mg/(kg•d) diclofenac sodium by gavage; and a control group was given pure water. Administration in each group was kept for 35 continuous days. The knee joint diameter of the right knee was measured on the 7^th, 14^th, and 21^stday after administration. At the 1^st, 3^rd, and 5^thweek after administration, the levels of inflammatory factors in the right knee joint fluid were measured. Pure water, genistein colloid and 0.8% formaldehyde were separately applied to the skin surface of male Wistar rats to establish a skin irritation model. Redness and rash on the skin were then observed. The painful tumbling model of male Wistar rats was established by acetic acid method. The intervention method was the same as the knee osteoarthritis model. The number of limb tumbling in the rats within the first and the last 20 minutes was recorded to assess the analgesic effect. Ethic approval was obtained from the Animal Experiment Ethics Committee of Southern Medical University.

RESULTS AND CONCLUSION: At the same time point, the knee joint diameter of the middle and high dose groups and the positive control group was smaller than that of the control group (P < 0.05), and there was no significant difference between the first three groups (P > 0.05). At the same time point, the levels of matrix metalloproteinase-3, interleukin-6 and interleukin-1β were lower in the middle and high dose groups and the positive control group than in the control group (P < 0.05), and there was no significant difference between the first three groups (P > 0.05). Genistein gel did not result in induce rash and redness on the surface of the rat skin. In the first and the last 20 minutes, 9 and 18 mg/kg genistein could alleviate pain in rats, and its analgesic effect was similar to that of diclofenac sodium. All these findings indicate that genistein is not irritating to the skin and within a certain dose range, genistein can relieve pain and have anti-inflammatory, anti-swelling and anti-osteoarthritis effects.

Key words: bone, cartilage, rat, osteoarthritis, factor, experiment, anima

中图分类号:

曾小云, 张丽容. 不同剂量金雀异黄酮对骨关节炎模型大鼠关节疼痛、炎症的抑制作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(35): 5607-5612.

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图/表（结果） 10

2.2 金雀异黄酮抑制骨关节炎大鼠关节肿胀各组大鼠右膝关节直径见表1，图1。中、高剂量组与阳性对照组膝关节直径小于对照组(P < 0.05)，小剂量组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，中、高剂量组、阳性对照组3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 金雀异黄酮抑制骨关节炎白细胞介素1β水平各组大鼠右膝关节液白细胞介素1β水平测定结果见表2，图2。中、高剂量组与阳性对照组白细胞介素1β水平低于对照组(P < 0.05)，小剂量组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，中、高剂量组、阳性对照组3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 金雀异黄酮抑制骨关节炎白细胞介素6水平各组大鼠右膝关节液白细胞介素6水平测定结果见表3，图3。中、高剂量组与阳性对照组白细胞介素6水平低于对照组(P < 0.05)，小剂量组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，中、高剂量组、阳性对照组3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 金雀异黄酮抑制骨关节炎基质金属蛋白酶3水平各组大鼠右膝关节液基质金属蛋白酶3水平检测结果见表4，图4。中、高剂量组与阳性对照组基质金属蛋白酶3水平低于对照组(P < 0.05)，小剂量组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，中、高剂量组、阳性对照组3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.7 金雀异黄酮抑制骨关节炎大鼠疼痛各组大鼠疼痛情况见表5，图5。中、高剂量组与阳性对照组翻滚次数少于对照组(P < 0.05)，小剂量组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，中、高剂量组、阳性对照组3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

骨关节炎是老年病中的常见病，中国高龄老年人骨关节炎的患病率高达80%^[1]，其发病机制尚未被完全研究透彻，随着研究的深入，目前大部分学者认为骨关节炎是力学、物理和免疫等多种复合因素造成的，其中关节面软骨和关节面深部基质的损耗和合成平衡被打破是其发病的核心。多种因素会造成关节面软骨胶原的降解，如外伤、老年、负重、肥胖等，当合成速度跟不上降解速度时较易发生骨关节炎。研究表明白细胞介素1、白细胞介素6在骨关节炎中表达量明显增高，与骨关节炎的炎症程度呈正相关^[2-5]。

骨关节炎目前尚无确切有效的治疗方法，大多数研究认为部分传统中草药对骨关节炎有较好的治疗功效。有学者建立兔骨质疏松合并骨关节炎模型，用补肾活血汤干预并观察软骨细胞因子白细胞介素1、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1等炎症因子的mRNA表达，发现补肾活血汤具有减轻膝关节炎症、促进软骨细胞增殖的作用^[6]。有学者将艾灸作用于兔膝关节，发现其可减少关节炎症、促进软骨细胞增殖，起到缓解病情的作用^[7]。有研究指出，杜灵注射液能通过减轻关节液中炎症因子的水平减轻关节滑膜炎症和退变^[8]。

金雀异黄酮是一种多酚类化合物，来源于红三叶草等植物，具有抗癌、抑制血管生成等作用^[9-11]。有学者建立切除卵巢大鼠模型，通过骨密度、骨生物力学等证实金雀异黄酮有骨保护作用^[12]。李浩等^[13]通过体外细胞培养实验证实，不同浓度的金雀异黄酮可促进成骨细胞的增殖，抑制破骨细胞形成。研究已证实金雀异黄酮有抑制炎症的作用，李文学等^[14]通过内皮细胞炎症模型证实金雀异黄酮可明显抑制白细胞介素6等炎性因子的生成，而白细胞介素6和骨关节炎密切相关。金雀异黄酮是否有抑制关节炎的作用需要进一步研究。实验观察金雀异黄酮对大鼠骨关节炎的作用，为金雀异黄酮临床应用于抗骨关节炎打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年6至10月在南方医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料金雀异黄酮(上海迈瑞尔化学技术有限公司，编号：G0272)；双氯芬酸钠片(深圳致君制药有限公司)；pH试纸、L-半胱氨酸、木瓜蛋白酶(上海妍琦生物科技有限公司)；大鼠白细胞介素1β、白细胞介素6和基质金属蛋白酶3的 Elisa试剂盒(上海通蔚实业有限公司)。

实验动物：成年雄性Wistar大鼠65只，体质量250-300 g，由南方医科大学实验动物中心提供。在18-26 ℃、统一的光线和湿度环境下饲养大鼠，统一饮水及饮食量，标准化4 d后用于各项实验。

1.4 实验方法

1.4.1 建立骨关节炎模型取25只大鼠，采用木瓜蛋白酶法建立骨关节炎模型^[15-17]。先用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，观察大鼠不挣扎后剃除右侧关节表面毛，第1，4，7天在关节腔注入0.5 mL生理盐水及4%木瓜蛋白酶混合液，第10天后取1只大鼠解剖，发现关节软骨及滑膜呈骨关节炎的表现，Makin’s评分为8分，表明建模成功并开始实验。分5组干预：低、中、高剂量组分别灌胃给予4.5，9，18 mg/(kg·d)的金雀异黄酮，阳性对照组灌胃给予15 mg/(kg·d)的双氯芬酸钠，对照组灌胃给予2.5 mL纯净水，每组5只，连续给药35 d。

检测指标：给药后第7，14，21天测量大鼠右膝关节直径，判断大鼠关节肿胀情况。

炎性因子检测：喂药后第1，3，5周分别用Elisa试剂盒检测关节液中白细胞介素1β、白细胞介素6和基质金属蛋白酶3水平。

1.4.2 建立大鼠皮肤刺激模型取15只大鼠，消毒后剪除大鼠背部毛，除毛6 h后，随机分为3组，每组5只，分别在不同组大鼠背部涂上纯净水(对照组)、金雀异黄酮胶体及0.8%的甲醛溶液，2 d后观察皮肤表面颜色、皮疹和肿胀程度，判断金雀异黄酮的刺激性。

1.4.3 建立大鼠疼痛刺激模型取25只大鼠，腹腔注射入0.8%醋酸(10 mL/kg)建立急性疼痛模型(总共40 min)^[18]，醋酸注射3 min后分5组干预，低、中、高剂量组分别灌胃给予4.5，9，18 mg/(kg·d)的金雀异黄酮，阳性对照组灌胃给予15 mg/(kg·d)的双氯芬酸钠，对照组灌胃给予2.5 mL纯净水，每组5只。记录前20 min和后20 min内大鼠肢体扭转和翻滚次数，通过大鼠肢体动作判断是否有疼痛存在。

1.5 主要观察指标金雀异黄酮的对骨关节炎大鼠膝关节直径与关节内炎性因子的影响，以及其皮肤刺激性与镇痛作用。

1.6 统计学分析使用SPSS 17.0统计学软件分析各项实验数据，组间均数比较用方差分析，方差分析前先检测方差齐性，不同组间比较采用LSD法。数据均用x(_)±s表示。取P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

金雀异黄酮又称为染料木素，是大豆黄酮中的一种有效成分，具有植物雌激素的活性，具有降血脂、抗癌、雌激素和蛋白激酶等多种作用^[19-22]。任晓霞等^[9]通过体外肿瘤细胞培养实验证实，金雀异黄酮可抑制宫颈癌细胞增殖并增强其自噬，具有抗肿瘤作用。有研究发现金雀异黄酮可促进骨髓间充质干细胞的增殖，并能促进细胞的成骨分化^[23]。冯英等^[24]通过大鼠骨质疏松模型发现金雀异黄酮可明显提高大鼠骨密度，具有抗骨质疏松效果。有学者以金雀异黄酮干预新西兰兔软骨炎症模型，通过检测一氧化氮合成酶、调节因子等指标证实金雀异黄酮有抗炎和抑制软骨细胞增殖的作用^[25]。

骨关节炎以关节软骨退变、软骨下骨坏死，骨质不规则增生为特征，目前尚无有效的根治方法，保守治疗主要采用药物和非药物两种方法。非药物包括：理疗、中医熏蒸、针灸、推拿、按摩和功能锻炼等；药物包括：控制症状类，如洛索洛芬、双氯芬酸、酮洛芬、吡喃羧酸类等非类固醇抗炎药；局部治疗药，如糖皮质激素等；改善病情及保护软骨药，如葡糖胺聚糖和硫酸氨基葡萄糖等。如果保守治疗无效，病情需要时可选择手术治疗。

骨关节炎的临床治疗中疗效最确切、改善症状最明显的是非类固醇抗炎药。实验选用双氯芬酸钠作为实验的阳性对照物，这是一种常见的治疗关节炎和类风湿性关节炎的药物，通过作用于前列腺素合成酶而产生止痛作用。实验通过与阳性对照物双氯芬酸钠的比较，证实金雀异黄酮抗炎止痛的效果和双氯芬酸钠相比无明显差别。

非类固醇类消炎药吸收快、起效快、效果确切，其主要产生作用的原理是抑制环氧化酶，进一步抑制前列腺素的合成，从而发挥镇痛和消炎作用。环氧化酶是发挥止痛效果的靶类酶，有2种异构体，包括环氧化酶1和环氧化酶2，其中环氧化酶2有催化前列腺素合成的作用，而后者有致炎性的作用。而目前使用的部分类别非类固醇类消炎药同时抑制以上2种酶，因此有引起胃肠道炎性溃疡的不良反应。为减少不良反应，目前已研发并投入临床使用的部分止痛药是特定的环氧化酶2抑制剂，如美洛昔康、二氟尼柳和塞来昔布等，这些药品均可减少消化系统不良反应。美洛昔康是典型的环氧化酶2抑制剂，可用于治疗骨关节炎的轻微疼痛，由于其只抑制环氧化酶2而不抑制环氧化酶1，因此可减少消化系统溃疡的发生率，但恶心、反酸、甚至肾功受损的不良反应仍然存在。塞来昔布可选择性地抑制环氧化酶2，并且对环氧化酶2的作用效果比环氧化酶1高18倍，可用于缓解骨关节炎和成人类风湿性关节炎的疼痛症状。但是目前的研究证实，环氧化酶1和环氧化酶2在功能上是相互重叠和互为补充的，并不是特定的环氧化酶2抑制剂效果更好，需要结合患者病情和身体对药物的耐受情况综合决定，但是为减少消化系统和泌尿系统不良反应，原则上不允许同时使用2种非类固醇类消炎药。与骨关节炎相关的循证医学认为，目前骨关节炎的治疗已经从药物及手术转向提前预防为主的干预措施上，主要包括控制体质量、适当运动、加强宣传教育等^[26]。有研究证实由于关节结破坏、关节疼痛、关节稳定性差等因素^[27]，骨关节炎患者主观上不愿意运动，造成关节周围负重肌肉萎缩，进一步引起关节不稳，因此可以加强对患者的宣传教育，促使患者主动活动关节，提高关节稳定性和力度，改善关节功能，提高患者生活质量。

关节软骨受炎性递质影响最终形成骨关节炎的过程非常复杂，物理、多种炎性因子及蛋白降解酶均参与其中。目前有研究证实白细胞介素1和骨关节炎密切相关，并且可能是始发因子^[28-31]，白细胞介素1在关节液中含量很低，但是当关节发生炎症后其含量迅速增高。基质金属蛋白酶3也参与骨关节炎的形成，当关节炎发生后白细胞介素1诱导基质金属蛋白酶3合成，基质金属蛋白酶3可裂解关节软骨和软骨基质中的蛋白多糖，从而破坏关节软骨。

实验从大豆提取物入手探讨金雀异黄酮治疗骨关节炎的效果，通过动物实验论证了低、中和高剂量金雀异黄酮对关节炎的功效。金雀异黄酮有抗肿瘤、抑制动脉炎症、抗粥样硬化、抗骨质疏松、抗血管生成、抗增殖、免疫调节、镇痛等作用^[32-33]。有研究通过胶原诱导关节炎动物模型发现，金雀异黄酮有阻断滑膜血管增生、减少炎症的作用，认为金雀异黄酮是治疗类风湿性关节炎的潜在药物^[34]。有学者通过体内和体外研究证实，金雀异黄酮有治疗类风湿性关节炎的作用^[33]。

有研究证实6 mg/kg的金雀异黄酮有抗大鼠骨质疏松的作用，说明一定剂量的金雀异黄酮可经过代谢后作用于大鼠并产生相应的作用^[24]。实验探讨了4.5，9，18 mg/kg 3种不同剂量金雀异黄酮对大鼠骨关节炎的影响。实验发现金雀异黄酮对皮肤无刺激作用，不会引起皮肤红肿，有利于以后进一步研究其机制并开发用于外用药。通过疼痛翻滚模型发现，中、高剂量的金雀异黄酮经有缓解动物疼痛的作用，说明金雀异黄酮在一定剂量下有止痛作用。实验发现4.5 mg/kg的金雀异黄酮并不能明显改善关节炎模型中相关炎症因子的水平，其抗炎作用和剂量相关，低剂量金雀异黄酮并无止痛抗炎炎的作用；9 mg/kg以上的金雀异黄酮在动物骨关节模型中有较好的抗炎效果，调整剂量到18 mg/kg时其抗炎效果并不能和剂量呈正比，因此精确的金雀异黄酮起效剂量尚需进一步实验证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程