利用慢病毒感染构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2149

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 84-89.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2149

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利用慢病毒感染构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系

冼国炎，陈蔚深，张紫机，叶勇裕，潘柏祺，郑霖力，盛璞义

中山大学附属第一医院关节外科，广东省广州市 510080

收稿日期:2020-02-10 修回日期:2020-02-18 接受日期:2020-04-03 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-11-19
通讯作者: 盛璞义，教授，主任医师，硕士生和博士生导师，中山大学附属第一医院关节外科，广东省广州市 510080
作者简介:冼国炎，男，1992年生，广东省化州市人，汉族，中山大学附属第一医院在读硕士，主要从事关节假体松动与感染发生机制方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81672149)；广东省自然科学基金自由项目(2017A030313593)；国家自然科学基金青年项目(81802179)

Construction of a stable Atg5 gene knockdown cell line in RAW 264.7 cells by lentivirus infection

Xian Guoyan, Chen Weishen, Zhang Ziji, Ye Yongyu, Pan Baiqi, Zheng Linli, Sheng Puyi

Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2020-02-10 Revised:2020-02-18 Accepted:2020-04-03 Online:2021-01-08 Published:2020-11-19
Contact: Sheng Puyi, Professor, Chief physician, Master’s and doctoral supervisor, Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Xian Guoyan, Master candidate, Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81672149; the Natural Science Foundation of Guangdong Province (Free Project), No. 2017A030313593; the National Natural Science Foundation of China (Youth Program), No. 81802179

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Atg5：自噬是真核生物细胞内降解大部分细胞浆内容物的一种生物学现象。自噬是一个受到严格调控的过程，其中关键的调控分子是自噬相关基因(Autophagy-Related Gene，Atg)，目前至少已经鉴定出41个Atg基因。Atg5启动了自噬体膜的形成和自噬体与溶酶体的融合，敲低或者敲除Atg5基因会导致细胞自噬的下调或抑制，是自噬基因编辑以及检测中最常见的靶基因之一。
慢病毒载体：作为介导RNA干扰基因表达的新型载体，具有一系列的优点。最常用的慢病毒载体是来源于人类免疫缺陷1型病毒(HIV-1)，具有广泛感染、有效感染分裂期和静止期细胞，在宿主染色质中插入大的遗传片段，并长期维持稳定转基因表达等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。

背景：巨噬细胞自噬在调节免疫系统和炎症反应中起到关键作用，而敲低Atg5基因可以特异性抑制细胞自噬的发生。由于传统siRNA转染方法存在瞬时性和不彻底性等问题，构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系对于研究自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制有重要的价值和意义。
目的：利用慢病毒感染的方法构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系，为研究巨噬细胞自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制提供底盘细胞。
方法：构建带有绿色荧光信号、Puro抗性基因和敲低Atg5基因的重组表达载体(HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro)转染293T细胞得到慢病毒质粒系统，采用获取的慢病毒感染RAW 264.7细胞，在倒置荧光显微镜下观察病毒感染细胞的绿色荧光信号，嘌呤霉素抗性筛选，流式细胞分选得到高纯度的感染细胞，采用RT-qPCR和Western blot验证Atg5基因的敲低效率。
结果与结论：DNA测序结果表明Atg5基因干扰序列均正确插入表达载体，HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro表达载体构建成功。慢病毒质粒感染RAW 264.7细胞系后，在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光，流式细胞分选仪可见绿色荧光蛋白阳性细胞群。RT-qPCR和Western blot检测结果表明筛选出的RAW 264.7细胞系中Atg5基因表达水平显著下降(P < 0.05)，表明稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系构建成功。

https://orcid.org/0000-0002-1982-2392(冼国炎) ；https://orcid.org/0000-0002-5898-2161(盛璞义)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 慢病毒, 基因, 基因敲低, 自噬, 蛋白, 细胞学, 细胞群, 巨噬细胞

Abstract: BACKGROUND: The autophagy of macrophage cells plays a key role in regulating the immune system and inflammatory response, while knockdown Atg5 gene can specifically inhibit the autophagy. There are some shortcomings of traditional siRNA transfection methods such as transience and incompleteness. It is of great value and significance to construct a stable Atg5 gene knockdown cell line in RAW 264.7 cells for studying the macrophage autophagy and immune inflammation-related diseases and their pathogenesis.
OBJECTIVE: To construct RAW 264.7 macrophage cell line stably knocking down the Atg5 gene by lentivirus infection, and to provide chassis cells for studying macrophage autophagy and immune inflammation-related diseases and their pathogenesis.
METHODS: Recombinant expression vector (HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro) with green fluorescence signal, Puro resistance gene, and knockdown Atg5 gene was constructed and transfected into 293T cells to obtain lentivirus plasmid system. The green fluorescence signal of the acquired lentivirus infected RAW 264.7 cells was observed under an inverted fluorescence microscope. Purinomycin resistance screening and flow cytometry were used to obtain high-purity infected cells. The RAW 264.7 cell line stably knocking down the Atg5 gene was identified by real-time quantitative polymerase chain reaction and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: DNA sequencing results showed that Atg5 gene interfering sequences were correctly inserted into the expression vector, and the HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro expression vector was successfully constructed. After infecting RAW 264.7 cell line with lentivirus plasmid, green fluorescence was observed under an inverted fluorescence microscope. Green fluorescent protein positive cell groups were observed by flow cytometry. The results of real-time quantitative polymerase chain reaction and western blot assay showed that the expression level of the Atg5 gene in RAW 264.7 cell line was significantly decreased (P < 0.05), indicating that the RAW 264.7 cell line with stable knockdown of Atg5 gene was successfully constructed.

Key words: lentivirus, gene, knockdown, autophagy, protein, cytology, cell group, macrophage

中图分类号:

冼国炎, 陈蔚深, 张紫机, 叶勇裕, 潘柏祺, 郑霖力, 盛璞义. 利用慢病毒感染构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 84-89.

Xian Guoyan, Chen Weishen, Zhang Ziji, Ye Yongyu, Pan Baiqi, Zheng Linli, Sheng Puyi. Construction of a stable Atg5 gene knockdown cell line in RAW 264.7 cells by lentivirus infection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 84-89.

图/表（结果） 6

2.1 HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro重组干扰载体的构建由于Atg5基因的几个转录本共有序列比较短，设计难度比较大，故在sigma官网上选取1条干扰效率大于90%的针对Atg5外显子的siRNA序列，设计了寡核苷酸链的序列并进行合成，见表1。将设计好引物进行程序退火形成双链片段，用限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ对表达载体酶切，目的片段与酶切后的质粒在T4连接酶作用下重组。连接产物经转化扩增、摇菌、质粒小提后，送往上海汉恒生物公司进行测序，结果显示序列均正确插入表达载体，见图1。

2.2 敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系的构建预实验设置不同感染复数值(0，10，20，30，50)的慢病毒感染RAW 264.7细胞，48 h后置于荧光显微镜下观察病毒感染情况，见图2。结果显示，对照组在感染复数为20、实验组在感染复数为30时病毒感染RAW26.7细胞的效果最佳，表明携带Atg5干扰序列的慢病毒能成功感染并转入RAW 264.7细胞。用上述预实验确定的感染复数值感染RAW 264.7细胞并进行嘌呤霉素抗性筛选至少4代细胞，扩大培养，采用流式分选仪分选绿色荧光蛋白阳性细胞。对照组和实验组嘌呤霉素抗性筛选后绿色荧光蛋白阳性细胞比例依然不高，分别为24.3%和29.9%，见图3，进一步将分选得到的高纯度阳性细胞(106个)继续培养，用于后续鉴定以及稳定基因敲低细胞系的冻存。

2.3 稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系的鉴定将构建成功的稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系进行培养，收集部分细胞提取总RNA，采用实时定量荧光PCR在mRNA表达水平上验证Atg5基因的敲低效率。与对照组相比较，实验组慢病毒感染 RAW 264.7细胞的Atg5基因表达明显降低，敲低效率达到74.41%，差异有显著性意义，见图4。

收集部分细胞裂解提取总蛋白，采用Western blot在蛋白表达水平上验证Atg5基因的敲低效率。与对照组相比较，实验组慢病毒感染 RAW 264.7细胞的Atg5蛋白表达也相应降低，敲低效率达到52.34%，差异有显著性意义，见图5。同时，将感染筛选后冻存的细胞进行复苏、培养和鉴定，也得到基本相同的结果。

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引言

自噬是真核生物细胞内的一种“自食”的现象，是细胞自发性降解受损的细胞器、大分子物质和长寿命蛋白的高度保守的细胞生物学现象，对于维持细胞以及机体的稳态至关重要[1]。巨噬细胞的自噬在细胞生理过程中发挥着重要作用，包括适应代谢应激、清除受损细胞器等，尤其在调节先天免疫系统和炎症反应中起到关键作用[2]。自噬过程受到很多基因的调控，这些调控基因被命名为自噬相关基因(Autophagy- Related Gene，Atg)，其中敲低Atg5或Atg7基因具有很强的自噬抑制特异性，可直接阻断自噬体的形成[3-4]，尤其是Atg5成为很多研究中抑制目标细胞发生自噬而选择敲低或者沉默的基因[5-6]。因此，构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系，对于研究巨噬细胞的自噬和免疫炎症相关疾病的作用机制具有重要的现实意义。
对于Atg5基因功能的研究，过去常常依赖于siRNA的干扰技术[5]，传统的siRNA转染细胞方法主要包括转染试剂法、磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等，但由于上述方法转染细胞后存在瞬时性和不彻底性会影响对基因功能的正确判断[7-9]。而且实际研究发现RAW 264.7细胞对普通的siRNA转染试剂并不十分敏感，效率极低。另外，上述方法采用的转染介质或载体一般无法加载荧光基因及耐药基因，以至于在实际操作中只能采用目标基因实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹等方法进行目标基因敲低效率的验证。如果siRNA瞬时转染出现效率低下，仍无法明确判断原因是转染试剂效率的低下，还是siRNA序列的干扰效果差，这给研究人员带来了重重的困难。
慢病毒(Lentivirus)作为介导RNA干扰基因表达的新型载体，具有一系列的优点。最常用的慢病毒载体是来源于人类免疫缺陷1型病毒(HIV-1)，具有广泛感染、有效感染分裂期和静止期细胞，在宿主染色质中插入大的遗传片段，并长期维持稳定的转基因表达等优点，因此成为导入外源基因的有力工具[8，10]。到目前为止，慢病毒携带基因转移到包括T细胞在内的免疫系统细胞、干细胞和许多其他治疗相关细胞类型的疗效已经得到确认[10]。随着技术的不断改进，慢病毒载体的安全性和便捷性也在进一步得到提高[10-11]。因此，慢病毒感染很好地兼顾了实验的时间、效率与成本，也保证了基因敲低的效率与稳定性。
该研究拟利用慢病毒敲低RAW 264.7巨噬细胞系中自噬相关基因Atg5，得到稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系，为研究巨噬细胞自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制提供基础和底盘细胞。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年12月在中山大学北校区科技楼李朝红教授实验室以及中山医学院科研平台完成。
1.3 材料 RAW 264.7(小鼠单核/巨噬细胞系)购买自美国ATCC®公司。DMEM高糖培养基、胎牛血清(Gibico)；青霉素和链霉素(Hyclone)；293T 细胞、pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro质粒、pSPAX2、pMD2G质粒、纯化试剂、LipofiterTM脂质体转染试剂(Hanbio Biotechnology)；大肠杆菌菌株DH 5α(Invitrogen)；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ(Thermo Fisher Scientific)；T4连接酶(Fermentas)；质粒DNA小大量抽提试剂盒(Beijing ComWin Biotech)；凝胶回收试剂盒(Shanghai Generay Biotech)；琼脂糖、琼脂粉(Sangon Biotech)；倒置荧光显微镜(Leica DMI 4000 B)；流式细胞分选仪(FACSARIA III, BD)；TRIzol试剂(Tian Gen)；反转录试剂盒、PCR试剂盒(Takara)；anti-LC3B、β-Actin(Cell Signaling Technology)；二抗(Jackson Immunoresearch)；ECL化学发光液(GE Healthcare)；化学发光成像仪(Image Quant LAS 4000 mini)；ShRNA序列合成及质粒测序由上海汉恒生物科技有限公司完成。
1.4 方法
1.4.1 构建带有绿色荧光信号、Puro抗性基因和Atg5基因的重组干扰载体HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro 根据shRNA (short hairpin RNA)设计的一般原则设计siRNA(small interfering
RNA)靶点，在sigma官网(https://www.sigmaaldrich.com)上选取1条干扰效率大于90%的针对Atg5外显子的siRNA序列，在干扰片段上游链(top strand)的5’端加上GAT CC碱基，在下游链(bottom strand)的5’端加上AAT TCA AAA AA碱基，引物退火形成带黏性末端的双链片段。采用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ对表达载体(pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro)进行酶切[12-13]，并将目的载体条带做胶回收，纯化，将Atg5基因的干扰片段连接入表达载体，连接物体系加入感受态大肠杆菌DH 5α进行转化扩增，涂于含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上，37 ℃，230 r/min培养过夜。转化后进行平板挑菌，37 ℃，250 r/min摇菌14 h，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序，用Chromas 2.4.3(Technelysium，Australia)软件进行分析比对，经测序验证的阳性克隆菌进行质粒提取纯化。
1.4.2 慢病毒包装将DMEM培养基常规培养的293T细胞铺板，待细胞密度生长至80%，将构建好的目的质粒、慢病毒包装质粒(pSPAX2、pMD2G)和转染试剂LipofiterTM按比例转染293T细胞，参考比例(直径100 mm培养皿)：目的质粒10 μg、pSPAX2 10 μg、pMD2G 5 μg、转染试剂LipofiterTM 75 μL。转染后16 h更换新的完全培养基，转染48，72 h后收集细胞上清至50 mL离心管，4 ℃，2 000×g离心10 min，去除细胞碎片，然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4 ℃，90 000×g离心120 min，最后将超离液分装于无菌病毒管进行滴度检测，结果为2.5×108 TU/mL，将病毒保存
-80 ℃冰箱备用。
1.4.3 慢病毒感染RAW 264.7细胞用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养RAW 264.7细胞，将细胞接种至24孔板，采用预实验以确定慢病毒感染RAW 264.7细胞的感染复数(MOI)值。该实验分为2组：感染对照组采用阴性对照病毒处理，感染敲低组采用含Atg5干扰序列的慢病毒处理，设定感染复数值分别为0，10，20，30，50，待细胞生长密度达60%左右，更换含相应感染复数值病毒液量的1/2体积培养液，感染4 h后补齐培养液，感染24 h后更换新的培养液，感染48 h后置于荧光显微镜下观察感染率，确定感染复数值。
1.4.4 筛选敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系确定感染复数值后，将RAW 264.7细胞接种至于6孔板。该实验分为3组：空白组不采用病毒感染处理，感染对照组采用阴性对照病毒处理，感染敲低组采用含Atg5干扰序列的慢病毒处理。慢病毒感染RAW 264.7细胞48 h，待细胞生长密度达60%，更换含慢病毒液的1/2体积培养液，按上述1.4.3中的方法培养48 h，每天更换含4 mg/L嘌呤霉素的DMEM培养基，4 d后用枪头吹散并收集有抗性的细胞，接种于75 cm2细胞培养瓶内继续培养。待细胞培养瓶中的细胞密度生长达90%以上时，用无菌细胞刮轻轻将细胞刮下来，1 000×g离心
10 min，弃上清，200 μL无菌PBS重悬细胞，200目滤网过滤后转移至流式细胞管，1 h内采用流式分选仪进行绿色荧光蛋白阳性细胞的分选，将分选得到的绿色荧光蛋白阳性细胞收集于细胞培养瓶中继续培养，以便后续RAW 264.7细胞的Atg5基因敲低效率验证以及稳定基因敲低细胞系的冻存。
1.4.5 鉴定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系将流式分选后得到的细胞继续在细胞培养瓶中进行培养，待细胞生长密度达90%左右，按1∶5比例进行细胞传代，同时将剩下大部分细胞进行冻存备用，部分接种至6孔板内。该实验分为3组：空白组为RAW 264.7细胞，感染对照组为阴性对照病毒处理并筛选后的细胞，感染敲低组为含Atg5干扰序列慢病毒处理并筛选后的细胞。采用RT-qPCR和Western blot进行Atg5基因敲低效率的验证。当6孔板内细胞生长密度达90%时，弃去上清，加入Trizol裂解提取总RNA，进行实时荧光定量PCR检测。引物如下：GAPDH Forward primer：5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG‐3′，GAPDH Reverse primer：5′-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA‐3′；Atg5 Forward primer：5′-AGC CAG GTG ATG ATT CAC GG‐3′，Atg5 Reverse primer：5′-GGC TGG GGG ACA ATG CTA A‐3′。利用2-ΔΔCt方法分析基因表达的相对水平。同时收集细胞加入裂解液提取蛋白，加入SDS缓冲液煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳，结束后转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭30 mim，anti-Atg5抗体4 ℃过夜摇床孵育，TBS洗膜，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL化学发光液进行显影。
1.5 主要观察指标 ①重组干扰载体DNA的测序结果，验证Atg5基因的干扰序列、插入位置等是否正确；②构建的慢病毒感染RAW26.7细胞的最佳感染复数值；③采用RT-qPCR和Western blot验证Atg5基因的敲低效率。
1.6 统计学分析统计数据以x±s表示，采用SPSS 20.0软件进行分析，两组间采用Student’s t test检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体降解途径，对细胞的生存、分化、发育和稳态至关重要[14]。自噬在许多疾病和生理过程中都起到重要的调控作用，包括感染、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病、衰老、炎症和免疫等[14-15]。自噬是一个受到严格调控的过程，其中关键的调控分子是自噬相关蛋白。迄今为止，至少已经鉴定出41个Atg基因[16]。在这41种蛋白质中，Atg5是自噬囊泡形成不可缺少的蛋白质，也是一种广泛研究的蛋白质，其基因、结构和功能等大部分特性正逐渐被研究并为人们所知。Atg5启动了自噬体膜的形成和自噬体与溶酶体的融合，在经典和非经典的自噬中都发挥重要作用。敲低或者敲除Atg5基因会导致细胞自噬的下调或完全抑制，这表明Atg5在细胞自噬中起着关键的调控作用[17]。因此，Atg5是自噬基因编辑以及检测中最常见的靶基因之一。
越来越多的证据表明，巨噬细胞是连接自噬和免疫的桥梁之一[18-19]。自噬及其机制在免疫中起着关键作用，包括清除病原体、调节炎症反应、抗原加工和呈递，以及免疫系统细胞的发育[20-22]。研究发现，巨噬细胞在发生自噬和识别吞噬外来病原体的过程中共享着大量基因，如Beclin1、Vps34和Atg5等[23]。2007年Green实验室首次报道在 Toll样受体途径激活过程中Beclin1、LC3、Atg5和Atg7可被巨噬细胞吞噬体募集，现已经被确定为一个非典型的自噬过程[24]。此外，大量的研究也证实了Atg5在免疫系统中发挥作用，调节固有免疫和适应性免疫反应，包括巨噬细胞极化、细胞因子分泌、抗原呈递和某些免疫相关细胞的活化[17，25-27]。因此，构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7巨噬细胞系对于研究自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制有很重要的价值和意义。
慢病毒等新载体出现之前，传统的siRNA干扰技术主要是通过转染试剂法、磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等，向细胞中引入特定的siRNA来抑制任何目标基因及蛋白质的表达，为探讨基因的功能和生物学机制作出了不可磨灭的贡献。随着技术的发展，上述传统方法采用的转染介质或载体转染细胞后存在瞬时性和不彻底性影响了对基因功能的正确判
断[9，28]。而且根据文献报道，有些细胞还出现了对siRNA转染的抗性，或者是转染效率低下[7-8]。基于人类免疫缺陷病毒1型的慢病毒载体(Lentivirus)具有将外源基因导入分裂和非分裂细胞的能力，且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，并能维持转移基因的长期稳定表达，从而达到很好的基因编辑效果[28]。该研究将Atg5基因的干扰片段插入慢病毒载体并进行了DNA测序，测序结果也证明了HBLV-m-Atg5-shRNA-GFP-Puro重组干扰载体构建完全正确。
目前关于慢病毒载体感染RAW 264.7细胞的感染效率和干扰效率的报道较少，RAW264.7细胞作为巨噬细胞类型的细胞株，本身具有很强的贴壁性和伪足产生性，以往研究表明它被siRNA转染的效率很低下[9]。该研究利用慢病毒载体感染RAW 264.7细胞之前，设立梯度浓度对比，摸出来最优的感染复数值，还采取了一系列的措施来提高感染的效率。该实验中慢病毒载体带有绿色荧光信号和嘌呤霉素抗性基因，这不仅可以非常直观地在荧光显微镜下观察选择各组慢病毒感染RAW 264.7细胞最合适的感染复数值，还能通过抗嘌呤霉素的特性进行耐药性筛选，甚至还能采用流式细胞分选最大程度提高细胞的感染效率，这些都极大地提高了细胞感染的阳性率，有力克服了普通的siRNA转染效率低下的缺点。此外，慢病毒感染细胞导入的基因一般能在细胞中长期稳定表达，节省了普通的siRNA反复进行转染的时间，也保证了实验结果的稳定性。因此，相比传统的RNA干扰技术，利用慢病毒载体感染RAW 264.7细胞的方法很好地兼顾了实验的时间与成本效益，也保证了基因敲低的效率与稳定性，是更适用于基因功能研究的技术。
在研究进行期间，作者也曾参考了以往文献建立目标基因敲低稳定株的方法[29-30]，大多数文献在筛选细胞稳定株的环节都采用了比较传统的无限稀释法或者克隆环挑取单克隆细胞等方法，但是作者发现在细胞转染率低下的情况下，采用上述方法挑取绿色荧光蛋白阳性细胞并不可行。流式分选术在较短时间内能够从大量细胞群体中根据细胞特有标记物准确挑选出目标细胞，当转染效率并不很高时，很多科研人员会选择细胞流式分选的方法来筛选阳性的稳转株[31-33]。作者的分选结果也表明，尽管进行嘌呤霉素抗性筛选4代以上，由于RAW 264.7细胞难转染的特性，绿色荧光蛋白阳性细胞的得出率依然不高，对照组和实验组绿色荧光蛋白阳性细胞比例分别为24.3%和29.9%。最后，将筛选后的细胞继续进行冻存、复苏、培养，采用RT-qPCR和Western blot验证RAW 264.7细胞系Atg5基因敲低的效率，结果显示Atg5基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，敲低效率分别达到74.41%和52.34%，表明建立的稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系是成功的。但是，由于Atg5基因的转录本共有序列可能存在其他不同的干扰序列，以至于Atg5基因的表达无法全部100%敲除。此外，Atg5基因在巨噬细胞自噬和免疫炎症相关疾病中的作用还需要进一步研究，该研究只是提供一个有效的研究基础和底盘细胞。
综上所述，慢病毒载体作为一种新型的基因编辑技术，是研究基因功能的强有力的工具，作者利用慢病毒载体成功敲低了RAW 264.7 巨噬细胞系中的Atg5基因，构建了稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系，为进一步研究巨噬细胞自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制奠定了基础，也为研究其他基因的功能提供一个方法学上的参考。
结论：该研究采用慢病毒质粒体系感染的方法成功敲低了Atg5基因在RAW 264.7巨噬细胞系中的表达，为研究Atg5基因在巨噬细胞自噬和免疫炎症相关疾病及其发生机制提供基础和底盘细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

利用慢病毒感染构建稳定敲低Atg5基因的RAW 264.7细胞系

Construction of a stable Atg5 gene knockdown cell line in RAW 264.7 cells by lentivirus infection

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