钛离子对T淋巴细胞体外增殖及活化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (52): 7781-7787.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.004

• 组织工程口腔材料 tissue-engineered oral materials • 上一篇下一篇

钛离子对T淋巴细胞体外增殖及活化的影响

陈富军¹，陈东晖²，杨倩¹，李昌¹，唐礼¹

广西医科大学附属口腔医院，¹种植科，²牙周黏膜科，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2016-05-20 出版日期:2016-12-16 发布日期:2016-12-16
通讯作者: 唐礼，副主任医师，副教授，硕士生导师，广西医科大学附属口腔医院种植科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:陈富军，男，湖南省永州市人，汉族，广西医科大学附属口腔医院在读硕士，主要从事口腔种植修复学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81160136，81460108)

Effects of titanium ions on the proliferation and activation of T lymphocytes in vitro

Chen Fu-jun¹, Chen Dong-hui², Yang Qian¹, Li Chang¹, Tang Li¹

¹Department of Implantology, ²Department of Periodontics and Oral Medicine, Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2016-05-20 Online:2016-12-16 Published:2016-12-16
Contact: Tang Li, Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Implantology, Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Chen Fu-jun, Studying for master’s degree, Department of Implantology, Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81160136, 81460108

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
钛离子：牙科钛种植体能与周围骨组织形成紧密的骨结合，现已被广泛应用于牙列缺损或牙列缺失的修复。虽然钛种植体表面覆盖了稳定的氧化钛层，能够有效减少外界刺激的影响，但其所处的是一个非常复杂的电解质环境，受到应力腐蚀、电偶腐蚀及化学腐蚀的作用，种植体表面可释放钛离子(4价)到周围组织中。钛和钛合金具有良好的生物相容性，其释放到体内的钛离子可作为一种半抗原物质，引发机体免疫反应。
T淋巴细胞活化：初始T淋巴细胞受到内部或外界因素刺激后，经过增殖、分化形成效应T淋巴细胞并释放免疫活性物质，骨免疫学认为，活化后的T淋巴细胞通过分泌骨改建相关因子来促进破骨细胞的生成和分化，从而加快骨吸收的发生和发展。

背景：已有研究证实，钛离子可以刺激T淋巴细胞分泌骨改建相关因子，然而尚无文献报道钛离子对T淋巴细胞早期活化、中期活化及细胞周期的作用。
目的：观察钛离子对T淋巴细胞体外增殖和活化的影响。
方法：①细胞增殖与周期实验：取对数生长期Jurkat E6-1 T淋巴细胞，分组培养，对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组分别加入含0，25，50，100 μmol/L钛离子的培养基培养，24 h后，检测细胞相对增殖率与细胞周期；②细胞活化实验：先将Jurkat E6-1 T淋巴细胞分为两大组，一组预先进行植物血凝素刺激，另一组不进行植物血凝素刺激，两组再分别分为对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组4个亚组，24 h后，检测细胞早期活化抗原CD69和中期活化抗原CD25的表达。
结果与结论：①细胞增殖：钛离子呈浓度依赖性促进T淋巴细胞的增殖(P < 0.05)；②细胞周期：与对照组比较，低浓度组、中浓度组、高浓度组G₀/G₁期细胞比例降低(P < 0.05)，S期、G₂/M期细胞比例明显升高(P < 0.05)；高浓度组G₀/G₁期细胞比例低于低、中浓度组(P < 0.05)，G₂/M期细胞比例高于低、中浓度组(P < 0.05)；③细胞活化实验：植物血凝素刺激预先刺激下，高浓度组CD69表达高于对照组、低浓度组、中浓度组(P < 0.05)，4组间CD25表达比较差异无显著性意义；无植物血凝素刺激预先刺激下，钛离子呈浓度依赖性促进CD69的表达(P < 0.05)，各组均无CD25表达；④结果表明：钛离子能促进T淋巴细胞体外增殖及早期活化，同时能诱导T淋巴细胞进入S期、G₂/M期。

ORCID: 0000-0003-2513-9183(唐礼)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 种植体无菌性松动, T淋巴细胞, 骨免疫, 钛离子, 骨吸收, 增殖, 细胞周期, CD69, CD25, 破骨细胞, 种植体周围炎, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Titanium ions have been proved to stimulate the secretion of bone remodeling-related factors from T lymphocytes; however, the effects of titanium ions on the early activation, intermediate activation, and cell cycle of T lymphocytes remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of titanium ions on the proliferation and activation of T lymphocytes in vitro.
METHODS: Cell proliferation and cycle test: Jurkat E6-1 T lymphocytes in logarithmic phase were collected and cultured in the medium containing 0 (control), 25 (low concentration), 50 (middle concentration), and 100 μmol/L (high concentration) titanium ions for 24 hours to detect the cell relative proliferation rate and cell cycle. Cell activation trial: Jurkat E6-1 T lymphocytes were divided into two groups that were subdivided into four groups containing 0, 25, 50, and 100 μmol/L titanium ions, respectively with or without phytohemagglutinin (PHA) pre-stimulation. The expressions of CD69 and CD25 were measured after cultured for 24 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: Titanium ions enhanced T lymphocytes proliferation in a concentration-dependent manner (P < 0.05). Compared with the control group, the percentages of G₀/G₁ phase decreased and the proportions of cells in S and G2/M phase increased significantly in the low, middle and high concentration groups (P < 0.05). The proportion of G₀/G₁-phase cells in the high concentration group was less and the proportion of G₂/M phase cells was higher than those in the middle and low concentration groups (P < 0.05). With PHA pre-stimulation, the expression of CD69 in the high concentration group was higher than that in the middle and low concentration groups (P < 0.05); whereas the difference of CD25 expression was not significant among four subgroups. Titanium ions promoted the expression of CD69 in a concentration-dependent manner (P < 0.05), but there was no CD25 expression in each subgroup without PHA pre-stimulation. To conclude, titanium ions can significantly promote T lymphocyte proliferation and early activation in vitro, and moreover, induce S and G₂/M phase arrest in T lymphocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Titanium, T-Lymphocytes, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈富军，陈东晖，杨倩，李昌，唐礼. 钛离子对T淋巴细胞体外增殖及活化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(52): 7781-7787.

Chen Fu-jun, Chen Dong-hui, Yang Qian, Li Chang, Tang Li.

Effects of titanium ions on the proliferation and activation of T lymphocytes in vitro

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(52): 7781-7787.

图/表（结果） 4

2.1 钛离子对T淋巴细胞增殖的影响加入钛离子前各浓度组与对照组T淋巴细胞数量和形态基本一致，细胞单个均匀悬浮于培养基中。终浓度为25，50， 100 μmol/L钛离子作用于T淋巴细胞24 h后，倒置相差显微镜下可见：各浓度组细胞数量较对照组明显增多，细胞明显抱团生长形成集落，见图1。CCK-8法显示，低、中、高浓度组吸光度值分别为0.277±0.003、0.313±0.005、0.354±0.003，所对应的细胞相对增殖率分别为(15.90±1.74) %，(30.96±2.64) %，(48.11± 1.74) %，低、中、高浓度组吸光度值及细胞相对增殖率与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，不同浓度组之间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。说明钛离子可促进T淋巴细胞增殖，并呈浓度依赖性。

2.2 钛离子对T淋巴细胞周期的影响使用PI染色结合流式细胞术分析钛离子对T淋巴细胞周期进程的结果显示，对照组细胞大多数处于G₀/G₁期；与对照组比较，低、中、高浓度组G₀/G₁期细胞比例显著减少(P < 0.05)，S期、G₂/M期细胞比例显著增加(P < 0.05)；高浓度组G₀/G₁期细胞比例低于中、低浓度组(P < 0.05)，中浓度组G₀/G₁期细胞比例低于低浓度组(P < 0.05)；各浓度组S期细胞比例比较差异无显著性意义(P > 0.05)；高浓度组G₂/M期细胞比例高于中、低浓度组(P < 0.05)，中浓度组G₂/M期期细胞比例高于低浓度组(P < 0.05)，见图2。说明钛离子可促进T淋巴细胞由G₀/G₁期向S期、G₂/M期转换。

2.3 钛离子对T淋巴细胞表达早期活化抗原CD69和中期活化抗原CD25的影响

植物血凝素(+)组细胞中：高浓度组CD6表达率为(72.3±2.80)%，高于低、中浓度组及对照组(P < 0.05)；低、中浓度组CD6表达率高于对照组(P < 0.05)，低、中浓度组间CD6表达率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；各浓度组CD25表达与对照组比较差异无显著性意义，见表2。

植物血凝素(-)组细胞中：高浓度组CD69表达率为(10.5±1.33)%，高于低、中浓度组及对照组(P < 0.05)，且具有浓度依赖性，各浓度组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；各浓度组及对照组均不表达CD25，见表2。

同一浓度钛离子作用下，植物血凝素(+)组细胞的CD69表达率显著高于植物血凝素(-)组细胞表达的量(P < 0.05)。说明钛离子可上调生理状态和炎症状态下T淋巴细胞早期活化抗原CD69的表达，但对中期活化抗原CD25的表达无明显影响。

参考文献

[1]Branemark PI.Osseointegration and its experimental background.J Prosthet Dent.1983;50(3):399-410.

[2]Astrand P,Nord PG,Branemark PI.Titanium implants and onlay bone graft to the atrophic edentulous maxilla: a 3-year longitudinal study.Int J Oral Maxillofac Surg. 1996;25(1):25-29.

[3]王方辉,张姗姗,舒静媛,等.纯钛种植体表面改性对骨结合的影响[J].中国组织工程研究, 2014,18(52): 8491-8497.

[4]Rodrigues DC,Valderrama P,Wilson TG,et al.Titanium Corrosion Mechanisms in the Oral Environment: A Retrieval Study.Materials.2013;6(11):5258-5274.

[5]Reclaru L,Meyer JM.Study of corrosion between a titanium implant and dental alloys.J Dent. 1994;22(3): 159-168.

[6]黄伟城,吴泽键,陈伟生.钛种植体基台和不同合金的体外耐腐蚀性能[J].中国组织工程研究, 2015,19(30):4784- 4789.

[7]Martin SF.Tlymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease.Int Arch Allergy Immunol.2004;134(3):186-198.

[8]Goutam M,Giriyapura C,Mishra SK,et al.Titanium allergy: a literature review. Indian J Dermatol. 2014; 59(6):630.

[9]Siddiqi A,Payne AG,De Silva RK,et al.Titanium allergy: could it affect dental implant integration?Clin Oral Implants Res.2011;22(7):673-680.

[10]Wooley PH,Schwarz EM.Aseptic loosening.Gene Therapy.2004;11(4):402-407.

[11]Wachi T,Shuto T,Shinohara Y,et al.Release of titanium ions from an implant surface and their effect on cytokine production related to alveolar bone resorption. Toxicology.2015;327:1-9.

[12]Schliephake H,Reiss G,Urban R,et al.Metal release from titanium fixtures during placement in the mandible: an experimental study.Int J Oral Maxillofac Implants. 1993;8(5):502-511.

[13]Lorenzo J,Horowitz M,Choi Y.Osteoimmunology: interactions of the bone and immune system.Endocr Rev.2008;29(4):403-440.

[14]Takayanagi H.Inflammatory bone destruction and osteoimmunology.J Periodontal Res. 2005;40(4): 287-293.

[15]Caetano-Lopes J,Canhao H,Fonseca JE. Osteoimmunology--the hidden immune regulation of bone.Autoimmun Rev.2009;8(3):250-255.

[16]Arron JR, Choi Y.Bone versus immune system. Nature. 2000;408:535-536.

[17]Takayanagi H.Osteoimmunology: shared mechanisms and crosstalk between the immune and bone systems. Nat Rev Immunol.2007;7(4):292-304.

[18]王林红,樊立洁,谷志远.钛离子诱导骨吸收的现象及机制[J].国际口腔医学杂志,2009,36(4):441-443,447.

[19]赵文杰,戴闽,张斌,等.钛金属离子介导骨溶解机制中的炎症反应-STAT信号通路[J].中国组织工程研究, 2016, 20(4): 492-496.

[20]Mine Y,Makihira S, ikawa H,et al.Impact of titanium ions on osteoblast-, osteoclast- and gingival epithelial-like cells.J Prosthodont Res.2010;54(1):1-6.

[21]庞振华,陈东晖,李秋莹,等.钛离子对 Jurkat T 细胞增殖及分泌骨改建相关因子的影响[J].广东医学, 2015, 36(22):3442-3445.

[22]Funato A,Yamada M,Ogawa T.Success rate, healing time, and implant stability of photofunctionalized dental implants.Int J Oral Maxillofac Implants. 2013;28(5): 1261-1271.

[23]Ettl T,Gerlach T,Schusselbauer T,et al.Bone resorption and complications in alveolar distraction osteogenesis.Clin Oral Investig.2010;14(5):481-489.

[24]Messer RL,Tackas G,Mickalonis J,et al.Corrosion of machined titanium dental implants under inflammatory conditions.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2009; 88(2):474-481.

[25]陈灼庚,唐礼.种植体钛离子释放对骨及骨周免疫的影响[J].广东牙病防治,2015,23(1):51-54.

[26]Chan E,Cadosch D,Gautschi OP,et al.Influence of metal ions on human lymphocytes and the generation of titanium-specific T-lymphocytes.J Appl Biomater Biomech.2011;9(2):137-143.

[27]Suska F,Esposito M,Gretzer C,et al.IL-1alpha, IL-1beta and TNF-alpha secretion during in vivo/ex vivo cellular interactions with titanium and copper. Biomaterials. 2003;24(3):461-468.

[28]Cadosch D,Sutanto M,Chan E,et al.Titanium uptake, induction of RANK-L expression, and enhanced proliferation of human T-lymphocytes.J Orthop Res. 2010;28(3):341-347.

[29]Abraham RT,Weiss A.Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm.Nat Rev Immunol. 2004;4(4):301-308.

[30]Fujii T,Yamada S,Watanabe Y,et al.Induction of choline acetyltransferase mRNA in human mononuclear leukocytes stimulated by phytohemagglutinin, a T-cell activator. J Neuroimmunol.1998;82(1):101-107.

[31]Fu Y,Zhang Y,Chang X,et al.Systemic immune effects of titanium dioxide nanoparticles after repeated intratracheal instillation in rat.Int J Mol Sci.2014;15(4): 6961-6973.

[32]Alenzi FQ.Links between apoptosis, proliferation and the cell cycle. Br J Biomed Sci.2004;61(2):99-102.

[33]Berridge M.Cell Cycle and Proliferation.Cell Signalling Biology.2014;2014(1):1-45.

[34]Sancho D,Gomez M,Sanchez-Madrid F.CD69 is an immunoregulatory molecule induced following activation. Trends Immunol.2005;26(3):136-140.

[35]Lindsey WB,Lowdell MW,Marti GE,et al.CD69 expression as an index of T-cell function: assay standardization, validation and use in monitoring immune recovery. Cytotherapy.2007;9(2):123-132.

[36]Sang X,Fei M,Sheng L,et al.Immunomodulatory effects in the spleen-injured mice following exposure to titanium dioxide nanoparticles.J Biomed Mater Res A.2014;102(10):3562-3572.

[37]Thornton AM,Shevach EM.CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med.1998;188(2):287-296.

[38]Gonzalez-Garcia A,Merida I,Martinez AC,et al. Intermediate affinity interleukin-2 receptor mediates survival via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. J Biol Chem.1997;272(15):10220-10226.

[39]Cachinho SC,Pu F,Hunt JA.Cytokine secretion from human peripheral blood mononuclear cells cultured in vitro with metal particles.J Biomed Mater Res A.2013; 101(4):1201-1209.

[40]Li TF,Santavirta S,Waris V,et al.No lymphokines in T-cells around loosened hip prostheses.Acta Orthop Scand.2001;72(3):241-247.

引言

牙科钛种植体能与周围骨组织形成紧密的骨结合，现已被广泛应用于牙列缺损或牙列缺失的修复^[1-3]。虽然钛种植体表面覆盖了稳定的氧化钛层，能够有效减少外界刺激的影响，但其所处的是一个非常复杂的电解质环境，受到应力腐蚀、电偶腐蚀及化学腐蚀的作用，种植体表面可释放钛离子(4价)到周围组织中^[4-6]。钛和钛合金具有良好的生物相容性，其释放到体内的钛离子可作为一种半抗原物质，引发机体免疫反应^[7-9]。

种植体无菌性松动指的是种植体-骨界面的骨质被吸收破坏而导致种植体的松动脱落^[10]。已有临床研究报道指出，在种植体无菌性松动的患者体内存在局部钛离子的聚集，并伴随种植体周围骨吸收^[11-12]。虽然骨效应细胞功能的改变可直接影响骨吸收的发生和发展，但近年来骨免疫学的迅速兴起，T淋巴细胞在骨代谢中的作用越来越受到学者们的注意^[13-15]。骨免疫学认为，人体骨改建受到局部免疫微环境的影响，骨骼系统与免疫系统两者间的相互作用参与骨改建的动态平衡过程，活化后的T淋巴细胞通过分泌骨改建相关因子促进破骨细胞的生成和分化，加快骨吸收的进程^[16-17]。

目前，关于种植体无菌性松动的生物学机制尚不明确，其具体的致病机制的研究主要是钛离子与破骨细胞、成骨细胞之间的相互作用，极少有研究关注钛离子在骨免疫调节中的作用^[18-20]。已有研究证实，钛离子可以刺激T淋巴细胞分泌骨改建相关因子^[21]。然而尚无文献报道钛离子对T淋巴细胞早期活化、中期活化及细胞周期的作用。因此实验通过探讨钛离子对T淋巴细胞体外增殖、细胞周期、早期活化抗原CD69及中期活化抗原CD25的影响，从骨免疫学角度初步探讨种植体无菌性松动发生的机制，为防治钛离子导致的种植体周围骨吸收提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，分组对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年7月至2016年5月在广西医科大学附属口腔医院口腔颌面修复与重建研究实验室、颌面外科疾病诊治研究实验室中完成。

1.3 材料实验细胞 Jurkat E6-1 T淋巴细胞系由中国医学科学院基础医学研究所协和细胞资源中心提供；PMI-1640培养基(加拿大维森特生物技术有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；四氯化钛(TiCl₄)标准浓缩溶液、植物血凝素(Sigma公司)；鼠抗人CD69单克隆抗体、鼠抗人CD25单克隆抗体(eBioscience公司)；细胞周期试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；全自动酶标检测仪(iMark)；倒置相差荧光显微镜(Olympus)；Infiux流式细胞仪(Becton Dickinson)；高速冷冻离心机(Thermo Forma)；超净工作台(上海智诚仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 T淋巴细胞培养将Jurkat E6-1 T淋巴细胞系复苏后，加入到含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640 完全培养基中，于37 ℃、体积分数5%的CO₂饱和湿度培养箱内孵育，每二三天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.4.2 细胞增殖实验用RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1×10⁵ L^-1，接种于96孔细胞培养板，每孔90 μL，分别加入不同浓度的四氯化钛溶液(钛离子的终浓度分别为0，25，50，100 μmol/L)，每孔10 μL，形成对照组及低、中、高浓度组，同时设立空白组(只加RPMI1640培养基)，每组设3复孔，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h，倒置显微镜下观察细胞生长，之后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育3 h后，用BIO-RAD450酶标仪于450 nm处测定各孔吸光度值(A值)，计算细胞相对增殖率。各浓度组细胞增殖率=(实验孔A值-对照孔A值)/对照孔A值×100%。

1.4.3 细胞周期实验用RPMI-1640培养基将细胞浓度调至1×10⁶ L^-1，接种于6孔板，每孔900 μL，分别加入不同浓度的四氯化钛溶液(钛离子的终浓度分别为0，25，50，100 μmol/L)，每孔100 μL，形成对照组及低、中、高浓度组，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后，离心收集细胞，PBS洗涤细胞1 次，用预冷的体积分数75%乙醇固定，置于4 ℃冰箱过夜，PBS洗去固定液，加入20 μL RNaseA，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI充分混匀，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞术分析细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.4.4 细胞活化实验根据T淋巴细胞是否经植物血凝素预先干预分为植物血凝素(+)和植物血凝素(-)两个大组：①植物血凝素(+)组：T淋巴细胞以5 mg/L植物血凝素预刺激；②植物血凝素(-)组：按T淋巴细胞培养方法进行常规培养。将植物血凝素(+)及植物血凝素(-)组细胞浓度调至1×10⁹ L^-1，并接种于6孔板，每孔900 μL，两大组分别加入不同浓度的四氯化钛溶液(钛离子的终浓度分别为0，25，50，100 μmol/L)，每孔100 μL，形成对照组及低、中、高浓度组。24 h后离心收集细胞，PBS洗涤2次后，将细胞悬液浓缩至100 μL，加入CD69-PE单克隆抗体5 μL或 CD25-PE单克隆抗体5 μL，室温下避光放置30 min，用冷PBS离心洗涤1次，重悬于500 μL PBS中，立即上机检测。实验重复3次。

1.5 主要观察指标 ①钛离子作用下T淋巴细胞的生长情况；②钛离子作用下T淋巴细胞增殖的变化；③钛离子作用下T淋巴细胞周期的分布；④钛离子作用下T淋巴细胞早期活化抗原CD69和中期活化抗原CD25的表达水平。

1.6 统计学分析数据结果以x(_)±s表示，利用SPSS 17.0软件进行统计学分析。3组或3组以上计量资料比较采用One-way ANOVA 分析，组间两两比较采用LSD法。植物血凝素(-)组与植物血凝素(+)组比较采用成组设计t 检验。检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

种植体与牙槽骨之间形成良好的骨结合是决定口腔种植成功的关键。随着种植体设计的完善及种植技术的成熟，牙种植的成功率已获得了极大提高，然而如何减少或避免种植体周围骨吸收一直是口腔种植学领域所面临的挑战^[22-23]。钛和钛合金对人体并非绝对的安全，处于炎症状态下的钛氧化膜在口腔唾液环境中并不能起到充分的保护作用^[24]。由于骨免疫学的兴起，关于钛离子与T淋巴细胞在骨代谢方面的相关效应研究越来越受到学者们的重视^[25]。Chan 等^[26]发现钛离子(4价)可被T淋巴细胞吞噬，进入细胞后与含磷结构细胞器亲和，如细胞核中的DNA，细胞浆中的核糖体及细胞膜的磷脂层，并形成具有免疫原性、能引起免疫应答的钛蛋白复合物。既往的研究表明钛离子可以促进T淋巴细胞分泌骨改建相关因子白细胞介素1α、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α及核因子κB受体活化因子配体^[^27-28^]。迄今为止，口腔临床治疗中对于种植体无菌性松动还没有显著成效的治疗方案。因此，实验旨在通过探讨钛离子对T淋巴细胞体外增殖和活化的影响，为从骨免疫层面防治种植体无菌性松动提供一个新视角。

Jurkat E6-1 T淋巴细胞系体外生长快速且可无限增殖，在细胞表型、生物学行为及基因调控与正常T淋巴细胞非常相似，常用作体外研究T淋巴细胞信号通路方面的模型^[²⁹^]。植物血凝素是一种有丝分裂原，可激活T淋巴细胞并使之增殖。未受植物血凝素刺激前，T淋巴细胞处于生理状态，经植物血凝素预刺激后，T淋巴细胞转为炎症状态^[³⁰^]。实验中是否经植物血凝素预先刺激，分别模拟了处于炎症状态及生理状态下的T淋巴细胞。

实验选择低、中、高浓度的钛离子(终浓度为25，50，100 μmol/L)作用T淋巴细胞24 h后，CCK-8实验结果表明钛离子浓度在100 μmol/L以内可有效促进T淋巴细胞增殖，且呈浓度依赖性，这与Cadosch等^[²⁸^]的研究结论一致。庞振华等^[21]的MTT实验也表明，钛离子浓度小于100 μmol/L时，在18，24，36 h时间点均可促进T淋巴细胞的增殖，24 h 能使之产生最大的增殖效应。Fu等^[³¹^]的动物实验表明，钛离子可使小鼠血液和脾脏中的淋巴细胞数量显著增加。钛离子促进T淋巴细胞增殖的机制尚不明确，有学者认为钛离子被T淋巴细胞吞噬后，进入到胞浆、胞核内，通过影响相关功能基因表达或细胞因子的分泌来促进细胞增殖^[²⁶^]。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程。受到细胞自主及环境因素的控制，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡^[^32-33^]。研究以T 淋巴细胞为研究对象，探讨钛离子诱导T淋巴细胞增殖过程中细胞周期进程的变化规律。FCM结果表明，对照组的细胞大多数处于G₀/G₁期；低、中、高浓度组G₀/G₁期细胞比例较对照组显著减少(P < 0.05)，S期、G₂/M期细胞比例较对照组显著增加(P < 0.05)。钛离子通过促进T淋巴细胞由G₀/G₁期向S期、G₂/M期转换，从而使进入分裂期的细胞增加。研究根据细胞周期实验结果进一步证实了钛离子可促进T淋巴细胞增殖。

CD69是一种细胞表面的磷酸化的同二聚体蛋白，它的表达依赖于新的RNA合成和翻译，被认为是反映T淋巴细胞早期活化的重要标志^[^34-35^]。研究表明，低、中、高浓度钛离子分别作用于植物血凝素(+)组T淋巴细胞，与对照组相比均上调CD69的表达(P < 0.05)，说明炎症状态下的T淋巴细胞能表达一定量的CD69，钛离子加入后使得CD69的表达率进一步增加。对于植物血凝素(-)组T淋巴细胞，未加入钛离子时，CD69的表达率极低，加入低、中、高浓度钛离子后可上调CD69的表达(P < 0.05)且具有浓度依赖性，但远远低于植物血凝素(+)组细胞，表明钛离子能使生理状态下的T淋巴细胞产生活化效应，但这种活化水平低于炎症状态下的T淋巴细胞。Sang等^[³⁶^]的动物实验也表明，钛离子可上调小鼠体内受到炎症刺激脾脏中T淋巴细胞CD69的表达。这也提示，当口腔内存在种植体周围炎时，种植体表面释放的钛离子可增强T淋巴细胞早期活化效应并分泌细胞因子激活破骨细胞，从而加快种植体周围骨吸收。

CD25是白细胞介素2受体α链，静息状态下T淋巴细胞仅表达中亲和力受体β、γ链，活化后与低亲和力受体白细胞介素2受体α链结合，形成高亲和力白细胞介素2受体^[³⁷^]。白细胞介素2与T淋巴细胞表面白细胞介素2受体结合介导T淋巴细胞中期活化^[³⁸^]。本研究发现钛离子对植物血凝素(+)组和植物血凝素(-)组T淋巴细胞中期活化抗原CD25的表达均无显著影响。Cachinho等^[³⁹^]研究表明，钛离子对外周血单个核细胞白细胞介素2的表达无明显差异。Li等^[⁴⁰^]发现，在种植体无菌性松动的患者局部组织中无白细胞介素2受体的表达。结合实验结果，可推断钛离子作用于T淋巴细胞后，因无白细胞介素2受体和白细胞介素2的生成，从而阻止T淋巴细胞的中期活化。提示钛离子的骨免疫调节机制比较复杂，可能涉及到细胞内多个信号转导通路的影响。

综上所述，实验发现钛离子能显著促进T淋巴细胞体外增殖及早期活化，并能诱导T淋巴细胞进入S期、G₂/M期，使进入分裂期的细胞增加，从而参与骨免疫调节，但其具体机制有待于进一步深入研究和探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

钛离子对T淋巴细胞体外增殖及活化的影响

Effects of titanium ions on the proliferation and activation of T lymphocytes in vitro

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[2]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[3]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[4]	郑小龙, 何晓铭, 龚水帝, 庞凤祥, 杨帆, 何伟, 刘少军, 魏秋实. 酒精性股骨头坏死患者的骨转换特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 657-661.
[5]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[6]	蒋欣, 乔良伟, 孙东, 李明, 房军, 曲青山. 肾移植患者血清中长链非编码RNA PGM5-AS1表达及调控人肾小球内皮细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 741-745.
[7]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[8]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[9]	刘江锋. 纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料联合锁定钢板治疗股骨骨纤维异常增殖症[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 542-547.
[10]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[11]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[12]	杨俊辉, 罗金莉, 袁小平. 人生长激素对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3956-3961.
[13]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[14]	杨彩会, 刘启成, 董明, 王丽娜, 左美娜, 陆颖, 牛卫东. 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶促进慢性根尖周炎模型小鼠的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3654-3659.
[15]	刘珂珂, 段昕, 马向瑞, 张云涛. 以电纺丝膜为载体观察桂皮醛对高糖环境下成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3500-3504.