脱细胞基质材料制备方法及在骨关节软骨损伤修复中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脱细胞基质：是将同种异体组织经过脱细胞工艺处理后，去除能够引起免疫排斥反应的抗原成分，同时完整地保留细胞外基质的三维空间结构及一些对细胞分化有重要作用的生长因子，如成纤维细胞生长因子2、转化生长因子β、血管内皮生长因子等。经过处理的细胞外基质材料具有良好的机械力学性能，该材料的组织相容性好，植入体内没有免疫排斥现象，在体内起着支持、连接细胞的作用，同时其三维的空间结构及细胞因子有利于细胞的黏附和生长。
关节软骨：属于透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，有光泽，它是由一种特殊的叫做致密结缔组织的胶原纤维构成的基本框架，这种框架呈半环形，类似拱形球门，其底端紧紧附着在下面的骨质上，上端朝向关节面，这种结构使关节软骨紧紧与骨结合起来而不会掉下来，同时当受到压力时候，还可以有少许的变形，起到缓冲压力的作用。

背景：研究显示，组织脱细胞基质与正常细胞外基质相比能够在机体内诱导上皮细胞、平滑肌细胞，促进其演化为机体的一部分。
目的：观察脱细胞基质组织工程材料在骨关节软骨损伤修复中的应用效果。
方法：采用随机对照方法将30只新西兰大白兔分为纤维样组织组和脱细胞基质组织组，每组15只，在大白兔股骨髁部建立直径为4 mm的骨关节软骨缺损模型。用牛膝关节软骨制备软骨脱细胞基质支架，脱细胞基质组织组采用脱细胞软骨基质支架修复；纤维样组织组采用纤维样组织修复，比较两组不同组织修复效果。
结果与结论：①脱细胞基质组织工程材料交联后呈现为深蓝色，疏松多孔，直径为5 mm，硬度适中，具备一定的弹性；②苏木精-伊红染色不含有细胞碎屑及蓝染的核物质，不存在残留的细胞外基质；③甲苯胺蓝染色为蓝色材料支架孔隙率为90%，溶胀率为(1 314±337)%；④脱细胞基质组织组材料1，3，5，7，9 d的A值显著高于纤维样组织组(P < 0.05)；⑤兔纤维样组织组缺损明显，纤维瘢痕基本形成并充填在缺损中。脱细胞基质组织组修复12周后缺损部位存在白色组织覆盖，表面光滑，缺损面基本修复，与正常组织边界不明显。甲苯甘蓝染色显示蓝染，细胞细小变平，软骨下骨骨结构与软骨连接良好，直接基本降解；⑥结果提示：脱细胞基质组织工程材料具有良好的生物相容性、细胞吸附性以及亲水性而在骨关节软骨损伤修复中得到应用，能促进损伤部位的修复效果，是一种适用于骨关节软骨损伤的修复材料。

ORCID: 0000-0002-0003-0264(赵玉果)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 细胞基质, 骨关节软骨损伤, 修复, 纤维样组织

Abstract:

BACKGROUND: It has been reported that tissue-engineered acellular matrix can induce and promote epithelial cells and smooth muscle cells to evolve into a part of body in vivo compared with the normal extracellular matrix.
OBJECTIVE: To investigate the effect of tissue-engineered acellular matrix in articular cartilage repair.
METHODS: Totally 30 New Zealand rabbits were randomly allotted to fibroid tissue and acellular matrix groups (n=15 per group), and then articular cartilage defect models, 4 mm in diameter, were established at the white rabbit femoral condyle. Acellular cartilage matrix scaffold was prepared using bovine knee cartilage, and model rats in the acellular matrix group were repaired with acellular cartilage matrix scaffold and the others in the fibroid tissue group repaired with fibroid tissues. Finally, repair effects between two groups were compared.
RESULTS AND CONCLUSION: The dark blue and porous tissue-engineered acellular matrix material could be found, with a diameter of 5 mm and moderate hardness, and exhibited certain flexibility after cross-linking. Hematoxylin-eosin staining showed that cell debris, blue-stained nuclear materials and residual extracellular matrix disappeared. Toluidine blue staining found that the porosity of the blue scaffold was 90%, and the swelling ratio was (1 314±337)%. The absorbance value in the acellular matrix group was significantly higher than that in the fibroid tissue group at 1, 3, 5, 7 and 9 days (P < 0.05). In the fibroid tissue group, defects filled with newborn fibrous scars were overt. By contrast, in the acellular matrix group, the white tissues covered the defect region with smooth surface, and the wound was basically healed, with an unclear boundary after 12 weeks. Moreover, blue-stained, small flattened cells appeared, subchondral bone structure was connected well with the cartilage, and the scaffold was directly degraded. In conclusion, the tissue-engineered acellular matrix material exhibits good biocompatibility, cell adsorption and hydrophilicity, and can promote the defect repair after articular cartilage injury. Therefore, it is a suitable substitute for articular cartilage repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone, Cartilage, Articular, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

赵玉果，李明明. 脱细胞基质材料制备方法及在骨关节软骨损伤修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5051-5056.

Zhao Yu-guo, Li Ming-ming. Tissue-engineered acellular matrix material: preparation and application in articular cartilage repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(34): 5051-5056.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰大白兔30只，实验过程中途无脱落，全部进入结果分析。

2.2 脱细胞基质组织工程材料大体观察脱细胞基质组织工程材料交联后呈现为深蓝色，疏松多孔，直径为5 mm，硬度适中，具备一定的弹性，见图1。

2.3 脱细胞基质组织工程材料组织学观察苏木精-伊红染色下脱细胞基质组织工程材料相互连接成网，软骨细胞消失，软骨巢不清晰，但是脱细胞基质组织工程材料中不含有细胞碎屑及蓝染的核物质，不存在残留的细胞外基质。甲苯胺蓝染色为蓝色，见图2。

2.4 脱细胞基质组织工程材料理化性能检测脱细胞基质组织工程材料支架孔隙率为90%，溶胀率为 (1 314±337)%。

2.5 两组支架材料A值比较脱细胞基质组织组材料1，3，5，7，9 d 的A值显著高于纤维样组织组(P < 0.05)，见表1。提示：脱细胞基质组织组材料中脱细胞基质浓度较高。

2.6 两组大白兔骨关节软骨缺损的修复大体观察两组大白兔术后1 d均可以站立，3 d后正常行走，手术伤口均未发生感染，愈合良好，两组大白兔术后动物正常饮食，并未发生手术不良反应。

2.7 大白兔骨关节缺损修复12周后组织学观察纤维样组织组兔缺损明显，纤维瘢痕基本形成并充填在缺损中。脱细胞基质组织组修复12周后缺损部位存在白色组织覆盖，表面光滑，缺损面基本修复，与正常组织边界不明显，见图3A。甲苯甘蓝染色显示蓝染，细胞细小变平，软骨下骨骨结构与软骨连接良好，直接基本降解，见图3B。

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引言

创伤、骨性关节炎等均为临床上常见的骨科疾病，这种疾病发病率较高，诱因也相对较多，且多数患者损伤后伴有软骨下骨的缺损，缺损如果得不到及时有效的修复，将会诱发其他疾病，严重者甚至导致关节功能的丧失^[1-2] 。目前，临床上对于骨关节软骨缺损尚缺乏理想的修复方法，常用的修复方法尚存在一定的局限性，自体移植是目前最理想的修材料，但是该方法受到来源的限制、取骨软骨处受到进一步损伤，增加患者痛苦，而对于异体或异种移植则容易产生免疫排斥反应等^[3-4] 。研究结果显示：组织脱细胞基质与正常细胞外基质相比能够在机体内诱导上皮细胞、平滑肌细胞^[5-6] ，从而促进其演化为机体的一部分。目前，临床上对于脱细胞处理的真皮、心包、角膜等作为相应组织替代物已经取得了阶段性进展^[7-8] 。
组织工程学是一门新兴的学科，它主要是利用细胞生物学、生物材料学以及工程学原理，开发应用于修复或改善机体缺损器官结构、功能替代物的学科^[9-10] 。组织工程在修复过程中其三大要素包括种子细胞、支架材料以及生长因子等，并且三者相辅相成，融会贯通，融合了工程学、生命科学等原理和理论^[11] 。支架材料在构建组织工程软骨时，材料的性能在一定程度上影响细胞的生物学特性及细胞增殖能力，从而影响植入物及受体效果^[12-13] 。目前，临床上对于细胞基质组织工程材料制备方法及其性能以及在骨关节软骨损伤中的效果尚缺乏研究。因此，临床上研究细胞基质材料在骨关节软骨损伤修复中的效果能为提高临床治愈率提供依据^[14-15] 。
文章研究细胞基质组织工程材料制备方法及其性能，探讨细胞基质组织工程材料在骨关节软骨损伤修复中的应用效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计动物对照性分析。

1.2 时间及地点于2014年11月至2015年11月在郑州大学第一附属医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：30只新西兰大白兔，体质量为1.60- 2.49 kg，平均(1.73±0.26) kg，雌雄随机，由郑州大学附属医院动物实验中心提供。饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为豫饲审(2008) 01095。对新西兰大白兔进行等条件喂养，对动物处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[16-17]。将30只新西兰大白兔采用随机对照方法将新西兰大白兔分为纤维样组织组和脱细胞基质组织组，每组15只。

1.4 实验方法

1.4.1 软骨脱细胞基质支架的制备将牛膝关节软骨(郑州大学第一附属医院实验室提供)进行反复冲洗，并放粉碎机中进行粉碎，然后放入pH 7.5、温度为4 ℃无菌PBS中浸泡，离心5 min，速度2 000 r/min，去除沉淀。将上层软骨碎片再次进行5 min离心，速度为8 000 r/min，筛选出直径在100-154 μm的软骨粒，根据改进的Courtman改良法进行脱细胞处理^[18-19]。①向获得的软骨粒中加入含浓度为0.25%胰蛋白酶和0.03%EDTA的PBS，震荡1 h，离心3次，速度为7 000 r/min，采用PBS进行冲洗^[20]。②在4 ℃下加入浓度为1%的Triton X-100及10 mmol/L的Tris-HCl(pH=7.5)和浓度为0.035%的PMSF，震荡24-72 h，离心后采用PBS冲洗^[21-22]。③在37 ℃下放入浓度为50 U/mLDNA 酶及1 U/mL RNA 酶，消化12 h，离心后采用PBS冲洗^[23]。④在温度4 ℃下加入浓度为1%的Triton X-100 的10 mmol/L的Tris-HCl (pH=7.5)，震荡24 h、冲洗后获得白色粉末状沉淀。将其放入磨具中，冷冻、烘干后获得三维多孔支架材料。将获得的材料进行冲洗、冷冻、消毒后备用^[24-25]。

1.4.2 脱细胞基质组织工程材料组织学观察 ①苏木精-伊红染色：将细胞接种在培养皿内24 mm×24 mm的盖玻片上，添加软骨培养基和成骨培养基，诱导24 h。取盖玻片，PNS漂洗2次，采用苏木精染核10 min，采用流水浸洗2 min。滴加苏木精染色5 min后，流水浸洗1 min，依次放置在乙醇、二甲苯中脱水、透明，采用中性树胶封固。②甲苯胺蓝染色：取盖玻片，PBS冲洗2次，滴加浓度为1%甲苯胺蓝溶液5 min，流水浸洗 1 min，浸入5 min丙酮溶液中，流水浸洗1 min，吹干后根据二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ顺序分别进行2 min透明，采用中性树胶封固。

1.4.3 脱细胞基质组织工程材料理化性能检测 ①孔隙率：将支架材料采用浓度为3.0%戊二醛进行24 h固定，将其放置在扫描电镜下观察，观察后选取3个视野，每个视野测量10个孔径，测定孔隙率。②溶胀率：将支架浸在双氧水中24 h，滤纸吸干表面水分称质量1次，记为m_w，冻干取出后称质量1次，记为m_d，溶胀率= (m_w-m_d)/m_d×100.0%。

1.4.4 新西兰大白兔建模及处理方法将入选新西兰大白兔均采用体积分数为3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾。大白兔仰卧固定在手术台上，在膝关节内侧作为手术切口，逐层切开皮肤、皮下及关节囊，保证大白兔膝关节屈曲达到70°，充分暴露股骨髁的位置，采用消毒后的骨钻在大白兔股骨髁部位制作一个直接为4 mm的骨髓腔全层缺损，建立新西兰大白兔骨关节软骨损伤模型^[26]。采用无菌纱布止血后纤维样组织组采用纤维样组织(郑州大学第一附属医院实验室提供)修复，脱细胞基质组织组采用脱细胞软骨基质支架修复。大白兔手术完毕后采用小针缝线进行固定，并将多所有动物逐层缝合颈前组织和皮肤，并经过耳缘静脉注射160×10⁴U青霉素^[27-28]。

1.4.5 两组材料吸光度(A值)比较取脱细胞基质组织组和纤维样组织组支架材料采用二甲基雅兰法带正电染料结合，产生颜色，利用紫外分光光度计检测，在 480 nm波长下检测A值。

1.5 主要观察指标 ①脱细胞基质组织工程材料大体情况；②脱细胞基质组织工程材料组织学观察；③脱细胞基质组织工程材料理化性能；④两组支架材料A值比较；⑤兔骨关节缺损修复12周后大体和组织学观察。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理搜集的数据，计数资料行卡方检验，采用n(%)表示，计量资料行 t 检验，采用x(_)±s表示，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

支架材料是组织工程中常见的修复方法，患者修复过程中不仅会会影响修复体生物学特性，还会对生长增殖能力产生影响。理想的支架应该具备以下特性：①良好的生物相容性^[29-30]。植入支架材料具备降解性，对机体无毒副作用，不会对其他组织产生免疫排斥反应。②生物可溶性^[31]。植入的支架材料需要具备与组织细胞再生速度相同的降解速度。③生物相容性好^[32]。支架材料具有多孔结构特性，孔隙率为85%以上，能够为种子细胞的生长提供足够的空间^[33-34]。此次研究中，脱细胞基质组织工程材料支架孔隙率为90%，溶胀率为(1 314± 337)%。④植入材料具备一定的可塑性和机械强度。⑤具有承载生长因子能力。

脱细胞基质是近年来研究较多的一种生物学材料，该材料具有低抗原性、良好的生物相容性、细胞吸附性等优点^[35]。脱细胞基质和人工材料相比具有其独特的优势，这种材料十分适合种子细胞的生长^[36]。为了达到组织工程应用所要求的参数，天然材料需要在使用前进行交联，交联后能有效的提高生物材料的抗降解能力，最大限度的保留生物相容性特点。研究中，苏木精-伊红染色下脱细胞基质组织工程材料相互连接成网，软骨细胞消失，软骨巢不清晰，但是脱细胞基质组织工程材料中不含有细胞碎屑及蓝染的核物质，不存在残留的细胞外基质^[37-38]。甲苯胺蓝染色为蓝色。支架不仅需要具备良好的生物相容性，能够促进生长组织生长，为细胞提供三维空间结构，具备一定的增殖分化能力。研究中，通过透析法将牛骨形态发生蛋白有效的复合到脱细胞软骨基质支架后，由于牛骨形态发生蛋白的强大的促进细胞增殖作用，能在支架生长旺盛，很短的时间内形成覆盖在支架表面，促进骨缺损部位的修复，提高支架的生物活性^[39]。研究实验组修复12周后缺损部位存在白色组织覆盖，与正常组织边界不明显。甲苯甘蓝染色显示蓝染，细胞细小变平，软骨下骨骨结构与软骨连接良好，直接基本降解。由此看出：脱细胞基质组织工程材料在骨关节软骨损伤修复中的临床效果^[40]。研究中两组大白兔术后1 d均可以站立，3 d后正常行走，手术伤口均未发生感染。

综上所述，脱细胞基质组织工程材料具有良好的生物相容性、细胞吸附性以及亲水性，而在骨关节软骨损伤修复中得到应用，能促进损伤部位的修复效果，是一种适用于骨关节软骨损伤的修复材料，具有较高的临床应用价值。

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