2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠120只，分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2  神经功能评价  阿是穴电针组和足阳明胃经电针组大鼠术后1-5周神经功能评分与对照组相比神经功能得分随时间逐渐升高(P < 0.05)，见表1。

2.3  病理组织检查结果  苏木精-伊红染色见图1。对照组1周时脊髓结构极度紊乱，神经元消失，部分髓鞘脱失，中度炎细胞浸润；2周后脊髓结构逐渐修复部分神经元逐渐出现直至第5周脊髓结构轻微紊乱，神经元数量明显增多，无髓鞘脱失，偶有炎细胞浸润，无明显出血。阿是穴电针组及足阳明胃经电针组1周灰质区中度炎细胞浸润，毛细血管数量增多，有轻微出血，有少量脂肪滴；与1周相比，2周时炎细胞浸润减轻，毛细血管数量减少，无出血，结构仍显紊乱；与2周相比，3周时炎细胞浸润无明显变化，无出血，结构稍微紊乱；与3周相比，4周轻度炎性细胞浸润，无出血，神经元数量增多，结构略显紊乱；5周轻度炎细胞浸润，无出血，神经元数量增多。

2.4  神经元计数结果  每张切片随机选取5个视野，统计每个视野中神经元细胞的数量，计算平均数，即为该样本的神经元相对数量。对照组1-5周神经元数量先降低后升高；和对照组相比，阿是穴电针组1-5周明显升高(P < 0.05)，4周最高；足阳明胃经电针组1-5周明显高于对照组(P < 0.05)，5周升至29.67±2.52；和阿是穴电针组相比，1-3周足阳明胃经电针组明显升高(P < 0.05)，其他时间点没有统计学差异(见表2)。

2.5  免疫组织化学染色结果

2.5.1  缺氧诱导因子1α  其蛋白阳性表达位于细胞核和细胞浆内，第1周对照组阳性表达略高于阿是穴电针组和足阳明胃经电针组，差异无显著性意义，从2周开始对照组阳性表达逐渐下降，至第5周时表达最低。2-4周和对照组相比，足阳明胃经电针组阳性表达显著增高(P < 0.05)，到5周时表达仍高于对照组，但是差异无显著性意义。2-5周足阳明胃经电针组整体表达略高于阿是穴电针组，差异无显著性意义。见图2，表3。

2.5.2  血管内皮生长因子  其蛋白阳性表达位于细胞浆内，对照组从第1周开始阳性表达逐渐加强；第2周达到高峰，随后逐渐下降；和对照组相比，1-4周足阳明胃经电针组表达明显升高(P < 0.05)，第5周仍高于对照组，但差异不明显。阿是穴电针组和对照组相比，1-2周明显升高(P < 0.05)，3-5周虽然仍高于对照组，但是差异无显著性意义。见图3，表4。

2.6  qRT-PCR检测结果

2.6.1  缺氧诱导因子1α mRNA表达  随着脊髓损伤时间的延长，对照组缺氧诱导因子1α mRNA表达逐渐降低，4周时降到最低，5周有所回升，对照组1周缺氧诱导因子1α mRNA表达略高于2个电针组，但差异无显著性意义；2-4周足阳明胃经电针组缺氧诱导因子1α mRNA显著高于对照组(P < 0.05)，到5周时仍高于对照组，但差异不明显；阿是穴电针组2-5周表达也高于对照组，但差异无显著性意义；各时间点足阳明胃经电针组表达高于阿是穴电针组，但差异无显著性意义。见表5。

2.6.2  血管内皮生长因子mRNA表达  随着脊髓损伤时间的延长，对照组血管内皮生长因子mRNA表达先降低后升高，4周时降到最低，5周有所回升，1-4周足阳明胃经电针组血管内皮生长因子mRNA表达显著高于对照组(P < 0.05)，5周和对照组比较差异无显著性意义。阿是穴电针组1，2周血管内皮生长因子mRNA表达显著高于对照组  (P < 0.05)，而3-5周和对照组比较差异无显著性意义。和阿是穴电针组相比，1，2周足阳明胃经电针组血管内皮生长因子mRNA表达显著升高(P < 0.05)，其他时间点虽然也高于阿是穴电针组，但是差异无显著性意义。见表6。

2.7  Western blot检测结果

2.7.1  缺氧诱导因子1α蛋白表达  随着脊髓损伤时间的延长，1-5周对照组缺氧诱导因子1α蛋白表达逐渐降低，5周时降到最低。对照组1周缺氧诱导因子1α蛋白表达略高于2个电针组，2-4周足阳明胃经电针组表达明显高于对照组(P < 0.05)，5周时高于对照组，但差异无显著性意义。阿是穴电针组2-5周表达也高于对照组，但是差异无显著性意义；足阳明胃经电针组2周显著高于阿是穴电针组(P < 0.05)，其他时间点差异无显著性意义。见图4，表7。

2.7.2  血管内皮生长因子蛋白表达  随着脊髓损伤时间的延长，对照组血管内皮生长因子蛋白表达先降低后升高，3周时表达最低，3周以后逐渐回升；1-4周足阳明胃经电针组血管内皮生长因子蛋白表达显著高于对照组(P < 0.05)，5周和对照组比较差异无显著性意义；阿是穴电针组1-3周血管内皮生长因子蛋白表达显著高于对照组(P < 0.05)，而4，5周和对照组比较差异无显著性意义；足阳明胃经电针组和阿是穴电针组相比，差异无显著性意义。见图5，表8。

脊髓损伤是截瘫的主要原因，神经再生和修复被认为是极其困难的，并且是当前神经科学研究的主要焦点问题^[1]。英国社会科学家研究显示预计每年1 270例脊髓损伤新病例的终生成本保守估计为14.3亿英镑，相当于每个患者花费112万英镑^[2]；加拿大对1 716例脊髓损伤患者的一项研究也显示脊髓损伤终身治疗费用高达33.6万美元，初次住院同时并发压疮的患者甚至高达47.96万美元^[3]。面对如此高昂的治疗费用，寻找一种安全可靠且经济实惠的治疗方式愈是显得迫在眉睫。

脊髓损伤不可再生的理论已经被抛弃^[4]，尽管如此，脊髓损伤后神经再生的生理病理机制复杂，脊髓损伤后局部组织缺血缺氧，再生灌注障碍，导致神经细胞坏死及轴突髓鞘改变，形成胶质瘢痕，严重阻碍轴突再生与髓鞘化，是影响神经再生的主要障碍^[5-6]。组织缺血缺氧又是胶质瘢痕形成的关键性环节，改善脊髓损伤后组织缺血缺氧，构建良好的血氧微环境是决定神经再生的关键因素^[7]。在脊髓损伤时缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α)可刺激作为血管生成的潜在因子包括血管内皮生长因子在内的多种因子的表达^[8]，提高组织对缺血缺氧状态的耐受性并重建血氧微循环，在脊髓损伤后神经功能恢复的环节起关键作用。血管内皮生长因子在神经组织及血管生成区域表现活跃，调节脊髓损伤区内皮细胞增殖、分化和早期血管生成，作为血管生成的调节剂，起到修复受损脊神经和帮助重建血氧微环境的作用^[9]。

中医自《内经》开始就提出了“治痿独取阳明”的理论，成为后世治疗痿病所遵循的治疗原则，明代李梃提出“痿属内伤补血气”的主张。足阳明胃经是五脏六腑之海，气血化生之源，儒养筋骨，主司关节，所以说气血虚弱乃是痿病发生的根本原因，补益气血是痿病的基本治疗原则。而针刺治疗强调的是平衡气血、调和阴阳，遵循的是补虚泻实原则，故能够成为治疗痿病的主要方法。作者发现，中医“痿病”从气血论治理论与脊髓损伤神经修复的关键环节在于改善组织血氧微环境有着惊人的相似，于是提出了“电针刺激可通过干预缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子信号转导，改善脊髓血氧微环境从而促进神经再生”的假说。实验通过建立脊髓损伤大鼠模型探讨电针干预对缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子表达的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年1至3月在广西医科大学完成。

1.3  材料 

1.3.1  实验动物  SPF级雌性SD大鼠120只，体质量180-220 g，由广西医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK桂2014-003。饲养环境湿度40%-47%，温度20-25 ℃，光照10 h阴暗14 h。

1.3.2  试剂及仪器  SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、PMSF(均为碧云天生物技术有限公司)；RIPE 蛋白裂解液(索莱宝科技生物有限公司)；Trizol(大连宝生物有限公司)；SYBR Green mix(南京诺维赞生物科技有限公司)；反转录试剂盒(fermentas公司)；Hif-1α抗体、血管内皮生长因子抗体(Affiinity)；Tanon-4200全自动化学发光图像分析系统；电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；半干转膜仪(日本ATTO公司)；ABI7500荧光定量PCR仪。

1.4  实验方法

1.4.1  大鼠造模  120只大鼠均制作脊髓夹伤模型。①腹腔注射体积分数10%水合氯醛(3.5 mL/kg)，充分麻醉后，行俯卧位，可摸见大鼠背部T₉、T₁₀、T₁₁棘突靠近，同时T₁₀棘突在水平方向，以此即可定位T₁₀脊髓节段，以T₁₀为中心消毒；②碘伏消毒后切开皮肤逐层拨开筋膜及棘间肌，逐渐暴露T_9-11椎板，小心咬开T_9-11椎板，并将T₁₀两侧椎弓根完全咬断，清晰的暴露硬脊膜包裹的脊髓；③以微型血管夹夹闭脊髓，保持夹闭状态20 s制作脊髓夹伤模型，造模结束后可见夹伤处有一大体可见淤血痕迹；④造模成功后，分层缝合肌肉和皮肤。术后给予青霉素腹腔注射，以防感染的发生，减少死亡率。

1.4.2  实验中大鼠死亡率及处理办法  课题正式实验前经过充足的预实验准备，大鼠造模发生的死亡率远远低于课题组要求的1/4死亡率，如造模及干预期间发生大鼠死亡，针对其所在组别进行大鼠造模及干预的补充。

1.4.3  造模后大鼠的电针干预  SD大鼠120只随机分为3组：空白对照组大鼠造模后不予任何干预措施；阿是穴电针组、足阳明胃经电针组大鼠术后第3天开始接受每日1次的电针治疗。阿是穴电针组选择2个阿是穴：位于脊髓全横断处上、下约2个脊髓段(T_8-9和T_11-12)的椎体棘突之间^[10]。足阳明胃经电针组选择双侧伏兔、足三里穴。每个穴位各刺入1枚毫针，进针深度为穿皮后再进针约  2 mm，刺激强度为12-15 mV(C6805-Ⅰ型电针治疗仪)，刺激频率为2 Hz，波形选择为疏密波，留针时间为     30 min，每周5次。

1.4.4  指标检测方法

(1)BBB评分：是研究脊髓损伤动物实验广泛采用的评分标准，对于严重脊髓损伤的神经功能研究具有重要的意义^[11]。大鼠下肢功能BBB评分：采用双人、双自独立评估方法，对各组大鼠干预后1，2，3，4，5周时间段神经功能变化进行评定。

(2)病理组织检查：分别于干预后1，2，3，4，5周麻醉大鼠，取损伤的脊髓组织标本。常规苏木精-伊红染色，经包埋、切片、脱蜡、水化、染色等步骤后在光学显微镜下观察脊髓损伤后各时间点组织形态学变化。

(3)免疫组织化学染色：脊髓组织标本经包埋、切片、脱蜡、烤片、乙醇浸泡、PBS浸洗、脱水、封固后镜检观察缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子在大鼠损伤脊髓表达及分布位置，以细胞中出现明显黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色。染色结果根据免疫组织化学半定量评分标准^[12]：高倍镜(×400) 下通过随机截取每张图片3个视野，统计每个视野的阳性细胞数量，观察其阳性细胞表达强度。

(4)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：利用qRT-PCR技术检测缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子基因的表达。①将取材的脊髓组织放入研钵中磨碎，再放入无RNA酶的EP管中，加入1 mL Trizol浸泡，混合均匀，置于-20 ℃冰箱冻存，提取组织裂解液移置离心管中予用1 mL枪头反复吹打至裂解液中无明显沉淀，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，吸取上清液1.5 mL置于新的EP管中，加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，混合均匀后置于-20 ℃冰箱沉淀10 min，加入20 μL RNase-free水至完全溶解，紫外线分析测定所抽取RNA的浓度；②qPCR引物设计：缺氧诱导因子1α上游基因：AGA GGA AGC GAA AAA TGG AAC A，下游基因：AAA GCG ACA TAG TAG GGG CAC G，退火温度102 ℃；血管内皮生长因子上游基因：CGT CCA ACT TCT GGG CTC TT，下游基因：CCC CTC TCC TCT TCC TTC TC，退火温度150 ℃；以反转录的cDNA为模板，用目的基因特异性引物和内参引物扩增待检测的目的基因片段和看家基因，摸索适合qPCR上机的最佳引物退火温度和模板量。

(5)Western blot检测：抽提脊髓组织总蛋白，以Western blot技术检测缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白的变化。①将脊髓组织混合部分液氮充分研磨，加入1 mL RIPE裂解液，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清液转移到新的离心管中，分装100 μL/管，将上述样品于蛋白缓冲液中，100 ℃煮沸10 min后12 000 r/min离心 1 min，备用；②根据不同蛋白分子量大小配置不同浓度的胶，等胶凝固后拔出梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样，电泳：恒压80 V，30 min后恒压120 V，1 h；③用封闭液室温封闭膜1 h，用新配置的封闭液稀释一抗，其中缺氧诱导因子1α蛋白抗体稀释比1∶400，血管内皮生长因子蛋白抗r体稀释比1∶1 000；4 ℃孵育一抗过夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗，室温下孵育膜1 h，用TBST洗膜3次，每次   5 min，沥干，放入化学发光成像仪中，曝光，拍照记录。

1.5  主要观察指标  ①各组大鼠的BBB评分；②各组大鼠的脊髓病理组织观察；③免疫组织化学染色、qRT-PCR及Western blot检测损伤脊髓缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，多组比较采用F 检验；两两比较采用t检验；计数资料以%表示，用χ²检验；以P < 0.05为差异有显著性意义。

脊髓损伤作为世界性的热点难点课题，经过国内外专家学者的不断探索研究，脊髓损伤后的再生修复也逐渐的变得不是那么触不可及^[13]，但是由于其伤后的生理病理改变机制复杂，因此脊髓损伤后的康复治疗至今尚未有妥善之法^[14]。脊髓损伤患者由于功能障碍引发诸如尿路感染、压疮等并发症严重影响患者的身心健康，而在发展中国家由于当地医院缺乏专业知识及专门的脊髓损伤病房康复中心，脊髓损伤患者的健康生活需求尚未满足^[15-16]。

脊髓损伤的修复除了依靠神经纤维和突触的重建外，血管的新生、构建良好的血氧微环境也是脊髓神经修复的关键因素^[7]。研究显示，缺氧诱导因子1α在细胞内氧浓度变化后调节基因表达，被认为是低氧相关转录因子核心中的调控基因^[17]。当组织或细胞处于缺氧环境时，缺氧诱导因子1α是调节氧代谢的最重要转录因子之一^[18]。血管内皮生长因子是最强有力的血管生成促进因子^[19]，可直接作用于血管内皮细胞，刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，通过促进血管生成，间接保护神经免受缺血缺氧损伤^[20-21]。

在传统中医理论中，脊髓损伤古称“体惰”，属于“痿病”的范畴，治疗“痿病”有着“治痿独取阳明”等理论依据，也形成了补益气血的基本治疗原则，而电针正是这些理论及治疗原则最具体的治法体现。现代医学研究也认为电针干预通过抑制胶质纤维酸性蛋白的表达，减少星形胶质细胞增生，从而减少胶质瘢痕的产生为神经修复再生提供积极条件^[22]；同时通过促进乙酰胆碱酯酶活性，上调神经胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达，促进脊髓损伤后前角运动神经元功能的恢复^[23]，证明电针干预确实可以起到受损脊髓的神经功能修复的作用。

此次研究结果证明：①通过严格按照大鼠的下肢功能评分标准对大鼠下肢功能进行评分，发现各组大鼠的BBB评分存在逐渐上升的趋势，包括对照组的BBB评分也是在逐渐上升，这可能是中枢神经系统自我修复的一部分，然而，阿是穴电针组、足阳明胃经电针组通过电针干预的下肢运动功能肌力恢复优于未经干预的脊髓损伤大鼠(P < 0.05)，证明电针干预确实可以促进脊髓损伤大鼠下肢功能的恢复；②通过病理检测发现经电针干预的阿是穴电针组及足阳明胃经电针组对比对照组随着时间的推移，神经的炎性细胞浸润逐渐减轻，毛细血管数量减少，神经元的数量在逐渐的增加，证明电针干预可以在一定程度上阻止神经细胞的凋亡促进神经细胞形态的修复；同时免疫组织化学发现电针干预可以逐渐上调缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子蛋白阳性表达，2周后阿是穴电针组和足阳明胃经电针组高于对照组，差异有统计学意义，在3周时阳性蛋白表达达到最高峰值，开始出现下降，达到正常水平；③对照组PCR及Western blot检测结果显示缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达逐渐降低，在第3周时开始出现上升，证明脊髓损伤大鼠确实存在一定的自我修复能力；而电针干预组缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达逐渐上升，并在第3周时达到峰值，开始出现下降，最终达到正常表达水平，表明通过电针干预的确是促进了缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达。

总之，实验结合BBB评分、病理检测、PCR及Western blot检测，证明通过电针干预脊髓损伤大鼠可以上调缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子的mRNA及蛋白的表达，为脊髓损伤再生修复的基础研究及临床应用提供新的思路，同时也对电针促进神经功能恢复作用的现代医学实验内涵提供了佐证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
缺氧诱导因子1α：脊髓损伤可刺激作为血管生成的潜在因子包括血管内皮生长因子在内的多种因子的表达，提高组织对缺血缺氧状态的耐受性并重建立血氧微循环，在脊髓损伤后神经功能恢复的环节起关键作用。
血管内皮生长因子：在神经组织及血管生成区域表现活跃，调节脊髓损伤区内皮细胞增殖、分化和早期血管生成的生，是作为血管生成的调节剂的存在，起到修复受损脊神经和帮助重建血氧微环境的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

有研究显示，缺氧诱导因子1a在细胞内氧浓度变化后调节基因表达，它的存在及其对靶基因的调控特点，被认为是低氧相关转录因子核心中的调控基因。当组织或细胞处于缺氧环境时，缺氧诱导因子1a是调节氧代谢的最重要转录因子之一。血管内皮生长因子是最强有力的血管生成促进因子，可直接作用于血管内皮细胞，刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，通过促进血管生成，间接保护神经免受缺血缺氧损伤。

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