铜/低密度聚乙烯复合材料宫内节育器引起子宫异常出血与铜离子浓度和血管生成的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
含铜宫内节育器：由于铜的作用显著提高了避孕效果，这主要是因为铜在宫腔内溶蚀而释放出铜离子，而铜离子具有生物毒性，可产生了一些不良反应，可见铜的溶蚀行为直接关系到含铜宫内节育器能否安全、长效使用。
子宫异常出血：原因并非单一因素，主要有机械性压迫、炎症和异物反应、宫内生化环境改变、纤溶系统活性增加、前列腺素失衡等。含铜宫内节育器致出血机制错综复杂，以往研究多认为与解剖、内分泌、免疫因素等相关。近年来研究发现，子宫内膜微血管结构和功能变化与子宫异常出血密切相关，其中血管内皮生长因子为最重要的血管生成因子，有强烈增加血管通透性的作用，可能参与了含铜宫内节育器引起子宫内膜微血管结构和功能改变的过程。

背景：含铜宫内节育器表面的铜丝在宫腔内持续释放铜离子，避孕效果明显，但容易发生节育器异位、子宫异常出血、经期延长、腰腹酸痛等不良反应。
目的：探讨铜/低密度聚乙烯复合材料宫内节育器致子宫异常出血与子宫内膜组织中铜离子浓度及血管内皮生长因子表达的关系。
方法：纳入取铜/低密度聚乙烯复合材料宫内节育器女性患者60例，年龄25-40岁，分为子宫异常出血组(n=32)和无出血组(n=28)；另选择未放置宫内节育器且月经周期正常的女性为对照组(n=20)。子宫异常出血组与无出血组在月经干净后4-7 d内取宫内节育器的同时，刮取子宫内膜组织；对照组月经干净后4-7 d内刮取子宫内膜组织。采用原子吸收法测定子宫内膜组织铜离子含量，免疫组织化学染色检测子宫内膜血管内皮生长因子表达，计数微血管密度；火焰原子吸收法测定模拟宫腔液中宫内节育器铜离子溶蚀量。
结果与结论：①铜离子含量：子宫异常出血组高于无出血组(P < 0.05)，无出血组高于对照组(P < 0.05)；②铜离子溶蚀量：子宫异常出血组高于无出血组(P < 0.05)；③组织学观察：与无出血组和对照组相比，子宫异常出血组血管内皮生长因子蛋白表达和微血管密度明显增加(P < 0.05)；无出血组与对照组内皮生长因子蛋白表达与微血管密度比较差异无显著性意义；④子宫内膜血管内皮生长因子表达与微血管密度、铜离子含量呈正相关(P < 0.05)。⑤结果表明：铜/低密度聚乙烯复合材料宫内节育器置入后，子宫内膜组织中铜离子浓度过高可能引起血管内皮生长因子高表达，血管内皮生长因子通过多种途径增加子宫内膜微血管密度，促进微血管扩张、充血，导致子宫异常出血。

ORCID: 0000-0002-9765-4224(邓婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 含铜宫内节育器, 子宫异常出血, 铜离子浓度, 血管内皮生长因子, 微血管密度

Abstract:

BACKGROUND: To achieve excellent contraceptive effects, the copper wire on the copper-containing intrauterine device surface persistently releases copper ions, but ectopic intrauterine device, abnormal uterine bleeding, menostaxis and waist and abdominal pain are usually inevitable.
OBJECTIVE: To investigate the correlation of abnormal uterine bleeding caused by copper/low-density polyethylene nanocomposite intrauterine device with copper ion concentration and expression of vascular endothelial growth factor in endometrial tissues.
METHODS: Totally 60 female patients, aged from 25 to 40 years old, hospitalized for taking intrauterine devices were enrolled, and those patients were divided into abnormal uterine bleeding group (n=32) and non- bleeding group (n=28). In the meanwhile, another 20 women without intrauterine devices and with the normal menstrual cycle were selected as control group. Patients in the abnormal uterine bleeding group and non- bleeding group underwent the removal of intrauterine device and scraping endometrial tissues within 4-7 days after menstruation; patients in the control group underwent scraping endometrial tissues within 4-7 days after menstruation. The copper ion content in endometrial tissues was measured by atomic absorption method; expression of endometrial vascular endothelial growth factor detected by immunohistochemical staining and the microvessel density counted. Additionally, the corrosion ratio of copper ion in the simulated uterine fluid was detected using flame atomic absorption spectroscopy method.
RESULTS AND CONCLUSION: The content and corrosion ratio of copper ion in the uterine abnormal bleeding group was significantly higher than those in the non-bleeding group (P < 0.05), and the copper ion content of no bleeding group was significantly higher than that of control group (P < 0.05). The amount of copper in the intrauterine device of abnormal uterine bleeding group was higher than that in non-bleeding group (P < 0.05). Compared with the control and non-bleeding groups, the vascular endothelial growth factor expression and microvessel density were significantly increased in the uterine abnormal bleeding group (P < 0.05); and the control group and non-bleeding group had no significant differences in the vascular endothelial growth factor expression and microvessel density. Furthermore, there was a positive correlation of the vascular endothelial growth factor expression with microvessel density and copper ion content. In conclusion, after implantation of copper/low-density polyethylene nanocomposites intrauterine device, the higher copper ion concentration in endometrial tissues may lead to the over-expression of vascular endothelial growth factor that increases the endometrial microvessel density through a variety of ways, and promote microvessel expansion and congestion, finally resulting in abnormal uterine bleeding.

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Key words: Intrauterine Devices, Polyethylene, Uterine Hemorrhage, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

邓婷，李晴，陈丹，谢熙. 铜/低密度聚乙烯复合材料宫内节育器引起子宫异常出血与铜离子浓度和血管生成的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5057-5063.

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图/表（结果） 5

2.1 参与者数量分析 80例受试者均进入结果分析。

2.2 分组流程图见图1。

2.3 各组基线资料比较各组在年龄、体质量、孕产次方面比较差异无显著性意义(P > 0.05)，子宫异常出血组和无出血组宫内节育器放置年限比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 子宫内膜组织铜离子含量子宫异常出血组和无出血组子宫内膜组织中铜离子含量分别为(6.52± 2.01) μg/g和(4.28±1.23) μg/g，组间比较差异有显著性意义 (P < 0.05)。对照组子宫内膜组织中铜离子含量为(1.68±0.45) μg/g，与其他两组比较差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图2。

2.5 含铜宫内节育器在模拟宫腔液中的铜离子释放含量自宫腔内取出的宫内节育器均有深浅不一的灰白色和深褐色沉积物沉积，铜丝有溶蚀现象，纵臂下部铜管较上部腐蚀重，尾丝变硬、变脆。子宫异常出血组和无出血组宫内节育器的铜溶蚀量分别为(18.3±5.7) μg/d和(15.6±3.8) μg/d，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 子宫内膜血管内皮生长因子的表达和微血管密度与无出血组和对照组相比，子宫异常出血组血管内皮生长因子蛋白表达和微血管密度明显增加(P <0.05)；无出血组与对照组血管内皮生长因子蛋白表达和微血管密度比较差异无显著性意义，见图3，表2。

2.7 子宫内膜血管内皮生长因子表达与微血管密度和铜离子含量的关系子宫内膜血管内皮生长因子表达与子宫内膜微血管密度呈正相关(r=0.452，P < 0.05)，子宫内膜血管内皮生长因子表达与子宫内膜组织中铜离子含量呈正相关(r=0.065，P < 0.05)。

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引言

宫内节育器是已育妇女采用最多的避孕方法，由1909年波兰学者Richard Richter首次报道宫内节育器用于人类避孕，而真正开始推广应用的是1920年德国Ernst Drafenberg(格氏)用蚕肠线和银丝制成的星形宫内节育器改进为合金环，即格氏环，之后一直不断发展，先后经历了塑料宫内节育器、含铜宫内节育器、激素释放宫内节育器等，在材质、形态、载体各方面均有不断创新，避孕效果得到很大提高^[1-4]。含铜宫内节育器表面的铜丝在宫腔内持续释放出铜离子，避孕效果显著提高，在临床应用较广泛，其缺点是容易发生节育器异位、月经过多、经期延长、腰腹酸痛等一些不良反应^[5-6]，其中以子宫异常出血和疼痛最为常见，当出血量较多及出血时间较长时极易导致贫血^[7-8]，严重影响了患者身体健康和宫内节育器的续用率。子宫异常出血的原因并非单一因素，主要有机械性压迫、炎症和异物反应、宫内生化环境改变、纤溶系统活性增加、前列腺素失衡等^[9-10]。含铜宫内节育器致出血机制错综复杂，以往研究多认为与解剖、内分泌、免疫因素等相关。近年来研究发现，子宫内膜微血管结构和功能变化与子宫异常出血密切相关，其中血管内皮生长因子为最重要的血管生成因子，有强烈增加血管通透性的作用^[11-12]，可能参与了含铜宫内节育器引起子宫内膜微血管结构和功能改变的过程。血管内皮生长因子主要通过与位于血管内皮细胞的受体KDR结合而发挥其血管通透性等生物学作用。目前，调控血管内皮生长因子受体分泌的机制尚不清楚，大多数研究认为缺氧、细胞因子和生长因子等对血管内皮生长因子受体的表达都起着主要调控作用。试验分析铜/低密度聚乙烯复合材料宫内节育器在体外铜离子释放量、置入体内后子宫内膜组织中铜离子和血管内皮生长因子含量，探讨铜离子浓度和血管生成与子宫异常出血的关系。

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材料方法

1.1 设计回顾性病例分析。

1.2 时间及地点于2014年2月至2015年1月在福建省妇幼保健院完成。

1.3 对象收集福建省妇幼保健院妇产科门诊就诊要求取宫内节育器女性患者60例，按有无出血将其分为2组：①子宫异常出血组32例，年龄26-40岁，平均34.5岁；置器时间为9个月-7年，平均(5.23±1.56)年。②无出血组28例，年龄25-38岁，平均32.9岁；置器时间为8个月-7年，平均(5.48±1.52)年。

纳入标准：①年龄25-40岁者；②近3个月未服用过性激素、前列腺素合成酶抑制剂及纤溶抑制剂者；③宫内节育器位置正常者。

排除标准：①有生殖系统疾病者；②肝肾功能异常者；③有甲状腺功能异常，内分泌疾病者和血液系统病史者。

另选择20例未放置宫内节育器且月经周期正常的女性为对照组，年龄25-38岁，平均33.8岁。

1.4 材料 TCu380A宫内节育器由T型架(带铜管和铜丝)和尾丝组成。T型架中的塑料支架材料为含20%- 24%硫酸钡的低密度聚乙烯，铜管和铜丝由99.99%高导无氧铜制成，尾丝材料为聚乙烯，采用环氧乙烷气体灭菌，规格28 mm×32 mm，30 mm×34 mm，32 mm×36 mm。特点：①T字型支架适合于子宫形态和子宫收缩；②节育器含铜的总面积为380 mm²。通过释放铜离子来杀伤精子，使精子丧失受精能力；③避孕有效期长，妊娠率低，可透性好。

1.5 方法子宫异常出血组和无出血组在取宫内节育器的同时刮取子宫内膜(月经干净后4-7 d)，对照组在月经干净后4-7 d刮取子宫内膜。将采集的内膜组织用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，密封保存于-20 ℃冰箱，一部分用于子宫内膜组织铜离子含量测定，一部分用于免疫组织化学染色。

1.6 主要观察指标

子宫内膜组织铜离子含量测定：将子宫内膜称质量后置于烧杯中，加入混合酸(硝酸+高氯酸)5 mL，盖上表面皿浸泡过夜，再置于电炉上加热，缓慢加温至近干，待冒白烟较少且消化液呈无色透明或略显黄色时为止，冷却后加少量蒸馏水过滤，用纯水少量多次洗涤烧杯，洗液合并过滤于容量瓶中并用水定容，混匀，采用原子吸收法测定子宫内膜铜离子含量。

体外释放试验：模拟宫腔液被用作含铜宫内节育器的释放介质^[13-14]，其成分为NaCl 4.97 g/L，KCl 0.224 g/L，CaCl₂ 0.167 g/L，NaHCO₃ 0.25 g/L，葡萄糖0.5 g/L，NaH₂PO₄•2H₂O 0.072 g/L，血清白蛋白0.5 g/L，通过加入稀盐酸或稀释后的氢氧化钠溶液来对模拟宫腔液的pH值进行调节，使其保持在7.0左右。将含铜宫内节育器放入50 mL模拟宫腔液中，温度控制在(37.0±0.1) ℃，为了防止模拟宫液中铜离子浓度过高而影响颗粒的腐蚀速率，第1周时，每天用新配模拟宫腔液换液，之后每2 d换液1次，30 d后每周换液1次，浸泡60 d，采用火焰原子吸收法测定浸提液中铜离子含量。

免疫组织化学染色：血管内皮生长因子鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，稀释度为1︰300，即用型小鼠抗人CD34多克隆抗体和SP试剂盒购自深圳晶美生物制品有限公司。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加体积分数为3%过氧化氢10 min以灭活内源性过氧化物酶活性，PBS漂洗3次，每次5 min；置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH=6.0)中用电炉煮沸15-20 min进行抗原修复，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加山羊血清室温封闭20 min，甩去多余液体；滴加一抗，4 ℃过夜，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加生物素标记的二抗，室温孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加SP试剂，室温孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB显色，PBS漂洗，苏木精复染、盐酸乙醇分化、二甲苯透明、中性树胶封固。以PBS代替一抗作为阴性对照，进行上述免疫组织化学染色。

定量分析：①光镜下观察血管内皮生长因子阳性表达细胞胞浆呈棕黄色，每张切片选择5个视野，计数染色明显的阳性细胞，并用全自动图像分析系统测定细胞内阳性产物的吸光度值。②以CD34标记微血管内皮细胞，选取内皮细胞染色较多的5个视野，计数所有染色微血管，取其平均值作为微血管密度值。

1.7 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，实验数据用x(_)±s表示，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，采用Person模型进行线性相关性分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

宫内节育器是广大育龄妇女目前普遍使用的避孕工具，其具有安全、长效、简便等优点，与以往的惰性宫内节育器相比，含铜宫内节育器由于铜的作用显著提高了避孕效果，这主要是因为铜在宫腔内溶蚀而释放出铜离子，而铜离子具有生物毒性，可产生了一些不良反应，可见铜的溶蚀行为直接关系到含铜宫内节育器能否安全、长效使用^[15-18]。一般情况下，人子宫内膜中铜含量极微，放置含铜宫内节育器后铜浓度增加。研究发现子宫异常出血组子宫内膜组织中铜离子含量明显高于无出血组，且无出血组子宫内膜组织中铜离子含量明显高于对照组(P < 0.05)。文献报道人体宫腔液的pH值从6.0-7.9不等^[19]，原因可能是人的个体差异比较大，试验通过加入稀盐酸或稀释后的氢氧化钠溶液来对模拟宫腔液的pH值进行调节，使其保持在7.0左右，将取出的含铜宫内节育器放入50 mL模拟宫腔液中，温度控制在(37.0±0.1) ℃，采用火焰原子吸收法测得子宫异常出血组宫内节育器的铜溶蚀量高于无出血组(P < 0.05)，李丽等^[20]也检测了宫内节育器置入后子宫异常出血、无出血妇女及未放置宫内节育器健康妇女子宫内膜组织铜离子含量和模拟宫腔液中的铜释放量，得出同样的结论，认为含铜宫内节育器的高溶蚀量可能导致子宫内膜组织铜离子含量的增加。

子宫异常出血是宫内节育器的主要不良反应之一，其发生机制是多因素的，它依赖于子宫内膜血管的生成、修复^[21-22]。血管生成的开关受血管生成因子和抑制因子双重调节，血管内皮生长因子在其中可能起关键作用。血管内皮生长因子是一种内皮细胞的特异性有丝分裂原，促进血管内皮细胞的有丝分裂和趋化作用，能增加内皮细胞的间隙，引起血浆蛋白外渗，提高血管通透性^[23-24]。刘小乐等^[25]研究表明，血管内皮生长因子在子宫内膜腺上皮细胞、基质细胞及血管内皮细胞均有表达，置含铜宫内节育器后子宫异常出血组有血管内皮生长因子mRNA扩增，血管内皮生长因子表达较未置含铜宫内节育器月经周期正常组及置含铜宫内节育器无子宫异常出血明显增加，后两组血管内皮生长因子表达无明显差异。尹玖^[26]应用免疫组化方法检测子宫内膜血管内皮生长因子的表达，根据申氏法计算表达的阳性单位值，结果子宫内膜中血管内皮生长因子表达有明显的周期性：增生期较弱，分泌期增强至峰值，月经期表达最弱，其参与子宫内膜血管生成的调节，异常表达的血管内皮生长因子影响子宫内膜的脱落和修复可能是含铜宫内节育器出血不良反应的原因之一。

铜是血管生成的一个关键元素，在许多生命活动中扮演重要角色。目前的研究仍无法完全解释铜吸收多与血管增殖的因果关系，即到底先是铜释放过多然后导致血管活动加强、血流量加大，还是先是血管活动加强导致血管组织吸收铜过多。McAuslan等^[27]报道低浓度的CuSO₄能诱导兔眼球内血管发生，释放的铜离子能促进内皮细胞迁移，进而形成新生毛细血管^[28]。后来研究发现，铜离子能诱导牛内皮细胞合成纤维结合素^[29]，人们意识到Cu²⁺还具有细胞内功能。铜离子能通过影响调控低氧诱导因子1来刺激内皮细胞，影响与血管发生相关的基因和蛋白表达，上调血管内皮生长因子表达^[30]。临床研究也发现，癌症患者血浆中铜离子的浓度与肿瘤的恶化程度及对药物治疗的反应相关。通过Cu²⁺螯合剂四硫钼酸盐减少体内铜离子的含量可以显著减缓肿瘤的血管生成，抑制肿瘤生长^[31-33]。以上研究均表明铜离子含量过多可导致血管发生，而降低铜离子含量可抑制血管生成。研究结果显示，放置含铜宫内节育器后子宫异常出血患者子宫内膜血管内皮生长因子表达明显增多，提高血管通透性，使微血管扩张，基质出现充血水肿，子宫内膜血管功能被破坏，导致子宫异常出血。微血管密度是衡量血管生成的定量指标，正常月经期间存在周期性的血管形成。研究结果显示，放置含铜宫内节育器后子宫异常出血患者子宫内膜微血管密度显著增加，并且子宫内膜血管内皮生长因子表达与子宫内膜微血管密度和铜离子浓度呈正相关(P < 0.05)，推测放置含铜宫内节育器后子宫异常出血妇女子宫腔内微环境的改变可能引起血管内皮生长因子表达增强，其中子宫内膜组织中铜离子浓度过高可能是导致血管内皮生长因子高表达的原因之一，血管内皮生长因子通过多种途径增加子宫内膜微血管密度，促进微血管扩张、充血，导致子宫异常出血^[34-37]。

综上所述，放置含铜宫内节育器可影响子宫内膜血管内皮生长因子的表达，并通过多种机制延长内膜脱落和修复导致子宫异常出血，但血管生成因子众多，其他因子对血管生成的调控作用还有待探讨。另外没有考虑组织铜的差异是避孕器质量差异还是组织侵蚀铜能力的差异，后续会从不同方面进行验证。随着材料学的发展，开发和研制出组织相容性好的材料，制成形态更适合子宫腔的新型节育器，防治宫内节育器引起的子宫异常出血值得进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程