1.4.2  萎缩性骨不连模型的建立  造模前限制饮食饮水 8 h，称取得大鼠体质量，腹腔注射1.5 mL浓度为3%戊巴比妥钠麻醉。大鼠侧卧位，固定右下肢，从右胫骨弧度顶点沿胫骨干方向建立长约1 cm切口，逐层切开皮肤与筋膜，将胫骨周围肌肉钝性分离并牵拉，完全暴露胫骨中段。将已灭菌并组装好自制环形外固定架(图1A)套于右下肢，装入直径0.5 mm克氏针，进针点位于胫骨中上1/3部分，垂直于下肢纵轴进针，贯穿胫骨，并使克氏针夹于近端两枚环形圆片之间。相同操作将第2根克氏针进针点贴近第1根针钻入胫骨，并使2根克氏针在冠状面形成30°-45°夹角，拧紧近端两圆片相连接的螺丝。继续同法将远端两枚环形圆片用克氏针固定与胫骨下端，剪断突出克氏针，螺丝加压固定，见图1B。再次显露胫骨，使用微型电动摆锯截取进行截骨，生理盐水冲洗，形成长度为4 mm骨缺损区域，见图1C。其中实验组截骨段使用口腔科粘固粉填充器，在酒精灯外焰加热后行截骨端两端骨膜烧灼，宽度约1 mm。对照组不予烧灼骨膜。再次用生理盐水清洗手术区域。使用可吸收线缝合胫骨周围肌肉、筋膜，丝线缝合皮肤，消毒皮肤。造模后6 h予恢复饮食，造模后3 d内，每天肌肉注射青霉素钠8万单位，避免伤口感染。造模后大鼠自由活动，分笼饲养，见图1D。

1.4.3  影像学检查  选取造模后第1天、第6周、第12周行X射线检查，观察外固定装置是否稳定以及骨愈合情况，见图2A。造模后第12周行Micro CT扫描右侧胫骨标本，观察截骨端骨质变化情况。

2.1  实验动物数量分析及造模成功率  实验组与对照组分别有1只大鼠出现右下肢外固定架松脱情况，见图2B。经X射线鉴定，实验组造模成功率为93%(14/15)，对照组造模成功率为40%(6/15)。两组大鼠均未发现感染以及行为学异常。

2.2  X射线结果  实验组造模后14只大鼠第6周均可观察到右胫骨截骨线清晰，截骨区无明显骨痂生成，无骨折进一步愈合指征。造模后12周时可看到胫骨截骨区无明显骨性连接，断端骨痂稀疏，周围骨质萎缩硬化，见图3A，B。对照组中8只大鼠造模后6周可看到截骨线，胫骨截骨端周围大量骨痂不规则生成，无骨性连接，无骨折进一步愈合指征；造模后12周时可看到胫骨截骨端无明显骨性连接，骨折断端肥大，呈象足样改变，见图3C，D；对照组其余6只大鼠模型造模后12周X射线观察到目标区域无明显骨性连接，周围骨痂稀疏，骨折断端周围萎缩，呈萎缩性骨不连表现。

2.3  血管造影与Micro-CT结果  与对照组相比，实验组比对照组血管分布更稀疏，见图4A，B，且相应的血管体积分数也低于对照组(P < 0.05)，见图5。造模后第12周实验组胫骨Micro-CT可观察到骨缺损区域无骨性连接，骨折端周围光滑、萎缩，髓腔关闭，呈萎缩性骨不连特征，见图4D；对照组骨缺损区域无骨性连接，骨髓腔封闭不通，骨折端周围骨质大量增生、硬化明显，有大量骨痂生成，呈象足样改变，具有肥大性骨不连特征，见图4C。

2.3  血管造影与Micro-CT结果  与对照组相比，实验组比对照组血管分布更稀疏，见图4A，B，且相应的血管体积分数也低于对照组(P < 0.05)，见图5。造模后第12周实验组胫骨Micro-CT可观察到骨缺损区域无骨性连接，骨折端周围光滑、萎缩，髓腔关闭，呈萎缩性骨不连特征，见图4D；对照组骨缺损区域无骨性连接，骨髓腔封闭不通，骨折端周围骨质大量增生、硬化明显，有大量骨痂生成，呈象足样改变，具有肥大性骨不连特征，见图4C。

2.4  大体与组织学观察  实验组胫骨缺损区之间无骨连接，截骨端骨质萎缩，纤维结缔组织充填缺损区域，断端可明显活动，形成假关节，见图6A。对照组骨缺损区域可见明显分离，骨髓腔无连通，骨折端周围骨质膨出呈象足样改变，见图6B。光镜下2组胫骨均可见大量纤维软组织嵌入骨缺损区，见图6C，D。

骨折治疗的目的是在最短的时间内获得骨愈合，并尽可能恢复最佳的功能^[1]，同时治疗应尽可能减少并发症的发生。尽管外科技术已发生了飞跃，但是骨折手术后骨不连的发生率仍高达5%-10%^[2]。目前关于骨不连的诊断标准尚不一致，但在临床中一般认为发生骨折超过3个月未愈合即为延迟愈合，而6个月以上仍未完全愈合则被称为骨不连^[3]。骨不连在所有骨折类型中发生率不同，由于胫骨常累及高能量开放性骨折，并且血液供应较薄弱，导致骨不连发生率可达18.7%^[4]，是骨科医师亟待解决的难题。

骨不连可分为感染性与非感染性两大类^[5]。在非感染性骨不连中，依据影像学及病理学特征表现又可分为萎缩性与肥大性骨不连^[6-7]；其中萎缩性骨不连治疗最为困难^[8]，其影像学及病理学特征为骨折断端萎缩吸收，骨痂增生不明显以及断端之间软组织填充^[9]。

在骨不连的动物模型中，主要为兔桡骨与大鼠股骨模型^[10-11]，而胫骨模型较少，且大多为髓内针固定，缺少锁定装置，髓内针抗旋转能力较弱^[12]，使得模型缺乏稳定性，不能准确反映临床的实际情况^[8]。采用环形外固定架构建萎缩性骨不连模型的方法，目前国内外鲜有报道，作者拟采取胫骨中下段截骨4 mm，并烧灼断端骨膜，以环形外固定架固定构建新型萎缩性骨不连大鼠模型，其可能成为研究萎缩性骨不连的发病机制、病理特点以及治疗方法可靠的动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  动物实验于2018年12月至2019年6月在广州中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心进行。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SPF级雄性SD大鼠30只，鼠龄16周，体质量300-320 g，平均(309.50±6.00) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(粤)2013- 0001。所有大鼠行普通饲料喂养。

此次实验于2018-01-02经广州中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准，批号：TCMF1-2018002。实验操作及日常饲养与管理严格遵守国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规的规定，符合动物福利以及动物伦理原则的要求。

1.3.2  实验使用的主要试剂与仪器  伊红、苏木精购自索莱宝试剂公司；甲醛购自碧云天试剂公司；乙二胺四乙酸购自美国Sigma公司；含铅不透射线硅橡胶复合铬酸盐(Microfil MV-122)购自Flow Tech；戊巴比妥钠(F20150922)购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；注射用青霉素钠(160万单位/瓶，国药准字号：H13020655)购自石家庄市华北制药股份有限公司；直接数字平板X射线成像系统(DR7500)购自日本柯达；Micro-CT机购自瑞士Scanco Medical公司；BKJ-I微型电动摆锯、小型电钻购自江苏省张家港市保康医疗器械有限公司；口腔科粘固粉填充器购自河南文翔医疗器械公司(豫食药监械生产许20170072)。大鼠胫骨牵张装置为作者所在团队自有专利，专利号：ZL201520667-424.3。

1.4  方法

1.4.1  实验动物分组  采用随机数字表法，将30只雄性SD大鼠按照体质量进行编号排序，随机分为实验组与对照组，各15只。

1.4.2  萎缩性骨不连模型的建立  造模前限制饮食饮水 8 h，称取得大鼠体质量，腹腔注射1.5 mL浓度为3%戊巴比妥钠麻醉。大鼠侧卧位，固定右下肢，从右胫骨弧度顶点沿胫骨干方向建立长约1 cm切口，逐层切开皮肤与筋膜，将胫骨周围肌肉钝性分离并牵拉，完全暴露胫骨中段。将已灭菌并组装好自制环形外固定架(图1A)套于右下肢，装入直径0.5 mm克氏针，进针点位于胫骨中上1/3部分，垂直于下肢纵轴进针，贯穿胫骨，并使克氏针夹于近端两枚环形圆片之间。相同操作将第2根克氏针进针点贴近第1根针钻入胫骨，并使2根克氏针在冠状面形成30°-45°夹角，拧紧近端两圆片相连接的螺丝。继续同法将远端两枚环形圆片用克氏针固定与胫骨下端，剪断突出克氏针，螺丝加压固定，见图1B。再次显露胫骨，使用微型电动摆锯截取进行截骨，生理盐水冲洗，形成长度为4 mm骨缺损区域，见图1C。其中实验组截骨段使用口腔科粘固粉填充器，在酒精灯外焰加热后行截骨端两端骨膜烧灼，宽度约1 mm。对照组不予烧灼骨膜。再次用生理盐水清洗手术区域。使用可吸收线缝合胫骨周围肌肉、筋膜，丝线缝合皮肤，消毒皮肤。造模后6 h予恢复饮食，造模后3 d内，每天肌肉注射青霉素钠8万单位，避免伤口感染。造模后大鼠自由活动，分笼饲养，见图1D。

1.4.3  影像学检查  选取造模后第1天、第6周、第12周行X射线检查，观察外固定装置是否稳定以及骨愈合情况，见图2A。造模后第12周行Micro CT扫描右侧胫骨标本，观察截骨端骨质变化情况。

1.4.4  血管造影  造模后12周，使用3%戊巴比妥钠将大鼠麻醉，左心室灌注含肝素钠生理盐水，40 g/L多聚甲醛进行全身血管固定，再行含铅不透射线硅橡胶复合铬酸盐灌注。4 ℃下保存24 h后，取出右侧胫骨组织，固定、脱钙后于Micro-CT观测周围5 mm直径区域内血管的空间分布情况，使用CT-analysis软件计算目标区域血管体积分数。

1.4.5  病理观察   造模后12周，腹腔注射过量3%戊巴比妥钠处死大鼠，拆除固定装置，切开右下肢皮肤与软组织，分离出胫骨，剔除软组织，观察胫骨标本形态结构以及截骨区骨质连续性。胫骨缺损区周围组织予以体积分数10%甲醛固定，EDTA脱钙，去酸，石蜡包埋，行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察骨组织形态学改变情况。

1.5  主要观察指标  缺损区域成骨情况以及血管体积分数。

1.6  统计学分析  用SPSS 23.0软件分析处理数据，计量资料用x(_)±s表示。计量资料组间比较采用t 检验(方差不齐采用t'检验或秩和检验)，P < 0.05为差异有显著性意义。选用GraphPad Prism 5.0软件绘图。

    实验结果显示大鼠行截骨加烧灼骨膜后第12周时，在环形外固定架的固定作用下，骨折断端填充大量的纤维软组织，骨折两端骨髓腔关闭不通，符合萎缩性骨不连的病理组织学特征表现^[14]；影像学结果显示缺损区无骨桥连接，仅有少量的骨痂形成，骨髓腔封闭不通，断端骨质萎缩，符合萎缩性骨不连特征表现^[15]；血管造影提示胫骨缺损区域周围血管分布密度更小，血管体积分数减小，这也明显符合萎缩性性骨不连的特征^[16]。实验结束后大鼠体质量在400 g以上，可以排除营养不良性骨不连。综合分析结果表明，采用环形外固定架联合骨膜烧灼法可成功构建大鼠胫骨萎缩性骨不连模型。对照组中有8只影像学表现为马蹄样或象足样等肥大性骨不连特征，有学者认为肥大性骨不连的发生的原因主要是骨折固定不稳以及碎骨片运动导致^[15]，而外固定支架稳固性较高，且无松脱现象，考虑对照组的肥大性骨不连是由于截骨时残留的碎骨片加之血液供应未明显破坏而共同形成的；因此可以假设在骨折固定物稳定的情况下发生萎缩性骨不连，血液循环供应不足是其主要原因。对照组中有6只大鼠表现为萎缩性骨不连特征，由于对照组未处理骨膜，考虑术中对骨折缺损区域血供破坏较大，从而形成萎缩性骨不连，后续实验可以增加统计出血量等指标验证。实验研究表明，大鼠胫骨骨折愈合平均时间约为4周^[17]，结合人类胫骨8-12周愈合时间^[18]，实验中选择造模后6和12周行影像学检测符合临床骨不连诊断的时间要求。

骨不连的发生受多种因素影响^[19]，不仅取决于局部因素如骨折部位血循环状况、骨折分型、初始治疗，尤其是否稳定固定以及有无感染等，还与全身状况，例如老年、营养不良、服用激素或抗凝药和抗炎药等、超重和肥胖、吸烟以及饮酒等因素有关，而萎缩性骨不连的形成则更与骨折断端的血液循环供应遭到破坏紧密相关^[2]。李德强等^[20]使用血管造影对长骨萎缩性骨不连骨折周围组织局部血液循环情况进行研究，发现尽管骨折区域主要血管供应情况良好，但局部微循环实际上仍明显薄弱。还有学者提出萎缩性骨不连与骨折端间充质干细胞的刺激与再激活相关，成骨能力不足，从而导致骨不连的发生^[21]。

骨不连的治疗仍然充满挑战性，目前手术是骨不连最主要的治疗方法^[22]，自体骼骨移植是治疗骨不连的常用手段^[23-24]。最新研究表明^[25]，骨髓间充质干细胞及人脐带源间充质干细胞疗法，将脐带源性间充质干细胞，种植于大鼠的股骨骨不连区域，最终实现骨不连的愈合^[26-27]，可以为骨不连提供一种崭新的治疗方法。

目前关于建立动物骨不连或骨折不愈合模型的技术已趋近于成熟^[28-43]。大鼠胫骨多采用4 mm骨缺损制作骨折模型^[44]，但常用的克氏针行髓内固定，因缺少锁定装置，抗旋转能力较弱，易发生内固定失效，从而使得骨折愈合困难；而微型钢板固定则无调节功能，且断端周围有植入物，造成异物刺激。此次实验采用环形外固定架^[13]，具有较强的抗旋转能力与可调整局部应力的特点，还具备牵张和加压能力^[45]，可调节或维持骨不连形成所需要的缺损间距，同时方便后续骨不连的干预治疗，并且对动物日常活动的影响较小。因克氏针道与外界空气环境相通^[46]，因此造模后注意抗生素的应用，整个实验过程中需要密切观察大鼠活动情况以及伤口护理等，在此次实验中未出现感染情况。有2只大鼠造模后出现外固定架螺丝螺杆松脱现象，考虑由于实验初期造模方法不熟练，尚未形成标准流程，造模过程中克氏针钻孔较多，导致针道重叠，破坏了胫骨稳定性，经系统培训及制定标准流程后，其余大鼠外固定架未见松动。

      综上，实验成功构建大鼠胫骨萎缩性骨不连模型，且环形外固定架对大鼠的正常活动影响在可接受范围内，并且稳定性较强，有较高的可操作性、可靠性与重复性，为研究骨与血管的再生提供了可靠的动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

萎缩性骨不连：骨折修复过程完全停止，骨端萎缩吸收，骨痂无明显生长，髓腔封闭不通，断端之间无骨性连接，是骨折术后常见的并发症之一，其发生与骨折端周围血供破坏明显、固定不稳、感染、口服药物及全身因素相关。

动物模型：在医学研究中，在动物身上建立或形成类似人类疾病的模型，通过动物模型可直接或间接反映疾病的发生或发展过程，在了解疾病的基础上开创或改进疾病的治疗。

大多数四肢骨折的正常骨愈合时间为8周，然而约有10％的骨折会发展为骨不连，严重影响患者肢体功能的恢复。骨不连是一类严重的骨折并发症，也是骨科医生临床工作中的难点与挑战。骨不连的诊断至今仍没有统一的定义，目前常用的诊断标准来源于美国食品药品监督管理局。发生骨不连的病因也很多，主要包括局部血供差、骨膜损伤或破坏严重、骨缺损以及骨折固定失效。

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